Determinazione del locomotore attività spontanea in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Riepilogo

Drosophila melanogaster sono utili per studiare le manipolazioni genetiche o ambientali che influenzano i comportamenti come l'attività locomotoria spontanea. Qui si descrive un protocollo che utilizza il monitor con raggi infrarossi e software di analisi dei dati per quantificare l'attività locomotoria spontanea.

Abstract

Drosophila melanogaster è stato utilizzato come un ottimo organismo modello per studiare le manipolazioni ambientali e genetici che influenzano il comportamento. Un tale comportamento è l'attività locomotoria spontanea. Qui si descrive il protocollo che utilizza monitor popolazione Drosophila e un sistema di monitoraggio che consente il monitoraggio continuo dell'attività locomotoria spontanea di linea per diversi giorni alla volta. Questo metodo è semplice, affidabile e obiettivo e può essere utilizzato per esaminare gli effetti dell'invecchiamento, sesso, variazioni nel contenuto calorico degli alimenti, aggiunta di farmaci o manipolazioni genetiche che mimano malattie umane.

Introduzione

Moscerini della frutta, Drosophila melanogaster, sono stati utilizzati come organismo modello prezioso per studiare i meccanismi alla base di comportamenti complessi, quali l'apprendimento e la memoria, l'interazione sociale, l'aggressività, abuso di droghe, il sonno, la funzione sensoriale, corteggiamento e accoppiamento ^1,2. Un comportamento che è stato studiato attraverso molteplici protocolli è l'attività locomotoria spontanea. Geotassi negativo è stato uno dei primi metodi sviluppati per la misurazione dell'attività Drosophila, e questo protocollo prevede la misura la percentuale di mosche che raggiungono una certa altezza del flaconcino dopo linea fu scossa al fondo del contenitore ^1,3. Questo metodo presenta i vantaggi di essere semplice, poco costoso, e poiché non richiede particolari attrezzature può essere eseguita in qualsiasi laboratorio. E 'stato usato come strumento di screening prezioso per studiare gli effetti di differenti manipolazioni genetiche su fly mobilità ^3. Tuttavia, è tempo e lavoro ad alta intensità dind ha la possibilità di bias dovuto alla variabile agitazione delle fiale e registrazioni umani.

Il metodo geotassi negativo è stato migliorato dallo sviluppo del metodo iterativo Rapid Negative geotassi (RING) ^4,5, che prende fotografie delle fiale fly seguenti agitazione delle mosche verso il basso. Il vantaggio di questo protocollo è la sua sensibilità e la possibilità di testare un gran numero di fiale mosca allo stesso tempo. Tuttavia, questo protocollo ha ancora la possibilità di errore umano, e misura solo geotassi negativi. Altri laboratori hanno utilizzato la semplice osservazione in flaconi di coltura per determinare l'attività locomotoria ^6.

Recentemente sono stati sviluppati diversi sistemi di registrazione video per la misurazione dell'attività locomotoria mosca. Un protocollo di monitoraggio video fornisce tempo per la regolazione prima della registrazione ^7. Il metodo descritto da Slawson et al. Utilizza anche un impulso d'aria per fermare movement fino all'inizio della registrazione, che potrebbe essere un fattore di stress agli animali ^7. Questo metodo fornisce informazioni sulla velocità media, velocità massima, tempo trascorso in movimento, ecc Un altro sistema di inseguimento tridimensionale misura la velocità massima dei singoli mosche durante ~ 0,2 secondi di libera decollo volo ^8. Un protocollo di monitoraggio video tridimensionale utilizza mosche che esprimono GFP e più telecamere dotate di filtri che consentono la rilevazione della fluorescenza per determinare mosca mobilità ^9. Mosche in questo protocollo tendono a mostrare modelli ponti cilindrici, che è potenzialmente a causa della forma della cultura Drosophila fiale ^10. Questo metodo è stato migliorato utilizzando una cupola che permette di misurare movimento spontaneo di due mosche ^11. Un metodo ad alta velocità che utilizza una telecamera per monitorare e quantificare il comportamento individuale e sociale di Drosophila automaticamente è stato anche descritto ^12. Zou etal. ha sviluppato un sistema di monitoraggio comportamentale (BMS) che utilizza due telecamere assistita da computer per registrare il comportamento a vita e movimenti come riposo, in movimento, volare, mangiare, bere, o morti di frutta tephritid individuale mosche ^13. Diversi altri sistemi video sono stati sviluppati per monitorare l'attività fly comportamentale ^14,15.

Qui si descrive un metodo per quantificare l'attività Drosophila che utilizza i monitor della popolazione. Questi monitor sono alloggiati in locali e incubatori umidità controllata a 25 ° C su un ciclo di 12 ore di luce giorno-notte. Ogni monitor popolazione ha raggi infrarossi collocati in anelli posizionabile a tre diverse altezze. Ogni volta che una mosca si muove attraverso gli anelli si interrompe il fascio infrarosso, che viene registrato da un microprocessore che, indipendentemente atti e conta delle attività di linea all'interno della fiala. Un microprocessore carica l'attività totale nel flaconcino al computer a interva definita dall'utentels che potrebbero variare da 1 secondo a 60 minuti. Il metodo qui descritto prevede ampio spazio per le mosche si adeguino al nuovo ambiente e consente la misurazione simultanea dell'attività locomotoria spontanea di ben 120 popolazioni di mosche. Inoltre, si descrive la preparazione del cibo, voliamo manutenzione, l'impostazione dei monitor popolazione di mobilità in incubatori a temperatura controllata, e potenziali fattori che potrebbero influenzare i risultati. Questo metodo può essere usato per studiare come diverse modificazioni ambientali o genetici influenzano l'attività locomotoria spontanea delle mosche.

Protocollo

Nota: Il ceppo Canton-S è la linea di fondo wild-type standard ottenuta da Bloomington Stock Center.

1. Preparazione Cibi e Ricetta per 1.000 ml di Alimenti

Nota: Questa sezione descrive il protocollo per la preparazione dei cibi. Grandi vasi metallici sono usati per preparare circa 18 L di cibo alla volta. Il protocollo qui descritto viene ridimensionato e utilizza 1.000 ml H ₂ O. Il cibo è autoclavato due volte.

1. Mescolare 113 g di saccarosio e 28 g di lievito di birra in 643 ml di acqua. Lasciare gli ingredienti su una serie piastra calda a 25 ° C con una ancoretta mescolare tutto per 15 minuti.
2. Soluzione cibo autoclave per 20 min.
3. Mescolare 49 g di farina di mais e 8,1 g di agar-agar in 268 ml di acqua e aggiungere alla miscela di cibo autoclavato descritto al punto 1.2. Mescolare bene con un cucchiaio o una frusta.
4. Autoclave miscela cibo per altri 20 min.
5. Mettere il cibo in un piatto e lasciate raffreddare con miscelazione costante con un ancoretta. Iof ulteriori soluzioni devono essere aggiunti agli alimenti, come il mifepristone (RU486), mantenere il cibo in un piatto caldo istituito a 60 ° C e aggiungere la soluzione quando il cibo raggiunge la temperatura desiderata.
6. Sciogliere 2.4 g tegosept in 10,7 ml 100% EtOH e mantenere su un piatto freddo con un agitatore per sciogliere completamente e miscelare per circa 15 min.
7. Aggiungere la soluzione tegosept al cibo quando la temperatura del cibo è 60 ° C e miscelare bene.
8. Utilizzare una pompa o un dosatore di mangime per versare circa 10 ml di cibo in un'ampia flaconcino. Utilizzando un dispenser cibo si può versare alimentare simultaneamente in 100 ampi, fiale di plastica (1 vassoio) alla volta.
9. Coprire i flaconcini con Kimwipes e telo e lasciare il cibo a temperatura ambiente per 12-24 ore a raffreddare. Conservare il cibo a 4 ° C ed utilizzare entro 3-4 settimane. Riscaldare il cibo a temperatura ambiente prima dell'uso per il lavoro mosca.

2. Preparazione di fiale di vetro

1. Preparare il cibo secondo il protocollo elencato nel passaggio 1.
2. Aliquota 5 ml di cibo in ogni stretta, fiala di vetro, che è la dimensione giusta per i monitor della popolazione. Questa quantità di cibo dovrebbe essere sufficientemente basso da essere sotto l'anello più basso del monitor popolazione.
3. Dopo il cibo si raffredda fino a temperatura ambiente coprire le fiale con tappi spugna sé a 4 ° C per 2 settimane. Poiché la quantità di cibo in un flaconcino è piuttosto bassa, è meglio usare il cibo entro una settimana o due per evitare l'essiccazione.
4. Riscaldare le fiale a temperatura ambiente prima dell'uso.

3. Manutenzione delle mosche genitori

1. Far crescere le mosche in fiale di plastica larghe con prodotti alimentari di laboratorio standard e di conservare le fiale in una umidificata, camera ambientale a temperatura controllata a 25 ° C su una 12 ore di luce / buio ciclo. Il periodo di luce diurna inizia alle 06:00 in questo laboratorio.
2. In mattinata chiara adulto vola dai flaconi da cui verranno raccolti mosche parentali.
3. Raccogliere flie nuova ecloseds e separarli per sesso su un tappetino di CO ₂ entro 8 ore dopo eclosion per assicurarsi che le mosche femminili sono vergini. Le mosche iniziano ad accoppiarsi 8 ore dopo eclosion.
4. Quando le mosche maschio e femmina vergine sono tra 5 e 10 giorni di età, mettere 10 maschi e 10 femmine mosche in un flaconcino con cibo standard e diversi granelli di lievito attivo sulla parte superiore.
   Nota: controllare la densità delle larve utilizzando lo stesso numero di mosche e tenerli in una fiala per due giorni. Aggiunta di lievito attivo favorisce la produzione di uova.
5. Mantenere in linea per accoppiarsi e deporre le uova in una camera climatica a temperatura controllata a 25 ° C con 12 ore di luce / buio ciclo per 2 giorni. Impostare 5-10 fiale di mosche genitori.
6. Passare in linea per un nuovo flacone di plastica ogni altro giorno e mantenere le fiale con le uova in un incubatore a 25 ° C.

4. Raccolta di mosche sperimentali

1. Dopo nove giorni in linea inizieranno a Eclose dai flaconi dove il parentaL mosche uova (di cui al punto 3.6.) previste. Chiaro e scartare le mosche che eclosed durante il primo giorno e ritorno le fiale da incubatrice. La maggior parte delle mosche eclosed il giorno 1 sono femmine. Una popolazione più sincronizzata delle mosche si Eclose il giorno 2.
2. Entro 24 ore posto in linea di nuova eclosed di CO ₂ pad e raccogliere 25 maschili e 25 femminili in linea per flaconi con un pennello o un cucchiaio di metallo. Tenere mosche sulla CO ₂ pastiglie per un breve periodo di tempo per ridurre al minimo gli effetti di CO _2. Annotare il giorno della eclosion sul flacone. Montare almeno 5 flaconi replicati a fini sperimentali o per gruppi di controllo.
3. Tenere i flaconcini in camere climatiche a temperatura controllata a 25 ° C con 12 ore di luce / buio ciclo.
4. Passare in linea per un nuovo flacone di plastica ogni altro giorno usando un imbuto.
5. Età linea fino a raggiungere l'età desiderata per la sperimentazione.

5. Impostazione dei monitor di mobilità

1. Posizionare ildella popolazione controlla in un incubatore a temperatura controllata.
2. Collegare ogni monitor con un cavo telefonico a 4 fili per l'unità di interfaccia di alimentazione (PSIU) via splitter 5-vie (multilinea), che possono collegare fino a cinque monitor individuali per una apertura nel PSIU. Vedere le Figure 1A e 2B.
3. Collegare il PSIU ad una presa di corrente di linea (100-240 V). Collegare il connettore di uscita dell'alimentatore in una delle prese PSIU 2 di accoppiamento. La luce verde adiacente si illumina di verde quando è collegato correttamente.
4. Collegare il PSIU all'hardware (USB) Universal Serial Bus. Collegare il cavo USB tra l'hardware USB con un Macintosh o un PC Windows per la registrazione dei dati. Sarebbe meglio avere un computer dedicato solo per la raccolta dei dati, poiché la raccolta funziona per giorni alla volta.
5. Scaricare il software USB (PSIUdrivers.zip). Software del driver USB viene utilizzato dall'interfaccia alimentazione e deve essere scaricato solo una volta. Si sintetizza uncollegamento dati tra il programma di computer e monitor PSIU / attività. Per un uso PC una porta COM e per un Macintosh utilizzano una porta seriale semplice.
6. Scarica il programma informatico per Macintosh OSX (Intel) o per PC Windows (XP/Vista/7) Programmi seguendo le istruzioni fornite dal fabbricante Notes 308.pdf.
7. Avviare il programma di computer e impostare il programma cliccando sulle preferenze, luci e monitor. Il programma verrà eseguito fino a quando l'utente seleziona "quit" per fermare il programma. Se il programma del computer o il computer è spento il monitor continuerà a contare le interruzioni del fascio, ma i conti non saranno registrati fino a quando il programma viene rilanciato. In questo caso la prima lettura comprenderà tutti i conteggi dall'ultima volta l'PSIU inviato i dati al computer.
8. Selezionare la scheda Preferenze e selezionare la porta seriale, PSIU per Macintosh e COM per il PC.
9. Selezionare l'intervallo di lettura che va da pochi secondi, minuti o un'ora.
10. Seleziona i monitor: Ogni monitor dispone di un numero unico che viene dato dal produttore. Selezionare l'intervallo di monitor che corrisponde ai numeri riportati ai monitor dal costruttore.
11. La scatola Lights: Assicurarsi che tutti i monitor siano collegati correttamente, che è contrassegnato da una luce verde accanto al numero di monitor sul software. Una luce rossa indica che la connessione è persa, e una scatola nera indica che il sistema è spento o non correttamente configurato.

6. Impostazione dell'esperimento

1. Rimuovere le fiale di vetro contenenti alimenti da 4 ° C e lasciare al caldo a temperatura ambiente.
2. Separare le mosche maschio e femmina della stessa età sulle emissioni di CO ₂ pad. Per gli studi di invecchiamento è possibile iniziare gli studi di mobilità fin da 3 giorni di età.
3. Mettere 10 maschile o 10 mosche femmine in ogni fiala di vetro contenente cibo. Utilizzare almeno tre fiale per ogni linea sperimentale e di controllo delle mosche e per ogni genere.
4. Tenere il vials dalla loro parte fino in linea recuperano da CO ₂ al fine di garantire le mosche non rimanere bloccati nel cibo. Mosche separate a circa 8:00 e lasciare per circa 2 ore a temperatura ambiente per recuperare da CO _2.
5. Porre i flaconi all'interno dei monitor popolazione alloggiati nelle incubatrici.
6. Eliminare i dati raccolti entro le prime 24 ore dopo le mosche sono messi in incubatrice per far loro adattarsi al nuovo ambiente.
7. Passare linea dopo 3 o 4 giorni per nuovi flaconi per evitare l'essiccamento del cibo. Se le mosche sono inclini a morte o sono l'età 40 giorni o più, passare le mosche dopo 2 giorni e utilizzare i dati raccolti per giorno 2. Inoltre, utilizzare più di tre fiale per gruppo per garantire repliche adeguate. I dati provenienti da fiale con mosche morte deve essere ignorata e non inclusi nell'analisi.

7. Esecuzione dei monitor di attività e calcolo del Total attività spontanea

1. Selezionare le preferenze - l'intervallo per la raccolta dei dati <.br /> Nota: Il programma informatico permette la raccolta dei dati a intervalli che vanno da 1 secondo a 60 minuti. 10 e 30 periodi minuti sono stati trovati a fornire informazioni adeguate sulla mobilità senza avere un numero enorme di punti temporali. Al periodo di tempo selezionato, il programma invierà il conteggio totale corrente per ogni monitor al computer e cominciare a contare di nuovo da zero. Il programma per computer memorizza i dati in una nuova cartella creata dal sistema dati informatici. I dati raccolti in ogni monitor vengono memorizzate separatamente, e documenti di testo individuali vengono creati per ogni flacone. I dati raccolti vengono continuamente fino a quando il programma opera.
2. Alla fine dell'esperimento, la scansione dei dati utilizzando la FileScan110X per Macintosh OSX (Intel) o SystemMB108 per il programma PC Windows (XP/Vista/7).
   Nota: Il programma Scan elimina le letture duplicate e fa in modo che le registrazioni sono complete.
3. Salvare i dati raccolti in un tempo specifico e periodo di giorni. Scegliere un nome sperimentale e copiare i file dalla cartella dati del computer per l'analisi.
   Nota: A questo punto, gli intervalli di attività possono essere modificati e convertiti in altri differenti. I dati originali rimarranno memorizzati nella cartella dei dati del computer e possono essere recuperati fino a quando non vengono eliminati.

8. Analisi dei dati

1. Copiare i dati raccolti nelle file di testo in colonne di fogli di calcolo Excel per l'analisi dei dati. I dati raccolti da questo software sono in colonne che contengono numeri che rappresentano attività totale in un unico monitor per un periodo di tempo selezionato dallo sperimentatore.
   Nota: I dati raccolti per ogni monitor sono in file di testo separati. Ci sono 32 colonne per ogni monitor. Le prime sei colonne sono vuote e contengono solo 0; prossimi tre contengono i dati raccolti presso l'anello inferiore, al centro, e l'anello superiore. Il resto dei canali può essere eliminato in quanto non contengono dati. Ogni anello emette ununico valore per volta. Vedi schermata dei dati grezzi in figura 2.
2. Calcolare l'attività totale entro un periodo di tempo desiderato per ogni monitor che rappresenta la somma delle attività di raccolta a tre diverse altezze di raggi infrarossi.
   Nota: Il periodo di tempo può variare da alcune ore, 24 ore o diversi giorni.
3. Determinare l'attività locomotoria media e la deviazione standard tra i 3 monitor che rappresentano tre repliche biologiche.
   Nota: I dati possono essere analizzati per la significatività statistica utilizzando una serie di test. T-test di studenti a due code, una analisi a senso unico della varianza (ANOVA) e un test post-hoc Tukey HSD potrebbero essere utilizzati per determinare gli effetti di diverse manipolazioni ambientali o genetici su 24 ore di attività locomotoria spontanea ^16. Ci sono un certo numero di altri programmi che possono essere utilizzati e sono stati pubblicati in precedenza ^17.

Risultati

L'attività locomotoria spontanea in Drosophila dipende fly genere (Figura 3A), il contenuto calorico del cibo (Figura 3B) e il ciclo luce / buio. Una volta che la luce è spenta attività mosca diminuisce drasticamente. Figura 3A mostra 24 ore di registrazioni di attività locomotoria di mosche maschili e femminili. Un asterisco sul asse x segna il momento in cui la luce era spenta e la transizione al ciclo di buio. Figura 3B illustr...

Discussione

Attività locomotoria spontanea di mosche è influenzato da molti fattori quali l'età, background genetico, e di genere ^2,13,18,19. Inoltre, fattori ambientali come il contenuto calorico del cibo, temperatura dell'ambiente, l'aggiunta di diversi farmaci, e il giorno / notte ciclo di luce possono influenzare l'attività mosca. Per esempio, mosche maschio della stessa età hanno una maggiore attività fisica spontanea rispetto alle femmine (Figura 1). Pertanto, in linea della s...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sucrose FCC Food Grade 100 LB,	Fisher Scientific MP Biomedicals	ICN90471380
Brewer’s Yeast	Fisher Scientific MP Biomedicals	ICN90331280
Drosophila Agar Fine	SciMart	DR-820-25F
Cornmeal	Fisher Scientific MP Biomedicals	ICN90141125
Methyl4-hydroxybenzoate, tegosept	Sigma	H5501-5KG
EtOH	Pharmco-AAPER	111000200
Active Dry Yeast	Fisher Scientific	ICN10140001
Fly CO2 pad	LabScientific	BGSU-7
Stereo Microscope	Olympus	SZ40
Drosophila carbon dioxide (CO2) tank	Airgas	UN1013
Small paint brush for pushing the flies
Shell vial wide	Fischer Scientific	AS519
Buzzplugs for wide plastic vials	Fischer Scientific	AS275
Glass vials (25 x 95 mm)	Fischer Scientific Kimble 60931-8	AS-574
Sponge plugs for glass vials	SciMart	DR-750
Drosophila Food Dispenser	Applied Scientific (Fischer Scientific)	AS780Q
DPM Drosophila Population Monitor	Trikinetics Inc.
DC Power Supply with line cord	Trikinetics Inc.
PSIU9 The Power Supply Interface Unit	Trikinetics Inc.
Telephone cables and 5 way splitters	Trikinetics Inc.
Universal Serial Bus (USB) hardware	Trikinetics Inc.
Macintosh or Windows PC with UCB port
DAMSystem308X Data Acquisition Software for Macintoch OSX (Intel)	www.trikinetics.com
DAMSystem308 Data Acquisition Software for Windows PC (XP/Vista/7)	www.trikinetics.com
[header]
DAMFileScan108X software for Macintosh	www.trikinetics.com
DAMFileScan108X software for Windows PC (XP/Vista/7)	www.trikinetics.com
USB software (PSIUdrivers.zip)	www.trikinetics.com
DAMSystem Notes 308	(http://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Notes%20308.pdf