Détermination de l&#39;activité locomotrice spontanée,<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Résumé

Drosophila melanogaster sont utiles dans l'étude de manipulations génétiques ou environnementales qui affectent les comportements tels que l'activité locomotrice spontanée. Nous décrivons ici un protocole qui utilise des moniteurs à rayons infrarouges et des logiciels d'analyse de données pour quantifier l'activité locomotrice spontanée.

Résumé

Drosophila melanogaster a été utilisé comme un excellent organisme modèle pour étudier les manipulations génétiques et environnementaux qui affectent le comportement. Un tel comportement est l'activité locomotrice spontanée. Ici, nous décrivons notre protocole qui utilise la drosophile moniteurs de la population et un système de suivi qui permet une surveillance continue de l'activité locomotrice spontanée des mouches pendant plusieurs jours à la fois. Cette méthode est simple, fiable, et l'objectif et peut être utilisé pour étudier les effets du vieillissement, le sexe, les variations de la teneur en calories d'aliments, l'addition de médicaments, ou des manipulations génétiques qui imitent les maladies humaines.

Introduction

Les mouches à fruits, Drosophila melanogaster, ont été utilisés comme un organisme modèle important pour étudier les mécanismes sous-jacents des comportements complexes, tels que l'apprentissage et la mémoire, l'interaction sociale, l'agressivité, l'abus de drogues, le sommeil, la fonction sensorielle, la cour, et l'accouplement ^1,2. Un comportement qui a été étudié par de multiples protocoles est l'activité locomotrice spontanée. Géotaxie négatif était l'une des premières méthodes mises au point pour mesurer l'activité de Drosophila, et ce protocole consiste à mesurer le pourcentage de mouches qui atteignent une certaine hauteur de la fiole après les mouches ont été secouées à la partie inférieure du récipient de ^1,3. Cette méthode présente les avantages d'être simple, peu coûteux, et car il ne nécessite pas d'équipement spécial, il peut être réalisé dans n'importe quel laboratoire. Il a été utilisé comme un outil de dépistage utile pour étudier les effets de différentes manipulations génétiques sur la mouche mobilité ^3. Cependant, il est temps de main-d'oeuvre et unee a la possibilité de partialité en raison de secousses variable des flacons et des enregistrements humaines.

La méthode de géotaxie négative a été améliorée par le développement de la méthode rapide itératif négatif géotaxie (RING) ^4,5, qui prend des photos des flacons de mouche suivants secouant de vol vers le bas. L'avantage de ce protocole est sa sensibilité et de la possibilité de tester un grand nombre de flacons de braguette en même temps. Cependant, ce protocole a encore le potentiel d'erreur humaine, et ne mesure que géotaxie négative. D'autres laboratoires ont utilisé la simple observation dans des flacons de culture pour déterminer l'activité locomotrice ^6.

Récemment, plusieurs systèmes d'enregistrement vidéo pour la mesure de l'activité locomotrice des mouches ont été développés. Un protocole de surveillance vidéo offre un temps d'adaptation avant l'enregistrement ^7. La méthode décrite par Slawson et al. Utilise également une impulsion d'air pour arrêter movement jusqu'à ce que le début de l'enregistrement, ce qui pourrait être un facteur de stress pour les animaux ^7. Cette méthode fournit des informations sur la vitesse moyenne, vitesse max, temps passé en mouvement, etc Un autre système de suivi en trois dimensions mesure la vitesse maximale de vol individuels pendant ~ 0,2 secondes de vol libre décollage ^8. Un protocole de surveillance vidéo en trois dimensions utilise les mouches exprimant la GFP et plusieurs caméras équipées de filtres qui permettent la détection de la fluorescence pour déterminer la mobilité de la mouche ^9. Vol de ce protocole ont tendance à présenter des modèles de vol cylindriques, ce qui est potentiellement en raison de la forme de la culture Drosophila flacons ^10. Cette méthode a été améliorée par l'utilisation d'un dôme qui permet de mesurer le mouvement spontané des deux vol ^11. Une méthode à haut débit qui utilise une caméra pour surveiller automatiquement et de quantifier le comportement individuel et social de la drosophile a été également décrit ^12. Zou etal. développé un système de surveillance comportementale (BMS) qui utilise deux caméras assistées par ordinateur pour enregistrer le comportement de vie et les mouvements tels que le repos, en mouvement, voler, manger, boire, ou de décès individuel fruits de téphritide vole ^13. Plusieurs autres systèmes vidéo ont été développés pour surveiller l'activité comportementale ^14,15 mouche.

Ici, nous décrivons une méthode pour la quantification de l'activité chez la drosophile qui utilise des écrans de population. Ces moniteurs sont logés dans la température et les incubateurs à humidité contrôlée à 25 ° C sur un cycle de 12 heures par jour-nuit de la lumière. Chaque moniteur de la population a des faisceaux infrarouges placés dans des anneaux placés à trois hauteurs différentes. Chaque fois qu'une mouche se déplace à travers les anneaux, il interrompt le faisceau infrarouge, qui est enregistrée par un microprocesseur de façon indépendante que les enregistrements et compte l'activité de vol à l'intérieur de la fiole. Un microprocesseur télécharge de l'activité totale dans le flacon à l'ordinateur à InterVA défini par l'utilisateurls qui pourrait varier de 1 seconde à 60 minutes. La méthode décrite ici fournit amplement de temps pour les mouches de s'adapter au nouvel environnement et permet de mesure simultanée de l'activité locomotrice spontanée de moins de 120 populations de mouches. En outre, nous décrivons la préparation de la nourriture, de l'entretien volons, mise en place des moniteurs mobilité de la population dans des incubateurs à température contrôlée, et les facteurs potentiels pouvant affecter les résultats. Cette méthode peut être utilisée pour étudier la façon dont les différentes modifications de l'environnement ou génétiques affectent l'activité locomotrice spontanée de vol.

Protocole

Remarque: La souche Canton-S est la ligne de fond de type sauvage standard obtenue à partir de Bloomington Stock Center.

1. Préparation des aliments et des recettes pour 1000 ml de l'alimentation

Remarque: Cette section décrit le protocole pour la préparation des aliments. De grands pots en métal sont utilisés pour préparer environ 18 L de nourriture à la fois. Le protocole décrit ici est réduit ses effectifs et utilise 1000 ml H ₂ O. L'alimentation est passé à l'autoclave deux fois.

1. Mélanger 113 g de saccharose et 28 g de levure de bière dans 643 ml d'eau. Ajouter les ingrédients sur un ensemble de plaque chaude à 25 ° C avec un agitateur pour mélanger tout au long de 15 minutes.
2. Solution alimentaire autoclave pendant 20 min.
3. Mélanger 49 g de farine de maïs et 8,1 g d'agar dans 268 ml d'eau et ajouter au mélange de la nourriture à l'autoclave décrit à l'étape 1.2. Mélangez bien avec une grande cuillère ou un fouet.
4. Mélange alimentaire autoclave pendant 20 min.
5. Placez les aliments sur une plaque et laisser refroidir en mélangeant constamment avec une barre d'agitation. Jef solutions supplémentaires devraient être ajoutés aux aliments, tels que la mifépristone (RU486), garder la nourriture sur une plaque chauffante mis en place à 60 ° C et ajouter la solution lorsque la nourriture atteint la température requise.
6. Dissoudre 2,4 g tegosept à 10,7 ml EtOH à 100% et réservez sur une assiette froide avec un agitateur pour dissoudre complètement et mélanger pendant environ 15 min.
7. Ajouter la solution de tegosept à l'alimentation lorsque la température des aliments est de 60 ° C et bien mélanger.
8. Utiliser une pompe ou d'un distributeur de produits alimentaires à verser environ 10 ml de la nourriture dans un grand flacon. En utilisant un distributeur de nourriture, on peut verser des aliments simultanément en 100 de large, flacons en plastique (1 plateau) à la fois.
9. Couvrir les flacons avec Kimwipes et coton à fromage et laisser de la nourriture à la température ambiante pendant 12-24 heures pour se refroidir. Gardez les aliments à 4 ° C et utiliser dans les 3-4 semaines. Réchauffez les aliments à la température ambiante avant de l'utiliser pour le travail à la mouche.

2. Préparation des fioles en verre

1. Préparer des aliments selon le protocole énumérés dans l'étape 1.
2. Aliquote de 5 ml de nourriture dans chaque étroit, flacon de verre, qui est la bonne taille pour les moniteurs de la population. Cette quantité de nourriture doit être suffisamment faible pour être en dessous de l'anneau le plus bas de l'écran de la population.
3. Après la nourriture refroidit à la température ambiante couvrir les flacons avec des bouchons d'éponges et de les conserver à 4 ° C pendant 2 semaines. Parce que la quantité de nourriture dans un flacon est assez faible, il est préférable d'utiliser la nourriture dans une semaine ou deux pour éviter tout dessèchement.
4. Réchauffez-vous les flacons à température ambiante avant utilisation.

3. Maintenance des mouches parental

1. Cultiver les mouches dans des flacons en plastique de largeur avec de la nourriture de laboratoire standard et garder les flacons dans une chambre de l'environnement à température contrôlée humidifié à 25 ° C sur un cycle de 12 heures de lumière / obscurité. La période de la lumière du jour commence à 06h00 dans ce laboratoire.
2. Dans la matinée adulte clairement vole des flacons de vol qui parentales seront collectées.
3. Recueillir FLIE nouvellement écloss et de les séparer par sexe sur un tapis de CO ₂ dans les 8 heures après l'éclosion de s'assurer que les mouches femelles sont vierges. Les mouches commencent à s'accoupler 8 heures après l'éclosion.
4. Lorsque les hommes et les femmes mouches vierges sont entre 5 et 10 jours d'âge, mettre 10 mâles et 10 mouches femelles dans un flacon avec de la nourriture standard et quelques grains de levure active sur le dessus.
   Remarque: contrôler la densité des larves en utilisant le même nombre de mouches et de les maintenir dans une fiole pendant deux jours. Addition de levure active favorise la production d'oeufs.
5. Gardez vol pour s'accoupler et pondre des oeufs dans une chambre de l'environnement à température contrôlée à 25 ° C avec un cycle de 12 heures de lumière / obscurité pendant 2 jours. Mettre en place 5-10 flacons de vol parentales.
6. Passer les mouches à un nouveau flacon en plastique tous les jours et de garder les flacons avec les oeufs dans un incubateur à 25 ° C.

4. Collection de mouches expérimentales

1. Après 9 jours mouches vont commencer à Eclose des flacons où la parental mouches pondent des oeufs (décrites à l'étape 3.6.). Effacer et jeter les mouches qui éclos au cours de la première journée et retourner les flacons à l'incubateur. La plupart des mouches éclos au jour 1 sont des femmes. Une population plus synchronisée de vol sera Eclose le jour 2.
2. Dans les 24 heures place des mouches nouvellement éclos sur CO ₂ pads et collecter 25 mâles et 25 femelles par vol flacons avec un pinceau ou d'une cuillère de métal. Gardez des mouches sur _de CO ₂ pads pour une courte période de temps afin de minimiser les effets du CO _2. Notez le jour de l'éclosion sur le flacon. Assemblez au moins 5 flacons répliqués à des fins expérimentales et pour les groupes de contrôle.
3. Conserver les flacons dans les chambres d'environnement à température contrôlée à 25 ° C avec un cycle de 12 heures de lumière / obscurité.
4. Faire passer les mouches à un nouveau flacon en plastique tous les deux jours en utilisant un entonnoir.
5. Âge vol jusqu'à l'âge souhaité pour l'expérimentation est atteint.

5. Configuration des moniteurs de mobilité

1. Placez lePopulation surveille dans un incubateur à température contrôlée.
2. Connectez chaque moniteur avec un câble téléphonique à 4 fils à l'unité d'interface d'alimentation (psiu) via répartiteurs 5 voies (multi-ligne), qui peuvent se connecter jusqu'à 5 écrans individuels à une ouverture dans le psiu. Voir les figures 1A et 2B.
3. Connectez le psiu à une prise de courant de ligne (100-240 V). Branchez le connecteur de sortie de l'alimentation dans l'une des deux prises d'accouplement psiu. Le feu vert adjacent s'allume en vert lorsqu'il est connecté correctement.
4. Connectez le psiu à l'Universal Serial Bus matérielle (USB). Branchez le câble USB entre le matériel USB avec un Macintosh ou un PC sous Windows pour l'enregistrement de données. Il serait préférable d'avoir un ordinateur dédié uniquement à la collecte de données depuis collection fonctionne pendant des jours à la fois.
5. Télécharger le logiciel USB (PSIUdrivers.zip). logiciel du pilote USB est utilisé par l'interface d'alimentation et doit être téléchargé qu'une seule fois. Il synthétise uneliaison de données entre le programme d'ordinateur et les moniteurs Psiu / d'activité. Pour une utilisation de PC un port COM et un Macintosh utilisent un port série simple.
6. Télécharger le programme informatique pour Macintosh OSX (Intel) ou pour les programmes (XP/Vista/7) Windows PC en suivant les instructions fournies par le fabricant Notes 308.pdf.
7. Démarrez le programme d'ordinateur et mis en place le programme en cliquant sur les Préférences, Feux ou moniteurs. Le programme se poursuivra jusqu'à l'utilisateur sélectionne «Quitter» pour arrêter le programme. Si le programme d'ordinateur ou l'ordinateur est éteint les moniteurs vont continuer à compter les interruptions de faisceau, mais les chiffres ne seront pas enregistrées jusqu'à ce que le programme est relancé. Dans ce cas, la première lecture comprendra tous les chefs depuis la dernière fois le psiu envoyé les données à l'ordinateur.
8. Sélectionnez l'onglet Préférences et sélectionnez le port série, psiu pour Macintosh et COM pour le PC.
9. Sélectionnez l'intervalle de lecture qui va de secondes, minutes ou une heure.
10. Sélectionnez les moniteurs: Chaque moniteur a son numéro unique qui est donnée par le fabricant. Sélectionnez la chaîne moniteur qui correspond aux chiffres donnés pour les moniteurs par le fabricant.
11. La boîte de lumières: Assurez-vous que tous les moniteurs sont correctement connectés, qui est marqué par une lumière verte à côté du numéro de contrôle sur le logiciel. Une lumière rouge indique que la connexion est perdue, et une boîte noire indique que le système est éteint ou mal mis en place.

6. Configuration de l'Expérience

1. Retirer les flacons de verre contenant de la nourriture de 4 ° C et laisser réchauffer à la température ambiante.
2. Mouches mâles et femelles séparés du même âge sur le CO ₂ pad. Pour les études de vieillissement, il est possible de commencer des études de mobilité dès 3 jours d'âge.
3. Mettez 10 hommes ou 10 mouches femelles dans chaque flacon de verre contenant de la nourriture. Utilisez au moins trois flacons pour chaque ligne expérimentale et de contrôle de vol et pour chaque sexe.
4. Gardez la vials de leur côté jusqu'à ce que les mouches se remettre de CO ₂ pour s'assurer que les mouches ne reste pas coincé dans la nourriture. Vol séparés à environ 08h00 et les laisser pendant environ 2 heures à température ambiante pour se remettre de CO _2.
5. Placer les flacons à l'intérieur des moniteurs de la population logés dans les incubateurs.
6. Jeter les données recueillies dans les 24 premières heures après les mouches sont mis dans l'incubateur pour les laisser s'adapter à l'environnement nouveau.
7. Faire passer les mouches après 3 ou 4 jours de nouveaux flacons pour éviter le séchage de l'aliment. Si les mouches sont sujettes à la mort ou sont âgés de 40 jours ou plus âgés, passer les mouches après 2 jours et les données d'utilisation recueillies pour le jour 2. Aussi, utiliser plus de trois flacons par groupe pour assurer répétitions adéquates. Les données de flacons avec des mouches mortes doivent être ignorées et non inclus dans l'analyse.

7. Exécution des moniteurs d'activité et de calculer l'activité spontanée totale

1. Sélectionnez les préférences - l'intervalle de collecte des données <.br /> Note: Le programme informatique permet de recueillir des données à des intervalles allant de 1 seconde à 60 minutes. Périodes de 10 et 30 minutes ont été trouvés à fournir des informations adéquates sur la mobilité sans avoir un très grand nombre de points dans le temps. À la période de temps sélectionnée, le programme enverra le nombre total actuel pour chaque moniteur à l'ordinateur et commencer à compter à partir de zéro. Programme d'ordinateur stocke les données dans un nouveau dossier créé par le système de données de l'ordinateur. Les données recueillies dans chaque moniteur sont stockés séparément, et les documents de texte individuels sont créés pour chaque flacon. Les données sont recueillies en continu aussi longtemps que le programme fonctionne.
2. A la fin de l'expérience, analyser les données en utilisant le FileScan110X pour Macintosh OSX (Intel) ou SystemMB108 PC Windows programme (XP/Vista/7) pour.
   Remarque: Le programme de numérisation élimine lectures en double et permet de s'assurer que les enregistrements sont complets.
3. Sauvegardez les données recueillies dans un délai et p spécifiqueériode de jours. Choisissez un nom expérimentale et copier les fichiers dans le dossier de données de l'ordinateur pour l'analyse.
   Remarque: A cette époque, les intervalles d'activité peuvent être modifiés et convertis à des mesures différentes. Les données d'origine restent stockés dans le dossier de données de l'ordinateur et peuvent être récupérées tant qu'ils ne sont pas supprimés.

8. Analyse des données

1. Copiez les données recueillies dans les fichiers texte en colonnes de feuilles de calcul Excel pour l'analyse des données. Les données recueillies par ce logiciel sont en colonnes, qui contiennent des nombres représentant l'activité totale dans un seul moniteur pendant une période de temps choisie par le chercheur.
   Note: Les données recueillies pour chaque moniteur sont dans des fichiers texte séparés. Il ya 32 colonnes pour chaque moniteur. Les six premières colonnes sont vides et ne contiennent que 0; trois prochaines contiennent les données recueillies à l'anneau de fond, au milieu, et à l'anneau supérieur. Le reste des canaux peut être supprimé, car ils ne contiennent pas de données. Chaque anneau émet unseule valeur par le temps. Voir capture d'écran des données brutes dans la figure 2.
2. Calcul de l'activité totale dans une période de temps désirée pour chaque moniteur qui représente la somme de l'activité recueillie à trois hauteurs différentes de faisceaux infrarouges.
   Remarque: La période de temps peut aller de plusieurs heures, 24 heures ou plusieurs jours.
3. Déterminer l'activité locomotrice moyenne et l'écart type entre les trois écrans qui représentent 3 répétitions biologiques.
   Remarque: Les données peuvent être analysées pour la signification statistique en utilisant un certain nombre de tests. T-test de deux élèves de Virginie, une analyse unidirectionnelle de variance (ANOVA) et un test post-hoc de Tukey HSD pourraient être utilisés pour déterminer les effets de plusieurs manipulations environnementaux ou génétiques sur les 24 heures de l'activité locomotrice spontanée ^16. Il ya un certain nombre d'autres programmes qui peuvent être utilisés et ont été publiées antérieurement ^17.

Résultats

L'activité locomotrice spontanée chez la drosophile dépend mouche sexe (figure 3A), la teneur en calories des aliments (figure 3B) et le cycle lumière / obscurité. Une fois que la lumière est éteinte activité des mouches diminue considérablement. Figure 3A illustre les 24 heures de l'activité locomotrice des enregistrements de mouches mâles et femelles. Un astérisque sur l'axe des x marque le moment où la lumière a été éteinte...

Discussion

L'activité locomotrice spontanée des mouches est influencée par de nombreux facteurs tels que l'âge, le patrimoine génétique et le sexe ^2,13,18,19. En outre, les facteurs environnementaux tels que la teneur en calories des aliments, la température de l'environnement, plus de médicaments différents, et le cycle de lumière jour / nuit peuvent affecter l'activité de la mouche. Par exemple, les mouches mâles du même âge ont une activité physique plus spontané que chez les femmes

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sucrose FCC Food Grade 100 LB,	Fisher Scientific MP Biomedicals	ICN90471380
Brewer’s Yeast	Fisher Scientific MP Biomedicals	ICN90331280
Drosophila Agar Fine	SciMart	DR-820-25F
Cornmeal	Fisher Scientific MP Biomedicals	ICN90141125
Methyl4-hydroxybenzoate, tegosept	Sigma	H5501-5KG
EtOH	Pharmco-AAPER	111000200
Active Dry Yeast	Fisher Scientific	ICN10140001
Fly CO2 pad	LabScientific	BGSU-7
Stereo Microscope	Olympus	SZ40
Drosophila carbon dioxide (CO2) tank	Airgas	UN1013
Small paint brush for pushing the flies
Shell vial wide	Fischer Scientific	AS519
Buzzplugs for wide plastic vials	Fischer Scientific	AS275
Glass vials (25 x 95 mm)	Fischer Scientific Kimble 60931-8	AS-574
Sponge plugs for glass vials	SciMart	DR-750
Drosophila Food Dispenser	Applied Scientific (Fischer Scientific)	AS780Q
DPM Drosophila Population Monitor	Trikinetics Inc.
DC Power Supply with line cord	Trikinetics Inc.
PSIU9 The Power Supply Interface Unit	Trikinetics Inc.
Telephone cables and 5 way splitters	Trikinetics Inc.
Universal Serial Bus (USB) hardware	Trikinetics Inc.
Macintosh or Windows PC with UCB port
DAMSystem308X Data Acquisition Software for Macintoch OSX (Intel)	www.trikinetics.com
DAMSystem308 Data Acquisition Software for Windows PC (XP/Vista/7)	www.trikinetics.com
[header]
DAMFileScan108X software for Macintosh	www.trikinetics.com
DAMFileScan108X software for Windows PC (XP/Vista/7)	www.trikinetics.com
USB software (PSIUdrivers.zip)	www.trikinetics.com
DAMSystem Notes 308	(http://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Notes%20308.pdf