Saggio del proteasoma degradazione in un sistema di libero-Cell nelle piante

Riepilogo

Degradazione delle proteine ​​mirata rappresenta un importante meccanismo di regolazione per la funzione delle cellule. Essa si verifica attraverso una via ubiquitina-proteasoma conservati, che attribuisce catene polyubiquitin alla proteina bersaglio che poi servire "tag" molecolari per il proteasoma 26S. Qui, descriviamo un saggio semplice e affidabile senza cellula per proteasoma degradazione delle proteine.

Abstract

Il pathway ubiquitina-proteasoma per la degradazione delle proteine ​​è emerso come uno dei meccanismi più importanti per la regolazione di un ampio spettro di funzioni cellulari in quasi tutti gli organismi eucarioti. In particolare, nelle piante, il sistema proteasoma ubiquitin/26S (UPS) regola la degradazione delle proteine ​​e contribuisce significativamente allo sviluppo di una vasta gamma di processi, compresa la risposta immunitaria, lo sviluppo e la morte cellulare programmata. Inoltre, sempre più evidenze suggeriscono che numerosi agenti patogeni delle piante, quali Agrobacterium, sfruttano l'UPS di accoglienza per l'infezione efficiente, sottolineando l'importanza della continuità nelle interazioni pianta-patogeno.

La specificità di substrato della UPS è raggiunto dalla ubiquitina ligasi E3 che agisce di concerto con la E1 e E2 ligasi di riconoscere e marcare molecole proteiche specifici destinati a degradazione da dandole catene di molecole di ubiquitina. Una classe delle ligasi E3 è la SCF (Skp1 / Cproteina Ullin / F-box) complessa, che riconosce specificamente i substrati UPS e obiettivi per l'ubiquitinazione attraverso la sua componente proteica F-box. Per studiare il ruolo potenziale di UPS in un processo biologico di interesse, è importante mettere a punto un saggio semplice e affidabile per degradazione proteica UPS-mediata. Qui, descriviamo un tale saggio usando un sistema acellulare pianta. Questo test può essere adattato per lo studio dei ruoli di degradazione delle proteine ​​regolamentato in diversi processi cellulari, con un focus particolare sulle interazioni proteina-substrato F-box.

Introduzione

Il proteasoma percorso ubiquitin/26S sta emergendo come un meccanismo diffuso per il controllo di diverse reazioni biologiche, tra cui regolazione trascrizionale, la progressione del ciclo cellulare e trasduzione del segnale, recettori down-regulation o endocitosi, tra gli altri processi ^1-4. In questo percorso, la proteina bersaglio viene etichettato da ubiquitina residui che vengono prima collegati tramite un legame thiolester to-ubiquitina attivando l'enzima E1 e poi traslocato a un residuo di acido cisteina amino ubiquitina-coniugazione enzima E2, infine, E2 interagisce con ubiquitina ligasi E3 , con conseguente polyubiquitination del substrato proteico. In definitiva, le proteine ​​polyubiquitinated sono riconosciuti e degradati dal proteasoma 26S. In questo meccanismo, l'enzima E3 specifica il substrato e funge da elemento regolatore chiave del sistema proteasoma ubiquitin/26S (UPS). Ligasi E3 possono agire in modo indipendente, come ligases dominio RING, o come parte di un SCF multisubunit (S) complesso proteico kp1/Cullin/F-box, come ad esempio F-box ligases dominio. SCF-mediate vie di degradazione del proteasoma sono coinvolti nella regolazione della trascrizione, ciclo cellulare, la trasduzione del segnale ^5-10 e molte altre importanti funzioni cellulari.

Oltre a questi ruoli critici nella regolazione dei processi cellulari, UPS prende il palco centrale in molte interazioni pianta-patogeno. Ad esempio, una crescente evidenza suggerisce che diversi agenti patogeni delle piante, tra cui Agrobacterium tumefaciens, si basano su l'UPS host per per facilitare il processo di infezione ^11. Agrobacterium provoca escrescenze neoplastiche sulle piante, che rappresentano i suoi ospiti naturali, e può anche trasformare una vasta gamma di altri eucarioti, da funghi ^1,2 a cellule umane ^12,13. Durante la sua infezione, Agrobacterium esporta un elemento DNA (T-DNA) e vari virulenza (vir) proteine ​​nella cellula ospite ^12-13. Una di queste proteine ​​è VirF, la prima proteina F-box trovatiessere codificati da un genoma procariotico ^14. Come parte del complesso SCF ubiquitina ligasi, VirF, e il suo omologo ospitante funzionale VBF ^15, facilitare infezione Agrobacterium tramite la degradazione delle proteine ​​UPS-mediata, che facilita presumibilmente uncoating del invadere batterica T-DNA dalle proteine ​​batteriche e ospitanti accompagnamento, VirE2 e VIP1 rispettivamente ^16,17. È interessante notare che molte proteine ​​F-box, tra cui VirF, sono intrinsecamente instabili a causa della loro proteolisi, che è mediata da attività autoubiquitination ^18,19 o da altri ligasi E3 per i quali le proteine ​​F-box possono fungere da substrati ^20-23.

Quando si studia attività biochimiche delle proteine ​​F-box, altri ligasi ubiquitina, e / o le loro substrati, sarebbe molto utile un test semplice e affidabile per la degradazione del proteasoma. Qui si descrive un tale protocollo per analizzare la stabilità della proteina in una cellula-Libero Sistema. In questo saggio, la stabilità del substrato UPS viene analizzato in presenza o assenza di uno dei componenti essenziali del percorso di degradazione proteasoma, come una proteina F-box, in un sistema acellulare. In generale, esprimiamo la proteina (s) testato in tessuti vegetali, preparare estratti privi di cellule di questi tessuti e monitorare la quantità di proteina (s) di interesse mediante western blotting. Il meccanismo UPS-dipendente di degradazione proteica è dimostrata dalla inclusione di inibitori del proteasoma specifici e / o tramite coespressione di forma dominante negativa di un componente SCF, Cullin. Considerando che illustriamo questo dosaggio utilizzando proteasoma degradazione della proteina Arabidopsis VIP1 ¹⁷ dalla proteina F-box VBF ^15, può essere impiegato per studiare la stabilità di eventuali altri substrati del proteasoma.

Protocollo

1. Espressione della proteina

1. Scelta del sistema di espressione
   Selezionare il sistema, cioè, vettori e vettore metodo di consegna, più adatto per l'espressione della proteina di interesse nella organismo modello / cella specifica. Si noti che il nostro test richiede l'espressione delle proteine ​​testate in quantità facilmente rintracciabile, che è meglio ottenere con la trasformazione temporanea di un gran numero di cellule. Nelle piante, per esempio, questo è migliore, utilizzare plasmidi binari come vettori di espressione e Agrobacterium come sistema di consegna.
2. Costruzione di vettori di espressione binari
   Clonare la sequenza codificante (s) della proteina (s) di interesse in un vettore di espressione da soli o in fusione traslazionale di un epitopo. Uso vettori adatti per il sistema di espressione scelto e procedure di biologia molecolare standard per la clonazione del gene. Per la consegna del gene mediata da Agrobacterium, impiegare vettori binari e far loro conoscere, utilizzando anche Standaprotocolli rd, in un ceppo Agrobacterium, come EHA105, per la successiva inoculazione di tessuti vegetali.
3. La scelta delle specie vegetali
   Selezionare le specie vegetali in cui verrà espressa la proteina (s) di interesse. Si noti che, mentre è possibile usare qualsiasi specie di piante sensibili alla trasformazione genetica mediata da Agrobacterium, la nostra specie vegetali di scelta è Nicotiana benthamiana, che è facilmente coltivata, altamente suscettibile Agrobacterium, e ha foglie grandi che sono facilmente inoculati.
4. La crescita delle piante
   Crescere un impianto da 4 a 6 settimane in una pentola con Pro-Mix BX in una pentola (20 centimetri x 20 centimetri x 20 cm) in condizioni eco-controllati (es. camera di crescita) di giorno lungo (cioè 16 h 130 -150 μE m-2 s-1 luce a 23 ° C e 8 h al buio a 20 ° C) e 40-65% di umidità relativa.
   1.5.2 Concimazione tanto in tanto con i prodotti disponibili in commercio per le istruzioni del produttore. Una volta che la pianta viene coltivata, selezionarefoglie con le dimensioni di 50 mm x 70 mm o più grandi (queste misure di lunghezza non includono il picciolo) per Agrobacterium inoculazione.
5. Inoculazione con Agrobacterium
   Crescere ceppo Agrobacterium ospitare il costrutto binario esprimente la proteina (s) testato dal punto 1.3 notte a 28 ° C in mezzo YEP (1% peptone, estratto di lievito 1%, e 0,5% NaCl) supplementato con antibiotici appropriati (per esempio, 100 mg / L streptomicina e 10 mg / L rifampicina per vettori basati pPZP-RSC2 ^24-25).
   1.6.2 Centrifugare le cellule, risospese a OD ₆₀₀ = 0.5 in tampone infiltrazione [10 mM MgCl _2, 10 Mes mM (pH 5,6), 100 mM acetosyringone], e incubare per 2 ore a temperatura ambiente. Infiltrarsi nella cultura nel lato abaxial di una foglia, utilizzando una siringa senz'ago 1-mL; notare che le foglie vengono inoculati in situ, mentre è attaccato alla pianta.
   1.6.3 Dopo l'infiltrazione, coltivare la pianta per 72 ore sotto il regime luce di 16 h 130-150 &# 181, E m-2 s-1 luce a 23 ° C / 8 h al buio a 20 ° C prima della raccolta.
6. Applicazione di inibitori del proteasoma
   Per sostenere l'idea che la proteina (s) testato è degradato attraverso una via del proteasoma, utilizzare specifici inibitori del proteasoma MG132 e lactacistina ^28-29, che dovrebbe ridurre o addirittura bloccare il degrado. Quattro ore prima della raccolta (cfr. punto 2.1), infiltrarsi nelle zone foglia Agrobacterium-inoculati con 10 pM MG132 (EMD Millipore) o 10 micron lactacistina (Sigma-Aldrich) o mock-trattare la foglia con le rispettive solventi, cioè lo 0,1% DMSO o acqua distillata.

2. Preparazione di estratti cell-free

1. Leaf raccolta
   Raccogliere le zone inoculati della foglia, di solito ca. 200-400 mg di peso fresco, e li macinare in polvere fine in azoto liquido. In alternativa, bead-battere i tessuti, utilizzando qualsiasi bead-beater (ad esempio, Biospec) o amalgamator dentale (ad esempio, TPC avanzata Technologies) direttamente nel buffer di degradazione (cfr. punto 2.2).
2. Estrazione delle proteine
   Preparare l'estratto proteico totale posizionando il tessuto macinato in 500 ml di tampone degradazione [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 100 mM, 10 mM MgCl _2, 5 mM DTT, adenosina 5 mM 5'-trifosfato, e inibitore della proteasi 1x cocktail (Sigma-Aldrich)]. Si noti che il cocktail di inibitori delle proteasi colpisce principalmente serina, cisteina, aspartico, e metalloproteasi e non interferisce con la proteasi 26S. Chiarire l'estratto da due centrifugazioni sequenziali a 12.000 xg per 5 min.
3. Reazione di degradazione delle proteine
   Trasferire volumi uguali di estratti, di solito 20 microlitri, per microcentrifuga tubi e incubare a temperatura ambiente per periodi di tempo crescente. Tipicamente, il tempo di campionamento pari a zero, e 5, 10, 15, 20, e 30 min punti temporali. Smettere di reazioni facendo bollire in SDS tampone di gel-sample, e analizzarli mediante western blotting.

jove_title "> 3. Rilevamento degradazione della proteina mediante immunoblotting

1. Elettroforesi su gel
   3.1.1 risolvere i campioni di proteine ​​mediante elettroforesi su gel di SDS-poliacrilammide e electrotransfer le proteine ​​deliberato di una membrana di nitrocellulosa secondo il protocollo standard ^30.
   3.1.2 Determinare concentrazione proteica utilizzando il metodo di Bradford (Bio-Rad), e caricare 50-80 mg di proteine ​​totali per corsia. Assicurarsi che tutti i campioni sono stati caricati allo stesso modo. Per i controlli di carico, confrontare le intensità di una specie di proteine ​​ubiquitarie, come putativo Rubisco grandi catene che migrano come una band importante con una mobilità elettroforetica relativa di circa 50 kDa, possono essere rilevati Coomassie gel-blu macchiato o Ponceau S-o fluorescente SYPRO Ruby-tinto membrane di nitrocellulosa.
2. Blocco
   Bloccare la membrana con 5% di latte scremato in TBST (10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4) per 1 ora a temperatura ambiente.
3. Anticorpo primario
   Diluire anticorpo anti-epitopo primario in 1% di latte scremato in TBST alla concentrazione raccomandato dal produttore e incubare con la membrana bloccata per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C con agitazione.
4. Risciacquo
   Sciacquare la membrana viene sciacquato con 20 ml TBST per 15 minuti una volta e due volte per 5 minuti a temperatura ambiente con agitazione.
5. Anticorpo secondario
   Diluire anticorpo secondario (ad esempio IgG anti-coniglio) coniugato con perossidasi di rafano (HRP) in 1% di latte scremato in TBST come raccomandato dal fabbricante e incubare con la membrana per 1 ora a temperatura ambiente con agitazione.
6. Rivelazione
   Sciacquare nuovamente la membrana come descritto al punto 3.4. Dopo il risciacquo finale in TBST, visualizzare le proteine ​​di interesse, con un substrato chemiluminescente HRP, più comunemente utilizzando un kit ECL.

Risultati

Figura 1, adattato da Zaltsman et al. ^17, illustra esperimenti rappresentativi per il rilevamento di degradazione del proteasoma in un sistema acellulare. In particolare, dimostriamo destabilizzazione di un impianto destinato alla difesa proteina VIP1 dalla proteina F-box VBF attraverso la via SCF ^VBF in N. benthamiana. Arabidopsis VBF e VIP1 (HA-VIP1) proteine ​​HA-tagged stati transitoriamente coespressi, e HA-VIP1 proteina contenuto all...

Discussione

Questo test si basa sulla espressione delle proteine ​​testati in tessuti vegetali, quindi, il potenziale processo di degradazione proteasoma avviene ovviamente già all'interno dei tessuti viventi. Abbiamo protein assay destabilizzazione, tuttavia, solo negli estratti, con il tempo di campionamento di zero che serve come punto di riferimento iniziale. Quindi, definiamo come un saggio privo di cellule.

Un aspetto importante per il successo di questo test è la corretta scelta del vet...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protein assay kit	Bio-Rad	500-0001
Proteinase inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	S8820
Mini-Protean system	Bio-Rad	165-8000
Semi-dry western blotting SD electrotransfer system	Bio-Rad	170-3940
Affinity Purified Rabbit Anti-Ha	ICL Lab	RHGT-45A-Z
Goat anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate	Thermo Scientific	31460
BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane	Pall Corporation	27377-000
Immobilon western chemiluminescent HRP substrate	EMD Millipore	WBKL S0 050
MG132	EMD Millipore	474790-1MG
Lactacystin	Sigma-Aldrich	L6785
Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate	Pierce	35055