에 RNAscope<em&gt; 현장에서</em&gt; 헤드 전사적으로 활동 인간 Papillomavirus의 탐지와 목 편평​​ 상피 세포 암

요약

머리와 목의 종양 조직에서 고위험 HPV의 존재는 유리한 결과와 관련이 있습니다. RNAscope라는 현장 하이브리드 기술에서 최근에 개발 된 RNA는 FFPE 조직 섹션에서 HPV E6/E7 mRNA를 직접 시각화 할 수 있습니다.

초록

종양 HPV 검출을위한 '황금 표준'은 종양 조직에서 전사적으로 활성화 고위험 HPV의 데모입니다. 그러나, 정량 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (QRT-PCR)에 의해 E6/E7 mRNA의 검출은 형태학의 상관에 대한 종양 조직 컨텍스트 임계 파괴하고 일상적인 임상에서 채택 될 어려웠다 RNA 추출을 필요로한다. 현장 하이브리드 기술, RNAscope 우리의 최근에 개발 된 RNA는 단일 분자 감도 및 RNA 바이오 마커의 현장 분석에 매우 민감하고 특정 할 수 단일 셀 해상도와 포르말린 고정, 파라핀 - 임베디드 (FFPE) 조직에서 RNA를 직접 시각화를 허용 일상적인 임상 표본. RNAscope HPV의 유전자형 분석은 특정 프로브의 풀을 사용하여 E6/E7 일곱 고위험 HPV의 유전자형의 mRNA (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52, 58)를 감지하도록 설계되었습니다. 그것은 우수한 감도를 보여 주었다와 QRT-PCR에 의해 E6/E7 mRNA를 검출 현재 '황금 표준'방법에 대한 특이성. RNAscope에 의해 결정 HPV 상태는 구강 인두 암 환자의 임상 적 결과의 강력한 예후입니다.

서문

전 세계적으로 ¹ 모든 암의 약 5 %에 대한 위험이 높은 사람 유두종 바이러스 (HR-HPV) 감염 계정. HPV 관련 인두 암의 발병률은 특히 남성들, 지난 수십 년 동안 증가하고 있습니다. HPV 양성 구강 인두 편평 상피 세포 암 (OPSCC)의 가능성이 향후 20 년간 ² 년에 미국에있는 머리와 목 암의 대부분을 구성합니다. HPV에 의해 발생 구인두 편평 상피 세포 암이 유리한 생존과 연관된 종양 HPV 상태는 생존 ^3에 대한 강력하고 독립적 인 예후 인자됩니다.

바이러스 종양 유전자 E6와 E7의 전사 활성에 대한 증거는 임상 적으로 관련된 HPV ^4의 존재에 대한 황금 표준으로 간주된다. 그러나, RT-PCR 기법으로 신선한 종양 조직에서 E6/E7 mRNA의 검출은 일상 임상에서 실용적이지와 연구 실험실에 국한되었다. 최근에, 우리는 근래전자는 포르말린 고정 파라핀 조직 표본 (FFPE) ^5-10 단일 RNA 분자 감도 개별 세포에서 다중 검출 할 수 RNAscope라는 새로운 RNA의 ISH 기술을 개발했다. 우리는 단일 분자 검출 ^5에 대한 증거의 세 가지 라인을 제공했다. 첫째, RNAscope 프로브 설계 및 신호 증폭 시스템은 헬라와 SK-BR-3 세포주의 단일 복사본 HER2 게놈 DNA 표적의 탐지를 허용했다. HER2 게놈 DNA 신호와 비교할 때 둘째, HeLa 세포에서 HER2 mRNA의 신호 점의 형광 농도의 분포는 도트 당 하나의 분자와 일치했다. 셋째, 셀당 HER2 mRNA의 신호 점들의 수는 상기 단일 분자 검출을 지원하는 밀접 용액 기반의 정량 분석​​에 의해 추정 된 HER2 mRNA의 카피 수를 일치. 또한, 형광 현미경이나 시야 현미경 헤 마톡 실린과 DAPI로 핵의 counterstaining는 뭐, 개별 핵의 시각화를 할 수 있습니다ICH 차례로 단일 셀 단위 ^(10)에 검출 및 RNA 표적을 정량화한다. 일상적인 임상 표본 현장에서 유전자 발현을 분석 할 수있는 능력은 특히 FFPE 조직 섹션 기반의 분석 ^{10, 11,} RNAscope 진단 병리를위한 유망한 플랫폼 있습니다. 우리는 유전자형 특정 프로브의 풀을 사용하여 일곱 고위험 HPV의 유전자형 (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52, 58)의 E6/E7 mRNA를 검출하는 RNAscope 기반 HPV 분석을 개발했습니다. OPSCC 우리의 최근의 연구는 RNAscope HPV 분석이 FFPE 조직 ^12-17에 HPV 상태를 결정하는 매우 민감하고 특정이며, 또한 OPSCC ^{(12, 16)에서} 예후를 알려 것으로 나타났습니다.

RNAscope 기술의 원리는 이전에 ^5를 설명 하였다. 여기, 우리는 완전한 RNAscope 분석 프로토콜을 설명하고 FFPE 종양 조직 섹션에서 HR-HPV의 검출에있는 그것의 사용을 보여줍니다.

프로토콜

1. 샘플, 장비 및 시약 준비

1. 실내 온도 (25 ° C)에서 16-32 시간 동안 신선한 10 % 중성 포르말린에 고정하고 파라핀에 포함, 두께 3 ~ 4 ㎜의 블록으로 조직 표본을 잘라. FFPE 블록에서 5 ± 1 μm의 두께 섹션으로 FFPE 컷, 슬라이드 및 공기 건조에 섹션을 탑재합니다. 참고 : 슬라이드 최대 3 개월 동안 건조하에 실온에서 저장 될 수있다. 탑재 된 조직 슬라이드는 이전 RNAscope 분석에 1 시간 동안 60 ° C에서 이상 건조에 구운해야합니다.
2. 40 ° C.에 하이브리드 오븐을 가지고 습도 제어 트레이에 가습 용지를 넣습니다. 완전히 젖은 가습 용지에 50 ㎖ Dh를 ₂ O를 추가합니다. 사용하기 전에 적어도 30 분 동안 prewarm에 오븐에 덮여 트레​​이를 삽입합니다.
3. 확인 700 ㎖의 1X 전처리 dH보다 ₂ O.에서 10 배 전처리 솔루션을 희석하여 2 솔루션 (10 NL, pH가 6 구연산 버퍼) 1X 전처리 2 끓여 솔루션과 마이 열오버 비등 방지하면서 100 ~ 104 ° C 사이의 온도를 ntain.
4. dH보다 ₂ O.에서 데워진 50 배 세척 버퍼를 희석하여 3 L 1X 세척 버퍼 (0.1X의 SSC)를 확인
5. 흄 후드 탈 파라핀에 2 × 200 자일 렌 ㎖ 및 100 %의 EtOH 2 × 200 ㎖를 준비합니다.
6. 흄 후드 후 염색을 위해 50 % 헤 마톡 염색 용액과 블루 잉 시약 (0.01 % 암모니아수)를 준비합니다.
7. 흄 후드 탈수 자일 렌 200 ㎖, 200 ㎖의 70 %, 2 × 200 ㎖의 100 %의 EtOH를 준비합니다.
8. 10 분 동안 40 ° C 및 DAB 원체 브라운과 브라운-B를 제외하고, RTU AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, 앰프 5 - 브라운, 그리고 Amp6 - 브라운을 포함하여, 실온으로 RTU 검출에게 키트 시약을 가지고 Prewarm 대상 프로브 .

2. RNAscope 분석

탈 파라핀 및 탈수

베이킹 후, 자주 교반과 함께 2 × 5 분 자일 렌의 조직 섹션을 deparaffinize 및 탈수자주 교반과 함께 2 × 3 분 동안 100 %의 EtOH에. 에어 5 분 동안 건조하고 소수성 장벽 펜 조직 섹션 주위에 소수성 장벽을 그립니다.

전 (前) 처리

1. 전처리로 한 조직 절편을 배양한다 내인성 퍼 옥시 다제 활성의 담금질을위한 RT에서 10 분 동안, dH보다 ₂ O. 린스
2. dH보다 ₂ O. 두번 씻어 RNA 검색을 위해 15 분 동안 비점 온도에서 유지 전처리이있는 조직 절편을 부화
3. dH보다 ₂ O에 두 번 씻어 HybEZ 오븐에서 단백질 소화를 위해 40 ° C에서 30 분 동안 전처리 3 조직 섹션을 품어

대상 프로브 하이브리드

대상 프로브 HPV-HR 7 풀은 다음을 포함한다 : HPV16, 18, 31, 33, 35, 52, 및 58. 개별적으로 세 개의 인접 조직 섹션에 HPV 프로브, 유비퀴틴 C (UBC)와 박테리아 유전자 dapB 프로브를 추가합니다. 2 오븐에서 40 ° C에서 하이브리드시간은 다음 실온에서 2 × 2 분 1X 세척 버퍼에 헹군다.

신호 증폭

1. 40 ° C에서 30 분 동안 40 ° C, AMP3 (앰프)에서 15 분 동안 40 ° C, AMP2 (배경 감속기)에서 30 분 동안 AMP1 (프리 앰프)와 조직 섹션을 품어하고 AMP4 (라벨 프로브) 15 분 HybEZ 오븐에서 40 ° C에서. 각 혼성화 단계 후, 실온에서 2 × 2 분 1X 세척 버퍼에 헹군다.
2. RT에서 15 분 30 분, Amp6에 Amp5와 조직 섹션을 품어. 각 배양 단계 후, 실온에서 2 × 2 분 1X 세척 버퍼에 헹군다.

신호 검출

실온에서 10 분 동안 브라운 - 브라운-B의 동량을 혼합 1:1 DAB 혼합물과 조직 섹션을 품어, dH보다 ₂ O에 두 번 씻어

Counterstaining

RT에서 2 분 50 % 헤 마톡 솔루션을 얼룩 조직 섹션은, dH보다 ₂ O 씻어. 딥 배에 대한 dH보다 ₂ O 0.01 %의 암모니아에 슬라이드 및 dH보다 ₂ O 5 딥에 따라

슬라이드 장착

2 분마다 70 %, 100 % 및 100 %의 EtOH의 조직 절편을 탈수, 크실렌 5 분간, 크실렌 계 장착 매체 마운트.

결과

RNAscope HPV 분석 워크 플로우

RNAscope 분석 (그림 1) IHC 유사한 매우 능률적 인 워크 플로우가 있습니다. 전처리, 하이브리드, 신호 증폭, 검출 : 그것은 네 가지 주요 단계로 구성됩니다. 그것은 높은 충실도의 신호 증폭 ^5를 보장하는 고유 한 프로브 설계 전략을 사용한다. RNAscope HPV 분석에서 일곱 HR-HPV 프로브 세트는 모두 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)에 연결된 동일한 신호 증폭 시스템에서 인식, 풀됩니다. HRP에 의해 형성된 갈색 침전물이 쉽게 표준 밝은 필드 현미경으로 시각화 할 수있는 기판으로 DAB를 사용하여 발색 반응을 촉매로 특정 하이브리드 신호가 감지됩니다.

HPV 검출을위한 대표적인 염색

그림 2는 머리와 목 편평 상피 세포 암의 스테인드 FFPE 섹션에서 예제 이미지를 보여줍니다. HPV 양성의 경우 (도우레의 2A), HR-HPV 프로브는 특히 종양 세포에 강한 점 모양의 신호를 감지했습니다. UBC 프로브는 종양 세포와 기질 세포 (그림 2B) 모두에서 다수의 작은 반점이 세포질 신호를 감지했습니다. 세균의 유전자 dapB 프로브는 깨끗한 배경 (그림 2C)를 보여 주었다. 강한 신호가 UBC 프로브 (도 2E)를 이용하여 검출 하였다 반면 HPV 부정적인 경우, HR-HPV 프로브 및 dapB 프로브 모두는 제공된 신호 (도 2D 및 2F)을 검출되지. 이 분석에서, UBC 배경 신호를 음성 대조군으로 조직의 RNA의 품질과 dapB을 평가하는 긍정적 인 제어를 제공합니다. HPV 상태 결정에 대한 점수는 각각의 경우에 대한 세 가지 슬라이드를 검토합니다. 음성 대조군 슬라이드 (dapB) 슬라이드의 염색 수준은 컷오프로 사용됩니다 : HPV 양성은 반점이 세포질 및 / 또는 dabpB 슬라이드의 신호 이상이었다 핵 염색의 존재에 의해 정의된다.

그림 1. RNAscope 분석 워크 플로우의 RNAscope 분석의 흐름도. 그림. RNAscope 분석은 4 가지 주요 단계, 전처리, 대상 프로브 하이브리드, 신호 증폭 및 신호 검출이 포함되어 있습니다. 전체 분석 절차는 8 시간에 완료 할 수 있습니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2. RNAscope 스테인드 슬라이드의 예 이미지. HR-HPV, UBC (양성 대조군) 및 dapB위한 프로브로 염색 FFPE 섹션 (음성 대조군)두 HNSCC 케이스에서. AC. HPV 양성 케이스. 종양 세포에있는 A, HR-HPV E6/E7 mRNA 발현. 삽입, 반점이 신호를 표시하는 40 배 확대. B와 C). DF) HPV 음성 인 경우. D) 각각 HPV E6/E7 mRNA에 대한 염색을 긍정적 인 UBC 염색 (B) 및 dapB (C 마이너스)를 보여주는 인접 조직 섹션 , dapB 음성 대조군 (F)와 유사. E) UBC 긍정적 인 염색. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

RNAscope HPV 분석은 HPV 관련 머리와 목 편평 상피 세포 암에 현장에서 E6/E7 mRNA를 직접 시각화를 허용했다. RNAscope 분석은 정기적으로 고정 된 종양 조직과 완벽하게 호환 및 조직 병리학 적 상관 관계에 대한 조직 형태 (그림 2)를 유지합니다. 기존의 CISH 방법을 통해 RNAscope 분석의 주요 장점은 특히 배경 잡음 (그림 2C 및 2 층)를 증폭하지 않고 하이브리드 신호 (그림 2B 및 2E)를 증폭한다는 것입니다.

실제로, RNAscope HPV 분석 절차는 8 시간 이내에 완료 될 수 있거나 편리 이틀간 나누었다. RNAscope HPV 분석은 참조 방법 ^{(16)으로서} QRT-PCR을 사용하여 97 %의 민감성 및 93 %의 특이성을 보여주는, 두경부 편평 세포 암종에서 ^12-16 HPV 상태를 결정하는 데 사용되었다. 기존 CHRHR-HPV DNA에 대한 omogenic ISH는 매우 구체적인이지만 80 % ¹² ~의 감도를 가지고 있습니다. 휴대 대리 마커 P16에 대한 면역 조직 화학 (IHC) 염색은 우수한 감도를 보여줍니다 만, 특히 nonoropharyngeal 머리와 목 암 ^(15)의 거짓 긍정적 인 결과 ^15,18를 생성 할 수 있습니다. HPV E6/E7 mRNA의 검출을위한 QRT-PCR의 현재 "황금 표준"방법은 실험실 연구에 사용을 제한하는, 최적의 결과를 위해 냉동 조직을 필요로하며, 기술적으로 복잡하다. 또, 그것이 불가능한 조직 병리학으로 HR-HPV E6/E7 mRNA 발현의 상관 관계를 만드는 RNA 추출을 필요로한다.

RNAscope 분석의 성공에 대한 몇 가지 중요한 요소가 있습니다. 첫째, 최상의 결과를 위해, 조직은 ASCO / CAP 지침 ^19에 따라 16-32 시간 동안 실온에서 신선한 10 % 중성 포르말린에 고정되어야한다. 그것을 활성화 이후 두 번째로, HybEZ 오븐은 매우 좋습니다프로브와 혼성화 신호 증폭 단계에 대한 온도 및 습도의 최적 제어를들. 셋째, 각 단계 이전에 초과 잔류 버퍼를 제거하지만, 여전히 이러한 단계를 수행하는 동안 건조 조직 섹션을 유지하는 것이 중요합니다.

여기에 설명 된 매뉴얼 RNAscope 절차는 완전히 상용 슬라이드 자동 염색 시스템 ^(10)에 자동화되어 있습니다. 이것은 크게 분석 조건과 임상 병리 실험실에서 절약의 소중한 육체 노동의 표준화를 촉진한다. 또, 전용의 이미지 분석 소프트웨어는 자동적 주관성을 제거하고 채점에서 재현성을 개선하는 데 도움이되어야 디지털화 슬라이드상의 세포 염색 신호를 식별하기 위해 ^열을 개발되었다.

요약하면, RNAscope HPV 분석은 FFPE 조직에서 현장의 HR-HPV E6/E7 mRNA의 성적 증명서의 존재를 감지합니다. 그것은 임상 병리 연구소 용에 익숙한 워크 플로우가조직 섹션에서 이들의 직접 시각화를 허용하여 토리. 그것은 (FFPE) 조직 샘플을 조사하기위한 이상적인 플랫폼을 제공하고, 쉽게 진단 병리 실험실에서 채용 할 수있다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
SuperFrost Plus slides	Fisher Scientific	12-550-15
HybEZ Oven, Tray, and Rack	Advanced Cell Diagnostics	310011, 310012, 310014
RNAscope 2.0 FFPE Reagent Kit - Brown	Advanced Cell Diagnostics	310035
RNAscope HPV-HR7 Probe for HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52, and 58, E6/E7 mRNA	Advanced Cell Diagnostics	312351
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratory	H-4000
100% EtOH	American Master Tech Scientific	ALREAGAL
Xylene	Fisher Scientific	X3P-1GAL
Gill's Hematoxylin I	American Master Tech Scientific	HXGHE1LT
Ammonia hydroxide	Sigma-Aldrich	320145-500mL
Cover Glass 24 mm x 50 mm	Fisher Scientific	12-545-F
Hot Plate	Fisher Scientific	11-300-49SHP
Drying Oven			Capable of holding temperature at 60±1 °C
Water Bath			Capable of holding temperature at 40±1 °C