RNAscope для<em&gt; В месте</em&gt; Обнаружение транскрипционно активны вируса папилломы человека в головы и шеи Плоскоклеточный рак

Резюме

Наличие ВПЧ высокого риска в головы и шеи опухолевой ткани связано с благоприятными результатами. Недавно разработанная РНК в технике гибридизация называется RNAscope позволяет прямой визуализации ВПЧ Е6/Е7 мРНК в секциях FFPE ткани.

Аннотация

«Золотым стандартом» для онкогенных обнаружения ВПЧ является демонстрация транскрипционно активного ВПЧ высокого риска в опухолевой ткани. Тем не менее, обнаружение Е6/Е7 мРНК с помощью количественной обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (Qrt-ПЦР) требует выделения РНК, которая разрушает контекст ткани опухоли решающее значение для морфологической корреляции и был трудно быть приняты в повседневной клинической практике. Наш недавно разработала РНК гибридизация технологии, RNAscope в, позволяет прямой визуализации РНК в фиксированных формалином, парафин (FFPE) ткани с чувствительностью одной молекулы и разрешения одной клетки, что позволяет высокую чувствительность и специфичность на месте анализа любого РНК биомаркеров в обычных клинических образцов. Анализ RNAscope ВПЧ был предназначен для обнаружения мРНК Е6/Е7 из семи высокого риска ВПЧ генотипов (ВПЧ 16, 18, 31, 33, 35, 52 и 58), используя пул генотипа конкретного зондов. Он продемонстрировал высокую чувствительностьи специфичность в отношении текущего метода 'золотой стандарт' обнаружения мРНК Е6/Е7 по Qrt-PCR. Статус ВПЧ определяется RNAscope сильно прогностическим из клинического исхода в ротоглотки больных раком.

Введение

Высокого риска вирусом папилломы человека (ВПЧ-ВР) инфекции составляет примерно 5% всех случаев рака во всем мире ^1. Заболеваемость ВПЧ-ассоциированных рака ротоглотки увеличилось в течение последних десятилетий, особенно среди мужчин. ВПЧ-положительных ротоглотки плоскоклеточный рак (OPSCC), скорее всего, составляют большинство всех головы и шеи рака в Соединенных Штатах в течение следующих 20 лет ^2. Ротоглоточные плоскоклеточный рак, вызванных ВПЧ связаны с благоприятной выживания, и статус опухоли ВПЧ является сильным и независимым прогностическим фактором для выживания ^3.

Доказательства активации транскрипции вирусных онкогенов Е6 и Е7 рассматривается как золотой стандарт для присутствии клинически значимых ВПЧ ^4. Однако обнаружение мРНК Е6/Е7 из свежей опухолевой ткани с помощью RT-PCR техники не практично в обычной клинической практике и была ограничена научно-исследовательских лабораторий. В последнее время мы ВГАэ разработали новый РНК ISH технологию RNAscope, что позволяет мультиплекс обнаружения в отдельных клетках с чувствительностью одной молекулы РНК в фиксированных формалином и залитых в парафин образцов ткани (FFPE) ^5-10. Мы предоставили три линии доказательств для обнаружения отдельных молекул ^5. Во-первых, дизайн и сигнал Системы звукоусиления RNAscope зонд позволило выявить одну копию HER2 геномных мишеней ДНК в HeLa и SK-BR-3 клеточных линий. Во-вторых, по сравнению с HER2 геномных ДНК сигналов, распределение флуоресцентных интенсивностей сигналов HER2 мРНК точек в клетках HeLa согласуется с одной молекулой в точку. В-третьих, количество HER2 мРНК сигнала точек на клетки соответствуют тесно количество HER2 мРНК копирования стоимости раствором на основе количественного анализа, что также подтверждает обнаружение одной молекуле. Кроме того, контрастного ядер с DAPI в флуоресцентной микроскопии или с гематоксилином в ярко-микроскопии позволяет визуализировать отдельных ядер, белыйич в свою очередь позволяет обнаружение и количественное определение РНК-мишеней на одноклеточных основе ^10. Умение анализировать экспрессию генов на месте в обычных клинических образцов делает RNAscope перспективной платформой для диагностики патологии, особенно те ​​FFPE ткани раздел основе анализов ^10,11. Мы разработали RNAscope основе ВПЧ анализа для обнаружения мРНК Е6/Е7 из семи высокого риска генотипов ВПЧ (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52 и 58) с использованием пул генотипа конкретного зондов. Наши недавние исследования в OPSCC показали, что анализ RNAscope ВПЧ является высокой чувствительностью и специфичностью в определении статуса ВПЧ на FFPE тканей ^12-17, а также информирует прогноз в OPSCC ^12,16.

Принцип технологии RNAscope было описано ранее ^5. Здесь мы описываем полный протокол RNAscope анализа и продемонстрировать его использование в обнаружении ВПЧ-ВР в FFPE секциях опухолевой ткани.

протокол

1. Образец, оборудование, и о подготовке реагентов

1. Cut образец ткани на блоки 3-4 мм в толщину, фиксируют в пресной 10% нейтральном забуференном формалине-за 16-32 ч при комнатной температуре (25 ° C) и вставить в парафин. Вырезать FFPE на секции толщиной 5 ± 1 мкм от FFPE блоков, смонтировать разделы, посвященные горками и высохнуть на воздухе. Примечание: Слайды можно хранить при комнатной температуре в атмосфере высыхания до 3 месяцев. Установленные горки ткани должны быть запеченный в сухом над при 60 ° С в течение 1 часа до анализа RNAscope.
2. Принесите гибридизации духовку до 40 ° С. Поставьте Увлажнение бумаги в лотке контроля влажности. Добавить 50 мл дН ₂ O в Увлажняющий бумаги мочить его полностью. Вставьте покрытый лоток в печь, чтобы prewarm по крайней мере 30 минут перед использованием.
3. Сделать 700 мл 1x предварительной обработки 2 Решение (10 NL, рН 6 цитрат буфер) путем разбавления 10x предварительной обработки раствора в дН ₂ O. Нагрейте 1x предварительной обработки 2 решение до кипения и почтаntain температуру между 100-104 ° С, не допуская чрезмерного кипения.
4. Сделать 3 L 1x промывочного раствора (0,1 x SSC) путем разбавления нагретого 50x промывочного буфера в дН ₂ O.
5. Подготовка 2 х 200 мл ксилола и 2 х 200 мл 100% этанола для депарафинизации в вытяжном шкафу.
6. Подготовка 50%-ный раствор окраска гематоксилином и расточительность реагента (0,01% водный раствор аммиака) для последующей окраски под вытяжкой.
7. Подготовка 200 мл ксилола, 200 мл 70% и 2 х 200 мл 100% этанола для обезвоживания в вытяжном шкафу.
8. Prewarm целям зонды при 40 ° С в течение 10 мин и приносят обнаружения RTU набора реагентов до комнатной температуры, в том числе RTU Amp1, AMP2, AMP3, AMP4, Amp 5-Браун, и АМР6-Браун, кроме DAB хромоген Brown-А и Brown-B .

2. RNAscope Анализ

Депарафинирование и обезвоживание

После выпечки deparaffinize срезах тканей в ксилоле в течение 2 х 5 мин при частом помешивании, и обезвоживаютв 100% EtOH в течение 2 х 3 мин при частом помешивании. Воздух сухой в течение 5 мин и нарисуйте гидрофобный барьер вокруг срез ткани с гидрофобный барьер Pen.

Предварительной обработки

1. Выдержите срезах тканей с предварительной обработки 1 в течение 10 мин при комнатной температуре для тушения эндогенного активности пероксидазы, промыть в дН ₂ O.
2. Инкубируйте срезов ткани с предварительной обработки 2 поддерживают при температуре кипения в течение 15 мин для извлечения РНК, промыть дважды в дН ₂ O.
3. Выдержите ткани секции с предварительной обработки 3 в течение 30 мин при 40 ° С в течение переваривания белков в HybEZ печи, промыть дважды в дН ₂ O.

Целевая зонд Гибридизация

Целевые HPV-зонды HR 7 бассейн включают: HPV16, 18, 31, 33, 35, 52 и 58. Добавить ВПЧ зондов, Убиквитин C (UBC) и бактериальных генов dapB зонды отдельно на три секции рядом тканей. Гибридизации при 40 ° С в духовке в течение 2ч, затем промыть в 1x промывочного буфера для 2 х 2 мин при комнатной температуре.

Усиление сигналов

1. Инкубируйте срезов ткани с Amp1 (предусилителя) в течение 30 мин при 40 ° С, Amp2 (фон редуктор) в течение 15 мин при 40 ° С, AMP3 (усилитель) в течение 30 мин при 40 ° С и AMP4 (метка зонд) в течение 15 мин при 40 ° С в HybEZ печи. После каждой стадии гибридизации, промыть в 1x промывочного буфера для 2 х 2 мин при комнатной температуре.
2. Инкубируйте срезов ткани с AMP5 в течение 30 мин и АМР6 в течение 15 мин при комнатной температуре. После каждой стадии инкубации промыть в 1x промывочного буфера для 2 х 2 мин при комнатной температуре.

Обнаружения сигнала

Инкубируйте срезов ткани с 1:01 DAB смеси путем смешивания равный объем Brown-А и Brown-B в течение 10 мин при комнатной температуре, промыть дважды в дН ₂ O.

Контрастного

Пятно срезы ткани с 50%-ным раствором гематоксилин в течение 2 мин при комнатной температуре, промыть дН ₂ O до горки не ясны, пока ткани остаются фиолетовый. Dip слайды в 0,01% аммиака в дН ₂ O для 5х и последовал с 5 провалов в дН ₂ O.

Презентация монтажа

Дегидрировать срезах тканей в 70%, 100% и 100% этанола в течение 2 мин каждый, ксилол в течение 5 мин, крепление с ксилола на основе монтажных СМИ.

Результаты

RNAscope ВПЧ анализ рабочего процесса

RNAscope анализ имеет весьма рационализировать рабочий процесс, который похож на IHC (рис. 1). Она состоит из четырех основных этапов: предварительная обработка, гибридизации, сигнальные Амплификации, и обнаружения. Он использует уникальный дизайн стратегию зонда, что обеспечивает высокую точность усиление сигнала ^5. В анализе RNAscope HPV, семь HR-HPV зондов наборы объединяют, все признана той же системе амплификации сигнала, связанного с пероксидазой хрена (HRP). Конкретные сигнала гибридизации обнаружен как коричневый осадок, образованные HRP катализируемой реакции с использованием хромогенного DAB в качестве субстрата, который может быть легко визуализировать с помощью стандартного светлом поле микроскопа.

Представитель окрашивание для обнаружения ВПЧ

На рисунке 2 показан пример изображения из цветного FFPE разделах головы и шеи плоскоклеточный рак. В ВПЧ-положительных случае (рис.Юр 2А), в HR-HPV зонды обнаружены сильные сигналы точечные специально в опухолевых клетках. UBC зонд обнаружены многочисленные точечные цитоплазматические сигналов в обоих опухолевых клеток и стромальных клеток (фиг. 2b). Бактериальным геном dapB зонд продемонстрировали чистый фон (рис. 2в). В случае ВПЧ-отрицательных, как зонд ВПЧ-ВР и зонд dapB не обнаружили сигналы (Цифры 2D и 2F), в то время как сильные сигналы были обнаружены с помощью зонда UBC (Рисунок 2E). В этом анализе UBC служит в качестве положительного контроля для оценки качества тканей РНК и dapB в качестве отрицательного контроля для фоновых сигналов. Счет в матче на определении статуса ВПЧ включает изучение всех трех слайды для каждого конкретного случая. Уровень окрашивание на отрицательной контрольной слайда (dapB) слайд используется в качестве отсечки: HPV положительность определяется наличием точечной цитоплазматической и / или атомной окрашивания, которая была выше сигнала на слайде dabpB.

Рисунок 1. Блок-схема RNAscope анализа. Иллюстрация RNAscope анализа рабочего процесса. RNAscope анализ содержит 4 основных шагов, предварительной обработки, цель зонда гибридизации, усиление сигнала и обнаружение сигнала. Вся процедура анализа может быть завершена в 8 часов. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 2. Пример изображения RNAscope окрашенных слайды. FFPE срезах, окрашенных зондов для ВПЧ-ВР, UBC (положительный контроль) и dapB (отрицательный контроль)от двух случаях ПРГШ. переменного тока. ВПЧ-положительных случай. , ВПЧ-ВР Е6/Е7 экспрессии мРНК в клетках опухоли. Вставка, 40-кратном увеличении, чтобы показать точечные сигналы. В и С) смежные секции ткани не показывая положительный UBC окрашивание (В) и отрицательным для dapB (С), соответственно. DF) ВПЧ-негативных случай. D) не окрашивание на ВПЧ Е6/Е7 мРНК , похож на отрицательного контроля dapB (F). Е) UBC положительное окрашивание. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Обсуждение

Анализ RNAscope ВПЧ позволила прямой визуализации Е6/Е7 мРНК на месте в ВПЧ-ассоциированных головы и шеи плоскоклеточный рак. RNAscope анализ полностью совместим с фиксированной регулярно опухолевой ткани и сохраняет ткани морфологию для гистопатологическими корреляций (рис. 2). Ключевым преимуществом RNAscope анализа по сравнению с традиционными методами CISH том, что он специально усиливает сигналов гибридизации (рис. 2В и 2E) без усиления фонового шума (рис. 2C и 2F).

На практике процедура анализа RNAscope ВПЧ может быть завершена в течение 8 ч или удобно разделить в течение двух дней. Анализ RNAscope HPV был использован для определения состояния HPV в головы и шеи плоскоклеточного рака ^12-16, демонстрируя 97% чувствительность и 93% специфичность с использованием Qrt-ПЦР в качестве опорного метода ^16. Обычные CHRomogenic ISH для HR-ДНК ВПЧ обладает высокой специфичностью, но имеет чувствительность ~ 80% ^12. Иммуногистохимический (IHC) окрашивание на клеточном суррогатным маркером p16 демонстрирует превосходную чувствительность, но может генерировать ложные положительные результаты ^15,18, особенно в nonoropharyngeal головы и шеи рака ^15. Текущий метод "золотым стандартом" Qrt-ПЦР для HPV Е6/Е7 обнаружения мРНК требуется свежезамороженной ткани для достижения оптимальных результатов и является технически сложной, что ограничивает его применение только научно-исследовательской лаборатории. Кроме того, он требует экстракции РНК что делает невозможным соотнести выражение HR-HPV мРНК Е6/Е7 с гистопатологией.

Есть несколько важных факторов для успеха анализа RNAscope. Во-первых, для получения лучших результатов, ткани должны быть зафиксированы в свежем 10% нейтральном забуференном формалине при комнатной температуре в течение 16-32 ч в соответствии с ASCO / CAP принципов ^19. Во-вторых, печь HybEZ настоятельно рекомендуется, так как это позволиты оптимальное управление температурой и влажностью для гибридизации зонда и стадий амплификации сигнала. В-третьих, важно, чтобы удалить лишние остаточные буферы перед каждым шагом, но по-прежнему держать срезы ткани от высыхания во время любой из этих шагов.

Ручная процедура RNAscope описано здесь был полностью автоматизирован на слайд системы коммерческого авто-окрашивания ^10. Это должно значительно облегчить стандартизацию условий анализа и экономя драгоценное ручного труда в клинических лабораториях патологии. Кроме того, программное обеспечение, предназначенное для анализа изображений была разработана ¹⁰ для автоматической идентификации клеток и окрашивания сигналы на цифровом слайд, который должен помочь устранить субъективность и улучшить воспроизводимость в выигрыше.

Таким образом, анализ RNAscope ВПЧ обнаруживает присутствие ВПЧ-ВР Е6/Е7 транскриптов мРНК на месте в FFPE тканей. Он имеет рабочий процесс, знакомый клинической патологии лабораторнойтории по позволяя непосредственно визуализацию их в срезах тканей. Он предлагает идеальную платформу для изучения (FFPE) образцов ткани, и может быть легко принят диагностических лабораториях патологии.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
SuperFrost Plus slides	Fisher Scientific	12-550-15
HybEZ Oven, Tray, and Rack	Advanced Cell Diagnostics	310011, 310012, 310014
RNAscope 2.0 FFPE Reagent Kit - Brown	Advanced Cell Diagnostics	310035
RNAscope HPV-HR7 Probe for HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52, and 58, E6/E7 mRNA	Advanced Cell Diagnostics	312351
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratory	H-4000
100% EtOH	American Master Tech Scientific	ALREAGAL
Xylene	Fisher Scientific	X3P-1GAL
Gill's Hematoxylin I	American Master Tech Scientific	HXGHE1LT
Ammonia hydroxide	Sigma-Aldrich	320145-500mL
Cover Glass 24 mm x 50 mm	Fisher Scientific	12-545-F
Hot Plate	Fisher Scientific	11-300-49SHP
Drying Oven			Capable of holding temperature at 60±1 °C
Water Bath			Capable of holding temperature at 40±1 °C