식물의 셀없는 시스템에서 프로 테오 저하 시금

요약

표적 단백질 분해는 세포 기능의 주요 조절기구를 나타낸다. 그런 다음 26S 프로 테아 좀에 대해 같은 분자 "태그"봉사하는 표적 단백질에 polyubiquitin 체인을 부착 보존 유비퀴틴 - 프로 테아 좀 경로를 통해 발생합니다. 여기, 우리는 단백질의 프로 테오 저하에 대한 간단하고 신뢰할 수있는 세포가없는 분석을 설명합니다.

초록

단백질 분해에 대한 유비퀴틴 - 프로 테아 좀 경로는 거의 모든 진핵 생물의 세포 기능의 다양한 스펙트럼의 규제를위한 가장 중요한 메커니즘 중 하나로 떠오르고있다. 구체적으로, 식물에서, 프로 테아 좀의 ubiquitin/26S 시스템 (UPS)의 단백질 분해를 조절하고 면역 반응, 개발 및 프로그래밍 된 세포 사멸을 포함한 공정의 넓은 범위의 발전에 크게 기여한다. 또한, 증가하는 증거는 아그로 박테 리움 등 다양한 식물 병원균, 식물 병원균 상호 작용에있는 UPS의 중요성을 강조하고, 효율적인 감염 호스트 UPS를 이용하는 것이 좋습니다.

UPS의 기질 특이성은 E1과 협력 작용 및 E2가 그들에게 유비퀴틴 분자 체인을 부착하여 열화로 향하는 특정 단백질 분자를 인식하고 표시하는 리가 제 E3 유비퀴틴 리가 제에 의해 달성된다. E3의 리가 제의 하나의 클래스가 SCF입니다 (Skp1 / C특히 UPS 기판을 인식하고 자사의 F-박스 단백질 구성 요소를 통해 유비퀴틴을 위해 그 (것)들을 대상으로 율린 / F 상자 단백질) 복잡한. 그 생물학적 과정에서 UPS의 잠재적 인 역할을 조사하기 위해, UPS 매개 단백질 분해에 대한 간단하고 신뢰할 수있는 분석을 고안하는 것이 중요합니다. 여기, 우리는 식물 세포가없는 시스템을 사용하여 하나의 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 F-박스 단백질 기판의 상호 작용에 특별한 중점을두고, 다양한 세포 과정의 조절 단백질 분해의 역할의 연구에 적용 할 수 있습니다.

서문

ubiquitin/26S의 프로 테아 좀 경로는 다른 사람의 사이에서 전사 조절, 세포주기의 진행과 신호 전달 수용체 하향 조절 또는 엔도 시토 시스, ^1-4을 처리하는 등 다양한 생물학적 반응의 제어를위한 광범위한 메커니즘으로 부상하고있다. 이 경로에서, 목적 단백질은 제 유비퀴틴 활성화 효소 E1에 thiolester 결합을 통해 부착하고 유비퀴틴 접합 효소 E2의 시스테인 아미노산 잔기에 옭되는 잔기를 유비퀴틴로 태그되며 마지막으로, E2는 유비퀴틴 리가 제 E3와 상호 작용 , 단백질 기질의 polyubiquitination 결과. 궁극적으로, polyubiquitinated 단백질은 26S 프로 테아 좀에 의해 인식 저하된다. 이 메커니즘에서, E3 효소는 기질을 지정하고 ubiquitin/26S의 프로 테아 좀 시스템 (UPS)의 주요 구성 요소를 규정하는 역할을한다. E3 리가 제의 예 RING 도메인 리가 제로서, 또는 multisubunit의 SCF (S의 일부로서 역할을 할 수 독립적이러한 F-상자 도메인 리가 제와 같은 kp1/Cullin/F-box 단백질) 복잡한. SCF-매개 프로 테오 분해 경로는 전사, 세포주기, 신호 전달 ^5-10 많은 다른 주요 세포 기능의 조절에 관여하고 있습니다.

세포 과정의 조절에 이러한 중요한 역할 외에, UPS는 많은 식물 병원균 상호 작용에 중앙 무대 걸립니다. 예를 들어, 증거가 증가하고 아그로 박테 리움 튜메 파시 엔스 등 여러 가지 식물 병원균, 감염 과정 ^(11)를 용이하게하기위한 호스트 UPS에 의존하는 것이 좋습니다. 아그로 박테 리움은 자연의 호스트를 나타내는 식물에 종양 성장을 이끌어, 또한 인간의 세포 ^{(12, 13)에} 곰팡이 ^1,2에서, 다른 진핵 생물의 넓은 범위를 변환 할 수 있습니다. 그 감염시, 아그로 박테 리움은 숙주 세포 ^12-13으로 DNA 요소 (T-DNA) 및 여러 독성 (비르) 단백질을 보냅니다. 이러한 단백질 중 하나는 VirF, 발견 된 첫 번째 F-박스 단백질원핵 유전체 ^(14)에 의해 부호화된다. SCF 유비퀴틴 리가 아제 단지, VirF, 그 기능 호스트 상동 VBF ^(15)의 한 부분으로, 아마도 VirE2, 그 부속 세균 및 호스트 단백질에서 침입하는 세균의 T-DNA의 uncoating을 용이하게 UPS 매개 단백질 분해를 통해 아그로 박테 리움 감염을 촉진 및 VIP1 각각 ^{16, 17.} 흥미롭게도, VirF 등 많은 F-박스 단백질은, 때문에 autoubiquitination 활동 ^{18, 19} 또는 F-박스 단백질이 기판 ^20-23 역할을 할 수있는 다른 E3의 리가 제에 의해 매개되는 자신의 단백질 분해, 본질적으로 불안정하다.

F-박스 단백질, 다른 유비퀴틴 리가 제, 및 / 또는 기판의 생화학 활동을 연구 할 때, 프로 테오 저하위한 간단하고 신뢰성있는 분석을 사용하는 것이 매우 유용 할 것이다. 여기에서 우리는 세포의 단백질 안정성 분석을위한 하나의 프로토콜을 설명없는 시스템입니다. 이 분석에서, UPS 기판의 안정성은 무 세포계에서 이러한 F-박스 단백질로서 프로 테오 열화 통로의 필수 성분 중 하나의 존재 또는 부재 하에서 분석된다. 일반적으로, 우리는 이러한 조직에서 무 세포 추출물을 준비하고 웨스턴 블로 팅에 의해 관심의 단백질 (들)의 양을 모니터링, 식물 조직에서 테스트 된 단백질 (들)을 표현한다. 단백질 분해의 UPS 의존 메커니즘은 특정 프로 테오 좀 억제제 및 / 또는 SCF 성분 Cullin의 우성 음성 형태의 동시 발현을 사용의 포함에 의해 증명된다. 우리 VBF ¹⁵ F-박스 단백질에 의해 아라비돕시스 VIP1 ¹⁷ 단백질의 프로 테오 저하하여이 분석을 예시하는 반면, 그것은 임의의 다른 프로 테오 기판의 안정성을 조사하기 위하여 사용될 수있다.

프로토콜

1. 단백질 발현

1. 발현 시스템의 선택
   시스템, 즉, 벡터 및 특정 모델 생물 / 세포에 대한 관심의 단백질의 발현에 가장 적합한 벡터 전달 방법을 선택합니다. 우리의 분석에 가장 세포의 많은 수의 일시적 변화에 의해 달성된다 쉽게 검출 가능한 양의 시험 단백질의 발현을 필요로합니다. 식물에서, 예를 들어, 이는 유용한 전달 시스템과 같은 발현 벡터 및 아그로 이진 플라스미드를 사용하여 달성된다.
2. 바이너리 발현 벡터의 구축
   에피토프 태그에 단독으로 또는 번역 융합 하나를 발현 벡터에 관심의 단백질 (들)의 코딩 서열 (들)을 복제합니다. 사용은 선택 발현 시스템 및 유전자 복제에 대한 표준 분자 생물학 절차에 적합한 벡터. 아그로 박테 리움 매개 유전자 전달을 위해, standa를 사용하여도, 이진 벡터를 고용하고 그들을 소개식물 조직의 후속 접종 등 EHA105으로 아그로 박테 리움 균주로 RD 프로토콜.
3. 식물 종의 선택
   관심의 단백질 (들)로 표현 될 수있는 식물 종을 선택합니다. 아그로 박테 리움 매개 유전자 변형의 영향을 모든 식물 종은 사용할 수 있지만, 그주의, 선택의 우리의 식물 종은 쉽게 아그로 박테 리움에 매우 취약, 성장 된 담배 benthamiana이며, 쉽게 접종 큰 잎을 가지고 있습니다.
4. 식물 성장
   긴 하루의 환경 통제 된 조건 (예를 들면, 성장 챔버) (130) (즉, 16 시간에서 냄비 (20cm가 X 20cm X 20cm)의 프로 믹스 BX와 함께 냄비에 4 주에서 6 주 동안 수행되는 하나의 식물을 성장 23 ° C에서 -150 μE m-2 S-1 등, 20 ° C에서 8 시간의 어두운)와 40-65% 상대 습도.
   때때로 제조업체의 지침에 따라 상용 제품과 1.5.2 비료. 식물이 성장하면, 선택아그로 박테 리움 접종 50 X 70mm mm 또는 더 큰 크기 (이 길이 측정은 잎자루를 포함하지 않는다)를 남긴다.
5. 아그로 박테 리움 접종
   / 적절한 항생제 (예를 들어, 100 mg의 보충 YEP 배지에서 28 ° C (1 % 펩톤 1 % 효모 추출물, 0.5 %의 NaCl)에서 하룻밤 단계 1.3에서 테스트 단백질 (들)을 표현하는 이진 구조를 숨겨 아그로 박테 리움 균주를 성장 L 스트렙토 마이신과 pPZP-RSC2 기반 벡터 ^{24 ~ 25)} 10 ㎎ / L의 리팜피신.
   [10 mM의 MgCl2를 _2, 10 MM의 메스 (산도 5.6), 100 μM 아세토 시린 곤] 침투 버퍼 = 0.5 ₍₆₀₀₎ OD, 실온에서 2 시간 동안 배양 재현 탁 1.6.2 원심 분리기 세포. 1 ML의 바늘없는 주사기를 사용하여 잎의 배축면에 문화를 침투, 공장에 연결되어있는 동안 잎이, 현장에서 접종 있습니다.
   1.6.3 침투 한 후, 16 시간 130-150 &의 빛 정권 하에서 72 시간 동안 식물을 성장# 181;에서 E m-2 S-1 등 23 ° 수확하기 전에 20 ° C에서 C / 8 시간의 어둠.
6. 프로 테오 좀 억제제의 적용
   테스트 단백질 (들)은 프로 테오 경로를 통해 분해되는 개념을 지원하기 위해, 감소 또는 저하를 차단해야하는 특정 프로 테오 좀 억제제 MG132을 사용하여 ^{28 ~ 29을} lactacystin. 네 시간 (2.1 단계 참조) 수확하기 전에, 10 μM MG132 (EMD 밀리 포어) 또는 10 μM의 lactacystin (시그마 - 알드리치) 또는과 아그로 박테 리움 접종 잎의 영역을 침투 각각의 용매, 즉, 0.1 % DMSO와 잎을 모의 치료 또는 증류수.

2. 무 세포 추출물의 제조

1. 잎 수확
   잎의 접종 장소, 일반적으로 CA를 수확. 200-400 신선한 무게 ㎎, 액체 질소의 미세 분말로 그들을 갈기. 또한, 모든 비드 비터 (예를 들어, Biospec) 또는 치과 된 amalgamator (예를 들어, TPC 고급을 사용하여 조직을 비드 이길 직접 분해 버퍼 기술) () 2.2 단계를 참조하십시오.
2. 단백질 추출
   분해 버퍼 500 μL에 지상 조직을 배치하여 총 단백질 추출물을 준비 [50mM의 트리스 - HCL (산도 7.5), 100 mM의 NaCl을, 10 mM의 MgCl2를 _2, 5 mM의 DTT, 5 MM의 아데노신 5'-인산, 및 1X 프로테아제 억제제 칵테일 (시그마 - 알드리치)]. 프로테아제 억제제 칵테일은 주로 세린, 시스테인, 아스파라긴산, 그리고 메탈로 영향을 미치는 26S 프로 테아을 방해하지 않습니다. 5 분 12,000 XG에서 두 개의 연속 centrifugations하여 추출물을 명확히.
3. 단백질 분해 반응
   튜브의 미세 시간의 증가 된 기간 동안 실온에서이를 배양, 추출, 보통 20 μL 같은 부피를 전송합니다. 일반적으로, 샘플 시간 제로 및 5, 10, 15, 20, 그리고 30 분 시간 지점. SDS 젤 샘플 버퍼에 끓여 반응을 중지하고 서부 블롯을 분석 할 수 있습니다.

jove_title "> 3. 면역 블 롯팅에 의해 단백질 분해 검출

1. 겔 전기 영동
   3.1.1 SDS-폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동하여 단백질 시료를 해결하고 표준 프로토콜 ^30에 따라 니트로 셀룰로오스 막에 단백질을 해결 electrotransfer.
   3.1.2 브래드 포드 방법 (바이오 래드)를 사용하여 단백질 농도를 결정하고, 레인 당 총 단백질의 50 ~ 80 μg을로드합니다. 모든 샘플이 동일하게로드되어 있는지 확인합니다. 컨트롤을로드를 들어, 약 50 kDa의 상대 전기 이동성과 주요 밴드로 마이그레이션 추정 RuBisCo 대형 체인 등 유비쿼터스 단백질 종의 농도를 비교, 그들은 쿠마시 블루 염색 젤 또는 개양귀비 빛의 S-또는 감지 할 수 있습니다 형광 SYPRO 니트로 셀룰로오스 막 루비 스테인드.
2. 블로킹
   실온에서 1 시간 동안 TBST에서 5 % 탈지 우유 (10 mM 트리스 - 염산, 140 mM의 염화나트륨, 0.05 % 트윈 20, pH 7.4의)으로 멤브레인을 차단.
3. 차 항체
   제조업체에서 권장하는 농도로 TBST 1 % 탈지 우유에 기본 안티 - 항원 항체를 희석하고 교반과 함께 4 º C에서 실온에서 1 시간 동안이나 밤새 차단 막과 부화.
4. 세정
   막 한 번 15 분 동안 20 ㎖의 TBST에 린스 린스, 두 번 부드러운 교반과 함께 실온에서 5 분.
5. 이차 항체
   제조업체에서 권장하는 TBST 1 % 탈지 우유에 말 무 퍼 옥시 데이즈 (HRP)가 결합 이차 항체 (예를 들어, 안티 - 토끼 IgG의)를 희석하고 부드러운 교반과 함께 실온에서 1 시간 동안 막에 품어.
6. 검출
   단계 3.4에 설명 된대로 다시 멤브레인을 씻어. TBST에서 최종 헹굼 후, 가장 일반적으로 ECL 키트를 사용하여, HRP를 화학 발광 기질과 관심 단백질을 가시화.

결과

Zaltsman 등. ^17에서 적응 그림 1은 세포가없는 시스템에서 프로 테오 저하의 검출을위한 대표적인 실험을 보여줍니다. 특히, 우리는 N.의 SCF ^{VBF 경로를} 통해 VBF F-박스 단백질에 의한 식물 방어 관련 단백질 VIP1의 불안정을 보여 benthamiana. 애기 VBF 및 HA-태그 VIP1 (HA-VIP1) 단백질을 일시적으로 동시 발현하고, 표현 잎의 추출물 내의 HA-VIP1 콘?...

토론

이 분석은 식물 조직에서 시험 단백질의 발현에 의존하고, 따라서, 잠재적 인 프로 테오 분해 과정은 분명히 생체 조직 내에서 이미 발생한다. 우리는 제로 샘플은 초기 기준점으로서의 시간만을 추출한 그러나 단백질 불안정화를 분석 실험. 따라서, 우리는 세포가없는 분석으로 정의합니다.

이 분석의 성공에 대한 한 가지 중요한 측면은 시험 단백질 (들)이 생성 될 것이다?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protein assay kit	Bio-Rad	500-0001
Proteinase inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	S8820
Mini-Protean system	Bio-Rad	165-8000
Semi-dry western blotting SD electrotransfer system	Bio-Rad	170-3940
Affinity Purified Rabbit Anti-Ha	ICL Lab	RHGT-45A-Z
Goat anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate	Thermo Scientific	31460
BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane	Pall Corporation	27377-000
Immobilon western chemiluminescent HRP substrate	EMD Millipore	WBKL S0 050
MG132	EMD Millipore	474790-1MG
Lactacystin	Sigma-Aldrich	L6785
Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate	Pierce	35055