Determinação da atividade locomotora espontânea em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Resumo

Drosophila melanogaster são úteis no estudo de manipulações genéticas ou ambientais que afetam comportamentos, como a atividade locomotora espontânea. Aqui nós descrevemos um protocolo que utiliza monitores com raios infravermelhos e software de análise de dados para quantificar a atividade locomotora espontânea.

Resumo

Drosophila melanogaster tem sido usada como um excelente modelo para estudar organismo manipulações ambientais e genéticos que afectam o comportamento. Um tal comportamento é a atividade locomotora espontânea. Aqui nós descrevemos o nosso protocolo que utiliza Drosophila monitores da população e um sistema de rastreamento que permite o monitoramento contínuo da atividade locomotora espontânea de moscas por vários dias de cada vez. Este método é simples, fiável, e objectiva e pode ser usado para examinar os efeitos do envelhecimento, o sexo, as alterações no teor calórico dos alimentos, a adição de drogas, ou manipulações genéticas que imitam doenças humanas.

Introdução

As moscas de fruta, Drosophila melanogaster, têm sido usadas como um organismo valioso modelo para estudar mecanismos subjacentes comportamentos complexos, tais como a aprendizagem ea memória, a interação social, agressão, abuso de drogas, o sono, a função sensorial, corte e acasalamento ^1,2. Um comportamento que tem sido estudada através de vários protocolos é a atividade locomotora espontânea. Geotaxis negativo foi um dos primeiros métodos desenvolvidos para medir a actividade de Drosophila, e este protocolo envolve a medição da percentagem de moscas que atingem uma certa altura do frasco depois de moscas foram agitados para o fundo do recipiente de ^1,3. Este método tem as vantagens de ser simples, barato, e uma vez que não requer qualquer equipamento especial que pode ser realizado em qualquer laboratório. Ela tem sido utilizada como uma ferramenta de rastreio valiosa para estudar os efeitos das diferentes manipulações genéticas em mobilidade mosca ^3. No entanto, é tempo e trabalho intensivo umnd tem a possibilidade de viés devido a agitação variável dos frascos e gravações humanos.

O método geotaxis negativo foi melhorado pelo desenvolvimento do método negativo rápida iterativo geotaxis (ANEL) ^{de 4,5,} o que tira fotografias dos frascos mosca seguintes agitação das moscas para o fundo. A vantagem deste protocolo é a sua sensibilidade e a possibilidade de testar um grande número de frascos de moscas, ao mesmo tempo. No entanto, este protocolo ainda tem o potencial de erro humano, e só mede geotaxis negativos. Outros laboratórios têm utilizado a simples observação em frascos de cultura para determinar a atividade locomotora ^6.

Recentemente foram desenvolvidos vários sistemas de gravação de vídeo para medir a atividade locomotora mosca. Um protocolo de monitoramento de vídeo fornece tempo para ajuste antes de gravar ^7. O método descrito por Slawson et al. Também utiliza um impulso de ar para parar movement até o início da gravação, o que poderia ser um potencial estressor para os animais ^7. Este método fornece informações sobre a velocidade média, velocidade máxima, tempo gasto em movimento, etc Outro sistema de rastreamento tridimensional mede a velocidade máxima de moscas individuais durante ~ 0,2 segundo de decolagem de vôo livre ^8. Um protocolo de monitoramento de vídeo tridimensional utiliza moscas expressando GFP e múltiplas câmeras equipadas com filtros que permitam a detecção de fluorescência para determinar a mobilidade mosca ^9. Moscas neste protocolo tendem a exibir padrões de voo cilíndricas, que é, potencialmente, devido à forma da cultura de Drosophila frascos ^10. Este método foi melhorado através da utilização de uma cúpula, que permite medir o movimento espontâneo de duas moscas ^11. Um método de alto rendimento que utiliza uma câmara para monitorizar e quantificar o comportamento individual e social da Drosophila automaticamente tem sido também descrito ^12. Zou etal. desenvolveu um sistema de monitoramento comportamental (BMS) que usa duas câmeras assistidas por computador para registrar o comportamento e movimentos como o descanso da vida, movimento, voando, comendo, bebendo, ou morte de frutas tefritídeos indivíduo voa ^13. Vários outros sistemas de vídeo têm sido desenvolvidas para monitorizar mosca actividade comportamental ^14,15.

Aqui nós descrevemos um método para quantificar atividade Drosophila que utiliza monitores população. Estes monitores estão alojados em incubadoras-e temperatura controlados por humidade a 25 ° C num ciclo de 12 horas de luz do dia-noite. Cada monitor população tem raios infravermelhos colocados em anéis posicionados em três alturas diferentes. Toda vez que uma mosca se move através dos anéis interrompe o feixe de infravermelho, que é gravado por um microprocessador que, independentemente registros e conta a atividade de moscas dentro do frasco. Um microprocessador carrega a actividade total dentro do frasco para o computador em interva definido pelo usuáriols que pode variar de 1 segundo a 60 minutos. O método descrito aqui fornece um amplo tempo para moscas para se adaptar ao novo ambiente e permite a medição simultânea da atividade locomotora espontânea de até 120 populações de moscas. Além disso, descrevemos a preparação dos alimentos, manutenção voar, configurar os monitores de mobilidade da população em incubadoras de temperatura controlada, e os fatores potenciais que podem afetar os resultados. Este método pode ser usado para estudar como diferentes modificações ambientais ou genéticos afectar a actividade locomotora espontânea das moscas.

Protocolo

Nota: A tensão Canton-S é a linha de fundo do tipo selvagem padrão obtido a partir da Bloomington Stock Center.

1. Preparação de Alimentos e Receita para 1000 ml de Alimentos

Nota: Esta seção descreve o protocolo para a preparação de alimentos. Grandes vasos de metal são usados ​​para preparar cerca de 18 litros de alimento de cada vez. O protocolo aqui descrito é reduzido e utiliza 1,000 ml de H ₂ O. A comida é autoclavado duas vezes.

1. Misture 113 g de sacarose e 28 g levedura de cerveja em 643 ml de água. Deixe os ingredientes em um conjunto de placa quente a 25 ° C, com uma barra de agitação para misturar ao longo de 15 minutos.
2. Solução alimentar Autoclave por 20 min.
3. Misture 49 g de farinha de milho e 8,1 g de ágar em 268 ml de água e adicione à mistura de alimentos autoclavados descrito no passo 1.2. Misture bem com uma colher grande ou um batedor.
4. Mistura comida Autoclave por mais 20 min.
5. Coloque a comida em um prato e deixe esfriar com mistura constante com uma barra de agitação. Euf soluções adicionais deve ser adicionado a um alimento, tais como mifepristona (RU486), manter o alimento em uma placa quente até a 60 ° C e adicionar solução quando a comida atinge a temperatura desejada.
6. Dissolver 2,4 g tegosept em 10,7 ml 100% EtOH e manter em um prato frio com um agitador para dissolver completamente e misture por cerca de 15 min.
7. Adicionar solução tegosept para alimentos, quando a temperatura de alimentação é de 60 ° C e misture bem.
8. Use uma bomba ou um distribuidor de alimentos para servir cerca de 10 ml de alimento para uma grande frasco. Por utilizando um dispensador de alimentos pode-se derramar comida simultaneamente em 100 de largura, frascos de plástico (1 bandeja) de cada vez.
9. Cubra os tubos com Kimwipes e pano de queijo e deixar os alimentos à temperatura ambiente durante 12-24 horas para esfriar. Manter a comida, a 4 ° C e utilizar no prazo de 3-4 semanas. Aquecer os alimentos a temperatura ambiente antes do uso para o trabalho real.

2. Preparação de frascos de vidro

1. Preparar alimentos de acordo com o protocolo listados na etapa 1.
2. Alíquota de 5 ml de alimento em cada um, frasco de vidro estreito, que é o tamanho correto para os monitores da população. Esta quantidade de alimentos deve ser baixa o suficiente para ser abaixo do anel inferior do monitor população.
3. Após a comida arrefece até à temperatura ambiente cobrir os frascos com tampões de esponja e mantê-los a 4 ° C durante até 2 semanas. Porque a quantidade de alimentos num frasco, é bastante baixo, é melhor usar o alimento dentro de uma ou duas semanas, para evitar qualquer secagem.
4. Aqueça os frascos à temperatura ambiente antes do uso.

3. Manutenção das Moscas dos Pais

1. Crescer as moscas em frascos de plástico de largura, com comida padrão de laboratório e manter os frascos em uma câmara humidificada ambiente de temperatura controlada a 25 ° C num ciclo claro / escuro de 12 horas de luz. O período de luz do dia começa às 06h00 neste laboratório.
2. Na parte da manhã adulto claro voa a partir dos frascos de que moscas parentais serão coletados.
3. Colete flie recém ecloseds e separá-los por sexo em uma almofada CO ₂ dentro de 8 horas após a eclosão ter certeza de que as moscas fêmeas são virgens. Moscas começar a acasalar 8 horas após a eclosão.
4. Quando a Virgem masculino e feminino moscas são entre 5 e 10 dias de idade, colocar 10 machos e 10 fêmeas moscas em um frasco com ração padrão e alguns grânulos de levedura ativa na parte superior.
   Nota: controlar a densidade das larvas usando o mesmo número de moscas e mantendo-os em um frasco, durante dois dias. A adição de levedura ativa promove a produção de ovos.
5. Mantenha as moscas para acasalar e botar ovos em uma câmara ambiental com temperatura controlada a 25 ° C com um ciclo claro / escuro de 12 horas de luz por 2 dias. Configure 5-10 frascos de moscas parentais.
6. Passar as moscas para um novo frasco de plástico em dias alternados e manter os tubos de ensaio com os ovos numa incubadora, a 25 ° C.

4. Coleta de moscas experimentais

1. Após 9 dias moscas começará a EFeche dos frascos onde a parental moscas posto ovos (descritos no passo 3.6.). Limpar e descartar as moscas que eclosed durante o primeiro dia e devolver os frascos à incubadora. A maioria das moscas eclosed no dia 1 são as fêmeas. Uma população mais sincronizado de moscas vai EFeche no dia 2.
2. Dentro de 24 horas lugar moscas recém eclosed sobre CO ₂ almofadas e recolher 25 do sexo masculino e 25 do sexo feminino moscas por frascos com um pincel ou uma colher de metal. Mantenha moscas em CO ₂ almofadas por um curto período de tempo para minimizar os efeitos de CO _2. Anote o dia da eclosão no frasco. Montar pelo menos 5 frascos replicados para fins experimentais e para os grupos de controle.
3. Manter os frascos em câmaras climáticas com temperatura controlada a 25 ° C com um ciclo claro / escuro de 12 horas de luz.
4. Passar as moscas para um novo frasco de plástico todos os outros dias, utilizando um funil.
5. Envelhecemos as moscas até a idade desejada para a experimentação é atingido.

5. Configurando os monitores de Mobilidade

1. Coloque apopulação monitora numa incubadora de temperatura controlada.
2. Conecte cada monitor com um cabo telefônico de 4 fios para a Unidade de Alimentação Interface (PSIU) via divisores de 5 vias (multi-linha), o que pode ligar até 5 monitores individuais para uma abertura no PSIU. Ver Figuras 1A e 2B.
3. Conecte o PSIU a uma tomada de linha (100-240 V). Conecte o conector de saída da fonte de alimentação em uma das duas tomadas de Psiu acasalamento. A luz verde adjacente acende verde quando conectado corretamente.
4. Conecte o PSIU à (USB) Universal Serial Bus hardware. Conecte o cabo USB entre o hardware USB com um Macintosh ou um PC com Windows para a gravação de dados. Seria melhor ter um computador dedicado apenas para a coleta de dados desde coleção corre para os dias de cada vez.
5. Faça o download do software USB (PSIUdrivers.zip). Software do driver USB é usado pela interface de alimentação e precisa ser baixado apenas uma vez. Ele sintetiza umligação de dados entre o programa de computador e os monitores PSIU / actividade. Para uma utilização PC uma porta e por um Macintosh usar uma porta serial simples.
6. Faça o download do programa de computador para Macintosh OSX (Intel) ou para Windows PC programas (XP/Vista/7), seguindo as instruções fornecidas pelo fabricante Notas 308.pdf.
7. Inicie o programa de computador e configurar o programa, clicando em Preferências, luzes ou monitores. O programa será executado até que o usuário seleciona "quit" para parar o programa. Se o programa de computador ou o computador é desligado os monitores vão continuar a contar as interrupções do feixe, mas a contagem não será gravado até que o programa é re-lançado. Nesse caso, a primeira leitura irá incluir todas as contagens desde a última vez que o PSIU enviados os dados para o computador.
8. Selecione a guia Preferences e escolha a porta serial, PSIU para Macintosh e COM para o PC.
9. Selecione o intervalo de leitura que varia de segundos, minutos ou uma hora.
10. Selecionar os monitores: Cada monitor tem o seu número exclusivo que é dada pelo fabricante. Selecione a Faixa de monitor que corresponde aos números dados aos monitores pelo fabricante.
11. A caixa de Luzes: Certifique-se que todos os monitores estão conectados corretamente, que é marcado por uma luz verde ao lado do número do monitor sobre o software. A luz vermelha indica que a conexão for perdida, e uma caixa preta indica que o sistema está desligado ou mal configurado.

6. Configurando o Experimento

1. Remova frascos de vidro contendo alimentos de 4 ° C e deixe-os aquecidos à temperatura ambiente.
2. Moscas machos e fêmeas separados da mesma idade em CO ₂ pad. Para os estudos de envelhecimento, é possível iniciar estudos de mobilidade nos primeiros 3 dias de idade.
3. Coloque 10 do sexo masculino ou 10 moscas fêmeas em cada frasco de vidro contendo alimentos. Utilize pelo menos três frascos para cada linha experimental e controle de moscas e para cada gênero.
4. Mantenha o vials do seu lado até que as moscas se recuperar de CO ₂ para garantir que as moscas não ficar preso no alimento. Moscas separadas em cerca de 8:00 e deixá-los durante cerca de 2 horas à temperatura ambiente, para se recuperar a partir de CO _2.
5. Colocar os tubos no interior dos monitores população alojados nas incubadoras.
6. Descarte os dados coletados nas primeiras 24 horas após as moscas são colocadas na incubadora para que eles se ajustar ao novo ambiente.
7. Passar as moscas após 3 ou 4 dias para novos frascos para evitar a secagem do alimento. Se moscas são propensas a morte ou idade são 40 dias ou mais, passar as moscas após 2 dias e utilize os dados coletados para o dia 2. Além disso, use mais de três frascos de cada grupo para garantir repetições adequadas. Dados de frascos com moscas mortas deve ser desconsiderada e não incluídos na análise.

7. Executando os monitora a atividade e cálculo da actividade espontânea total

1. Selecione preferências - o intervalo de coleta de dados <.br /> Nota: O programa de computador permite a coleta dos dados em intervalos que variam de 1 segundo a 60 minutos. 10 e 30 minutos períodos foram encontrados para fornecer informações adequadas sobre a mobilidade sem ter um número esmagador de pontos no tempo. No período de tempo selecionado, o programa irá enviar a contagem total de corrente para cada monitor para o computador e começar a contar novamente a partir de zero. O programa de computador armazena os dados em uma nova pasta criada pelo sistema de dados de computador. Os dados coletados em cada monitor são armazenados separadamente, e documentos de texto individuais são criados para cada frasco. Os dados são recolhidos continuamente, desde que o programa de funcionamento.
2. No final do experimento, verificar os dados usando o FileScan110X para Macintosh OSX (Intel) ou SystemMB108 programa do Windows PC (XP/Vista/7) para.
   Nota: O programa de digitalização elimina leituras em duplicado e garante que as gravações estão completos.
3. Salve os dados coletados dentro de um prazo específico e período de dias. Escolha um nome de experimental e copiar os arquivos da pasta de dados de computador para análise.
   Nota: Neste momento, os intervalos de actividade pode ser alterada e convertida em diferentes. Os dados originais permanecerão armazenados na pasta de dados do computador e pode ser recuperado, enquanto eles não são excluídos.

8. Data Analysis

1. Copie os dados coletados nos arquivos de texto em colunas de planilhas do Excel para análise de dados. Os dados recolhidos por este software estão em colunas, que contêm os números que representam a actividade total de um único monitor durante um período de tempo seleccionado pelo investigador.
   Nota: Os dados coletados para cada monitor em arquivos de texto separados. Há 32 colunas para cada monitor. As primeiras seis colunas estão vazias e apenas conter 0; próximos três contêm os dados coletados para o anel inferior, no meio, e no anel superior. O resto dos canais podem ser excluídos, uma vez que não contêm dados. Cada anel gera umvalor único por vez. Ver captura de tela dos dados brutos em Figura 2.
2. Calcula-se a actividade total dentro de um período de tempo desejado para cada monitor que representa a soma da actividade recolhida em três alturas diferentes de raios infravermelhos.
   Nota: O período de tempo pode variar desde várias horas, 24 horas ou vários dias.
3. Determinar a actividade locomotora média e o desvio padrão entre os três monitores que representam três réplicas biológicas.
   Nota: Os dados podem ser analisados ​​para significado estatístico usando um número de testes. Um teste t de duas caudas dos estudantes, uma análise one-way de variância (ANOVA) eo teste de post-hoc Tukey HSD poderia ser usado para determinar os efeitos de várias manipulações ambientais ou genéticos em 24 horas de atividade locomotora espontânea ^16. Há um certo número de outros programas que podem ser utilizados e têm sido publicados ^17.

Resultados

A atividade locomotora espontânea em Drosophila depende sexo mosca (Figura 3A), o conteúdo calórico dos alimentos (Figura 3B) e ciclo claro / escuro. Uma vez que a luz é desligada atividade mosca diminui drasticamente. Figura 3A ilustra de 24 horas de gravações de moscas machos e fêmeas de atividade locomotora. Um asterisco no eixo x marca o momento em que a luz foi desligada ea transição para o ciclo escuro. Figura 3B ilustra o ...

Discussão

Atividade locomotora espontânea de moscas é influenciado por muitos fatores, como idade, antecedentes genéticos e sexo ^2,13,18,19. Além disso, os factores ambientais tais como o teor calórico dos alimentos, a temperatura do meio, a adição de diversos fármacos, e dia / noite ciclo de luz pode afectar a actividade da mosca. Por exemplo, moscas macho da mesma idade têm uma maior atividade física espontânea entre mulheres (Figura 1). Portanto, as moscas da mesma idade e sexo devem ser ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sucrose FCC Food Grade 100 LB,	Fisher Scientific MP Biomedicals	ICN90471380
Brewer’s Yeast	Fisher Scientific MP Biomedicals	ICN90331280
Drosophila Agar Fine	SciMart	DR-820-25F
Cornmeal	Fisher Scientific MP Biomedicals	ICN90141125
Methyl4-hydroxybenzoate, tegosept	Sigma	H5501-5KG
EtOH	Pharmco-AAPER	111000200
Active Dry Yeast	Fisher Scientific	ICN10140001
Fly CO2 pad	LabScientific	BGSU-7
Stereo Microscope	Olympus	SZ40
Drosophila carbon dioxide (CO2) tank	Airgas	UN1013
Small paint brush for pushing the flies
Shell vial wide	Fischer Scientific	AS519
Buzzplugs for wide plastic vials	Fischer Scientific	AS275
Glass vials (25 x 95 mm)	Fischer Scientific Kimble 60931-8	AS-574
Sponge plugs for glass vials	SciMart	DR-750
Drosophila Food Dispenser	Applied Scientific (Fischer Scientific)	AS780Q
DPM Drosophila Population Monitor	Trikinetics Inc.
DC Power Supply with line cord	Trikinetics Inc.
PSIU9 The Power Supply Interface Unit	Trikinetics Inc.
Telephone cables and 5 way splitters	Trikinetics Inc.
Universal Serial Bus (USB) hardware	Trikinetics Inc.
Macintosh or Windows PC with UCB port
DAMSystem308X Data Acquisition Software for Macintoch OSX (Intel)	www.trikinetics.com
DAMSystem308 Data Acquisition Software for Windows PC (XP/Vista/7)	www.trikinetics.com
[header]
DAMFileScan108X software for Macintosh	www.trikinetics.com
DAMFileScan108X software for Windows PC (XP/Vista/7)	www.trikinetics.com
USB software (PSIUdrivers.zip)	www.trikinetics.com
DAMSystem Notes 308	(http://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Notes%20308.pdf