RNAscope pour<em&gt; In situ</em&gt; Détection des actifs de transcription virus du papillome humain dans la tête et du cou carcinome spinocellulaire

Résumé

La présence de VPH à risque élevé dans le tissu tumoral tête et du cou est associé à des résultats favorables. L'ARN a récemment mis au point une technique d'hybridation in situ appelé RNAscope permet la visualisation directe de l'ARNm E6/E7 de HPV dans des coupes de tissu FFPE.

Résumé

Le «gold standard» pour la détection du VPH oncogène est la démonstration de la transcription actif VPH à risque élevé dans le tissu tumoral. Cependant, la détection de l'ARNm E6/E7 par transcription inverse quantitative en chaîne par polymérase (qRT-PCR) nécessite l'extraction d'ARN qui détruit contexte tissulaire de la tumeur critique pour la corrélation morphologique et a été difficile à adopter dans la pratique clinique de routine. Notre ARN récemment développé une technologie d'hybridation in situ, RNAscope dans, permet la visualisation directe de l'ARN dans fixés au formol, inclus en paraffine (FFPE) tissu avec une sensibilité de la molécule unique et de la résolution d'une seule cellule, ce qui permet très sensible et spécifique dans l'analyse in situ d'un biomarqueur de l'ARN dans les échantillons cliniques de routine. Le test HPV RNAscope a été conçu pour détecter l'ARNm E6/E7 de sept génotypes de HPV à haut risque (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52, et 58) en utilisant un ensemble de sondes spécifiques de génotype. Il a démontré une excellente sensibilitéet la spécificité contre la méthode actuelle de «gold standard» de détection de l'ARNm E6/E7 par qRT-PCR. statut de HPV déterminé par RNAscope est fortement pronostique des résultats cliniques chez les patients atteints d'un cancer de l'oropharynx.

Introduction

Comptes papillomavirus humain à haut risque (HR-VPH) pour environ 5% de tous les cancers dans le monde ^1. L'incidence de cancer de l'oropharynx associés au HPV a augmenté au cours des dernières décennies, surtout chez les hommes. oropharyngée carcinome épidermoïde de HPV-positif (OPSCC) constituera probablement une majorité de tous les cancers de la tête et du cou aux États-Unis au cours des 20 prochaines années ^2. Carcinomes épidermoïdes de l'oropharynx causées par le VPH sont associés à la survie favorable, et le statut de VPH de la tumeur est un facteur pronostique fort et indépendant pour la survie ^3.

Preuve de l'activation transcriptionnelle des oncogènes viraux E6 et E7 est considéré comme l'étalon-or pour la présence du VPH cliniquement pertinente ^4. Cependant, la détection de l'ARNm E6/E7 du tissu tumoral frais par la technique RT-PCR n'est pas pratique, dans la pratique clinique de routine et est limitée à des laboratoires de recherche. Récemment, nous VHAe a développé une technologie ARN ISH roman intitulé RNAscope, qui permet une détection multiplex dans des cellules individuelles avec une seule molécule d'ARN sensibilité des spécimens formol de paraffine fixe embarqués de tissus (FFPE) ^5-10. Nous avons fourni trois sources de données pour la détection de molécule unique ^5. Tout d'abord, la conception et le signal système d'amplification de la sonde RNAscope permis la détection de copie unique HER2 cibles d'ADN génomique dans les cellules HeLa et SK-BR-3 lignées cellulaires. En second lieu, lorsqu'on les compare avec des signaux d'ADN génomique HER2, la distribution des intensités de fluorescence de HER2 ARNm points de signaux dans les cellules HeLa était compatible avec une molécule par point. Troisièmement, le nombre de points d'ARNm de HER2 de signal par cellule adaptée étroitement le nombre de copies d'ARNm de HER2 estimée par un essai de quantification à base de solution, supportant en outre une détection de molécule unique. En outre, une contre-coloration des noyaux avec DAPI en microscopie à fluorescence ou à l'hématoxyline en microscopie à champ lumineux permet de visualiser les différents noyaux, which à son tour permet la détection et la quantification de cibles d'ARN sur une base à cellule unique ^10. La capacité d'analyser l'expression des gènes in situ dans des échantillons cliniques de routine RNAscope fait une plate-forme prometteuse pour la pathologie diagnostique, en particulier les analyses basées sur des sections de tissus FFPE ^10,11. Nous avons mis au point un test de VPH à base RNAscope pour détecter l'ARNm E6/E7 de sept génotypes VPH à risque élevé (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52, et 58) à l'aide d'un pool de sondes spécifiques de génotype. Nos récentes études OPSCC ont montré que le test HPV est RNAscope très sensible et spécifique pour déterminer le statut de VPH sur les tissus FFPE ^12-17, et informe également le pronostic dans OPSCC ^12,16.

Le principe de la technologie RNAscope a été décrit précédemment ^5. Ici, nous décrivons le protocole complet d'analyse de RNAscope et démontrer son utilisation dans la détection des HPV dans les sections de tissus tumoraux FFPE.

Protocole

Une. Échantillon, équipements et Préparation des réactifs

1. Couper échantillon de tissu en blocs de 3-4 mm d'épaisseur, fixer à 10% de formol tamponné frais pour 16-32 heures à température ambiante (25 ° C) et de l'intégrer dans de la paraffine. Couper FFPE en sections de 5 ± 1 um d'épaisseur à partir de blocs FFPE, monter les coupes sur des lames et l'air sec. Remarque: Les lames peuvent être stockées à température ambiante sous une dessiccation pendant jusqu'à 3 mois. Les lames de tissus montés doivent être cuits dans un sèche-dessus à 60 ° C pendant 1 h avant l'essai RNAscope.
2. Apportez hybridation Four à 40 ° C. Placez un papier d'humidification dans le contrôle de l'humidité du bac. Ajouter 50 ml dH ₂ O au Livre d'humidification pour mouiller complètement. Insérez le plateau couvert dans le four à préchauffer pendant au moins 30 min avant utilisation.
3. Faire 700 ml 1x Prétraitez 2 Solution (10 nl, tampon pH 6 citrate) par dilution 10x solution de prétraitement dans dH ₂ O. Chauffer le 2 Solution 1x Pré-traiter à ébullition et maintain la température entre 100-104 ° C, tout en empêchant au cours d'ébullition.
4. Assurez-3 L 1x Wash Buffer (0,1 x SSC) en diluant préchauffé 50x tampon de lavage en DH ₂ O.
5. Préparer 2 x 200 ml de xylene et 2 x 200 ml d'EtOH à 100% pour le déparaffinage sous une hotte de laboratoire.
6. Préparer solution à 50% de coloration hématoxyline et réactif de bleuissement (0,01% de l'eau ammoniacale) pour le post-coloration sous une hotte.
7. Préparer 200 ml de xylène, 200 ml de 70% et 2 x 200 ml d'EtOH à 100% pour la déshydratation sous une hotte de laboratoire.
8. Sondes Préchauffer cibles à 40 ° C pendant 10 min et apportent détection RTU réactif du kit à température ambiante, y compris RTU Amp1, Amp2, Amp3, AMP4, Amp 5-Brown, et AMP6-Brown, à l'exception chromogène DAB Brown-A et Brown-B .

2. RNAscope Assay

Déparaffinage et déshydratation

Après la cuisson, Déparaffiner les coupes de tissus dans le xylène pour 2 x 5 min en agitant fréquemment, et déshydraterdans EtOH à 100% pour 2 x 3 min en agitant fréquemment. Séchage pendant 5 min et dessiner une barrière hydrophobe autour de la section de tissu avec une barrière hydrophobe Pen.

Prétraitements

1. Incuber les coupes de tissu avec une Pré-traiter pendant 10 min à température ambiante pendant la trempe de l'activité de la peroxydase endogène, les rincer à dH ₂ O.
2. Incuber les coupes de tissu avec Prétraitement deux maintenus à une température d'ébullition pendant 15 minutes pour l'extraction de l'ARN, rincer deux fois dans dH ₂ O.
3. Incuber les coupes de tissus avec Prétraitez 3 pendant 30 min à 40 ° C pour la digestion des protéines dans HybEZ four, rincer deux fois dans dH ₂ O.

Cible hybridation de la sonde

sondes cibles HPV-HR 7 piscine comprennent: HPV16, 18, 31, 33, 35, 52, et 58. Ajouter sondes HPV, ubiquitine C (UBC) et bactériennes sondes dapB gène séparément sur trois sections de tissus de manière adjacente. S'hybride à 40 ° C en étuve pendant 2h, puis rincer dans du tampon de lavage 1x pour 2 x 2 min à température ambiante.

Amplification du signal

1. Incuber les coupes de tissu avec Amp1 (préamplificateur) pendant 30 min à 40 ° C, Amp2 (fond réducteur) pendant 15 min à 40 ° C, Amp3 (amplificateur) pendant 30 min à 40 ° C, et AMP4 (sonde marqueur) pendant 15 min à 40 ° C dans un four HybEZ. Après chaque étape d'hybridation, rincer dans du tampon de lavage 1x pour 2 x 2 min à température ambiante.
2. Incuber les coupes de tissu avec AMP5 pendant 30 min et AMP6 pendant 15 min à RT. Après chaque étape d'incubation, dans un tampon de rinçage pour lavage de 1x 2 x 2 min à température ambiante.

Détection du signal

Incuber les coupes de tissu avec DAB Mélange 01:01 en mélangeant un volume égal de Brown-A et-B Brown pendant 10 min à température ambiante, laver deux fois dans dH ₂ O.

La contre-coloration

coupes de tissus de coloration avec une solution de 50% d'hématoxyline pendant 2 min à température ambiante, laver avec dH ₂ O jusqu'à ce que les lames sont claires tandis que le tissu reste violet. Tremper les lames en 0,01% d'ammoniac dans dH ₂ O pour 5x et suivie avec 5 immersions dans dH ₂ O.

Glisser montage

Déshydrater les coupes de tissu dans 70%, 100% et 100% de EtOH pendant 2 min chacun, le xylene pendant 5 min, monter avec un milieu de montage à base de xylène.

Résultats

RNAscope HPV test flux de travail

Le dosage RNAscope a un flux de travail très simplifié qui est similaire à l'IHC (figure 1). Il se compose de quatre grandes étapes: prétraitement, hybridation, amplifications de signal et de détection. Elle emploie une stratégie de conception de la sonde unique qui assure une haute fidélité amplification du signal ^5. Dans le dosage RNAscope HPV, les sept ensembles de sondes HR-HPV sont mis en commun, tous reconnus par le même système d'amplification de signal lié à la peroxydase de raifort (HRP). Des signaux d'hybridation spécifiques sont détectées sous forme de précipités bruns formés par réaction catalysée par la HRP chromogène DAB en utilisant comme substrat, qui peut être aisément visualisée par microscopie à fond clair standard.

Coloration Représentant pour la détection du VPH

La figure 2 montre des exemples d'images de sections FFPE colorées de la tête et du cou carcinome épidermoïde. Dans le cas de HPV-positif (figureure 2A), les sondes HR-HPV détecté des signaux de fortes ponctuées spécifiquement dans les cellules tumorales. La sonde UBC détectée nombreux signaux cytoplasmiques ponctuées dans les deux cellules tumorales et des cellules stromales (Figure 2B). La sonde de dapB gène bactérien a démontré un fond propre (figure 2C). Dans le cas de HPV-négatif, à la fois la sonde HR-HPV et la sonde dapB détecté aucun signal (figures 2D et 2F), tandis que les signaux forts ont été détectés par la sonde UBC (figure 2E). Dans ce dosage, UBC sert de contrôle positif pour évaluer la qualité de l'ARN des tissus et dapB comme contrôle négatif pour les signaux de fond. La notation pour la détermination du statut de HPV consiste à examiner tous les trois diapositives pour chaque cas. Le niveau de coloration sur le coulisseau de commande négative (dapB) de glissement est utilisé comme seuil: HPV positivité est défini par la présence d'cytoplasmique ponctuées et / ou une coloration nucléaire qui était au-dessus du signal sur le coulisseau dabpB.

Figure 1. Organigramme de test RNAscope. Illustration de RNAscope essai workflow. Le dosage RNAscope contient 4 étapes principales, prétraitements, sonde cible hybridation, l'amplification du signal et la détection du signal. La totalité de l'expérience peut être complétée en 8 h. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 2. images Exemple de diapositives RNAscope colorées sections FFPE colorées avec des sondes pour HR-HPV, UBC (contrôle positif) et dapB (contrôle négatif).à partir de deux cas de HNSCC. AC. cas de HPV-positif. A, HR-HPV expression de l'ARNm E6/E7 dans les cellules tumorales. Encart, un grossissement de 40X à montrer des signaux de ponctuées. B et C) des coupes de tissus adjacents montrant une coloration positive de UBC (B) et négatif pour dapB (C), respectivement. DF) HPV-négatif cas. D) aucune coloration pour le VPH ARNm E6/E7 , similaire au contrôle négatif dapB (F). E) UBC coloration positive. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Discussion

Le test HPV RNAscope permis la visualisation directe de l'ARNm E6/E7 in situ dans la tête associées au VPH et le cou carcinome épidermoïde. Le dosage RNAscope est entièrement compatible avec les tissus tumoraux couramment fixe et conserve la morphologie des tissus pour les corrélations histopathologiques (figure 2). Un avantage clé de l'essai de RNAscope par rapport aux méthodes classiques de CISH est qu'il amplifie spécifiquement les signaux d'hybridation (figures 2B et 2E), sans amplifier le bruit de fond (figures 2C et 2F).

Dans la pratique, la procédure de dosage RNAscope VPH peut être achevée dans un délai de 8 heures ou idéalement répartie sur deux jours. Le test HPV RNAscope a été utilisée pour déterminer le statut de HPV dans la tête et le cou carcinome spinocellulaire ^12-16, démontrant 97% de sensibilité et 93% de spécificité en utilisant qRT-PCR comme méthode de référence ^16. Chr classiqueISH omogenic pour HR HPV-ADN est très spécifique mais a une sensibilité de 80% ~ ^12. Immunohistochimique (IHC) pour la coloration cellulaire de substitution marqueur p16 montre une excellente sensibilité mais peut générer des résultats faussement positifs, en particulier dans ^15,18 cancers ORL nonoropharyngeal ^15. La méthode actuelle de «l'étalon or» de qRT-PCR pour le HPV ARNm E6/E7 détection nécessite tissu frais congelé pour des résultats optimaux et est techniquement complexe, ce qui limite son utilisation au laboratoire de recherche uniquement. En outre, il nécessite une extraction de l'ARN qui fait qu'il est impossible de corréler l'expression HR-HPV avec de l'ARNm E6/E7 histopathologie.

Il ya plusieurs facteurs critiques pour le succès de l'essai RNAscope. Tout d'abord, pour de meilleurs résultats, les tissus doivent être fixés dans du formol 10% neutre tamponné frais à la température ambiante pendant 16-32 heures selon les directives ASCO / CAP ^19. Deuxièmement, le four HybEZ est fortement recommandé car il permettres un contrôle optimal de la température et de l'humidité pour la sonde d'hybridation et de signaux étapes d'amplification. En troisième lieu, il est important d'éliminer tout excès de tampons résiduels avant chaque étape mais toujours garder la section de tissu de séchage au cours de l'une de ces étapes.

La procédure de RNAscope manuel décrit ici a été entièrement automatisé sur une lame système auto-coloration commerciale ^10. Cela devrait grandement faciliter la normalisation des conditions d'essai et d'économie de travail manuel précieux dans les laboratoires de pathologie clinique. En outre, le logiciel d'analyse d'images dédié a été développé ¹⁰ pour identifier automatiquement les cellules et les signaux de coloration sur une lame numérisée, qui devrait contribuer à éliminer la subjectivité et améliorer la reproductibilité dans la notation.

En résumé, le dosage RNAscope HPV détecte la présence de transcrits HR-HPV E6/E7 in situ d'ARNm dans les tissus FFPE. Il dispose d'un flux de travail qui est familier à la pathologie laboratoire cliniquetoires en permettant la visualisation directe de ceux-ci dans des coupes de tissus. Il dispose d'une plate-forme idéale pour l'examen (FFPE) des échantillons de tissus, et peut être facilement adopté par les laboratoires de pathologie de diagnostic.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
SuperFrost Plus slides	Fisher Scientific	12-550-15
HybEZ Oven, Tray, and Rack	Advanced Cell Diagnostics	310011, 310012, 310014
RNAscope 2.0 FFPE Reagent Kit - Brown	Advanced Cell Diagnostics	310035
RNAscope HPV-HR7 Probe for HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52, and 58, E6/E7 mRNA	Advanced Cell Diagnostics	312351
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratory	H-4000
100% EtOH	American Master Tech Scientific	ALREAGAL
Xylene	Fisher Scientific	X3P-1GAL
Gill's Hematoxylin I	American Master Tech Scientific	HXGHE1LT
Ammonia hydroxide	Sigma-Aldrich	320145-500mL
Cover Glass 24 mm x 50 mm	Fisher Scientific	12-545-F
Hot Plate	Fisher Scientific	11-300-49SHP
Drying Oven			Capable of holding temperature at 60±1 °C
Water Bath			Capable of holding temperature at 40±1 °C