Technique de porc approvisionnement du foie et la transplantation orthotopique utilisant un Active Porto-Caval Shunt

Résumé

Experimental animal research plays a pivotal role in the development of clinical transplantation practice. The porcine orthotopic liver transplantation model (OLTx) closely resembles human conditions and is frequently used in clinically oriented research. The following protocol contains all information for a reliable porcine OLTx model using an active porto-caval-jugular shunt.

Résumé

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. Each year, a considerable number of patients on the liver transplantation waiting list die without receiving an organ transplant or are delisted due to disease progression. Even after a successful transplantation, rejection and side effects of immunosuppression remain major concerns for graft survival and patient morbidity.

Experimental animal research has been essential to the success of liver transplantation and still plays a pivotal role in the development of clinical transplantation practice. In particular, the porcine orthotopic liver transplantation model (OLTx) is optimal for clinically oriented research for its close resemblance to human size, anatomy, and physiology.

Decompression of intestinal congestion during the anhepatic phase of porcine OLTx is important to guarantee reliable animal survival. The use of an active porto-caval-jugular shunt achieves excellent intestinal decompression. The system can be used for short-term as well as long-term survival experiments. The following protocol contains all technical information for a stable and reproducible liver transplantation model in pigs including post-operative animal care.

Introduction

Transplantation hépatique (OLTx) est la seule option de traitement pour les patients atteints d'une maladie du foie en phase terminale ou d'un carcinome hépatocellulaire avancé. Pour les 25 dernières années, le nombre de candidats sur la liste d'attente a augmenté progressivement et dépasse de loin le nombre de greffons disponibles. Dans la plupart des régions de la transplantation, de 20 à 30% des patients sur la liste d'attente pour une transplantation du foie meurent sans avoir reçu une greffe d'organe ou sont retirées de la cote en raison de la progression de la maladie. Stratégies visant à accroître le bassin de donneurs et, par conséquent, le nombre de greffons disponibles, sont désespérément nécessaire. Extended critères d'attribution d'organes, prolongée préservation de greffe, et d'induction de la tolérance immunologique représentent toujours des défis majeurs cliniques ^1-3. Par conséquent, la recherche expérimentale OLTx est essentiel afin d'optimiser la pratique OLTx clinique.

Porcine OLTx est un modèle expérimental bien établi qui ressemble OLTx humain dans de nombreuses façons, y compris ltaille de Iver, l'anatomie, la physiologie et ^4-6. Ainsi, il est devenu une méthode expérimentale standard dans des domaines de recherche tels que les techniques chirurgicales, la physiologie, l'immunologie, la préservation, et les lésions d'ischémie-reperfusion. De nombreuses techniques de passation des marchés de la greffe, hépatectomie bénéficiaire, et, en particulier, la reconstruction vasculaire, ont été décrits dans la littérature ^5. Le choix de la technique appropriée varie en fonction de la préférence du chercheur et capacité technique.

Contrairement à la situation humaine, la congestion splanchnique pendant la phase anhépatique représente un problème important dans OLTx porcin. Ischémie intestinale ultérieure et les dommages vasculaires congestive peuvent causer de graves instabilité hémodynamique, mettant en péril la survie de porc et, par conséquent, le succès de l'expérience ^7-9. Par conséquent, la décompression intestinale suffisante est obligatoire, en particulier dans les paramètres expérimentaux techniquement moins raffinés.

Nousing un porto-cave-jugulaire shunt actif pour la durée de la phase anhépatique est une option fiable pour éviter la congestion intestinale. Le système peut être utilisé pour des expériences de reperfusion précoce ainsi que des scénarios de survie à long terme. Le protocole suivant contient toutes les informations pour un modèle de transplantation hépatique stable et reproductible chez les porcs, y compris les donateurs marchés du foie, de l'exploitation bénéficiaire, y compris hépatectomie et techniques de bout-en-bout de reconstruction du navire, et les soins post-opératoires.

Protocole

Tous les animaux ont reçu des soins humains dans le respect des '' Principes de protection des animaux de laboratoire '' formulées par la Société nationale pour le '' Guide pour le soin des animaux de laboratoire »de la recherche médicale et 'publié par les Instituts nationaux de la santé, Ontario, Canada . Le Comité de l'Institut de recherche Toronto General Animal Care approuvé toutes les études.

1. prélèvement d'organes

1. Maison masculins Yorkshire porcs entre 30 et 35 kg dans le centre de recherche pour 1 semaine avant la transplantation pour prévenir une réaction physique induite par le stress (qui peut altérer le résultat de la perfusion ^10,11) et d'acclimater les animaux aux conditions de logement. Jeûner le porc pour un minimum de 6 heures avant l'induction de l'anesthésie.
2. Anesthésier le cochon donneur par une administration intramusculaire (im) d'injection d'un mélange de kétamine (25 mg / kg), l'atropine (0,04 mg / kg), et le midazolam (0,15 mg / kg).
3. Avant l'intubation, assurer le cochon respire spontanément 2 L d'oxygène dosé à 5% d'isoflurane. En position couchée, pulvériser les cordes vocales avec 2% de lidocaïne 2 min avant l'intubation pour éviter des spasmes des cordes vocales. Pour un 35 kg de porc, utiliser un tube de 6,5 Fr trachéale. Bloquer le tube trachéal avec 3 - 5 ml d'air de la pièce.
4. Après l'intubation, utiliser capnométrie pour confirmer correcte intubation. Surveiller la fréquence cardiaque et la saturation en oxygène par oxymétrie de pouls à la queue du cochon. Abaisser le vaporisateur isoflurane à 2%.
   1. Régler la profondeur de l'anesthésie par concentration alvéolaire minimale (MAC) des valeurs; viser 2 à 2,5 MAC. Régler le ventilateur à 14-16 respirations / min et un volume courant de 10 à 15 ml / kg de poids corporel.
5. Passer une 18 G intraveineuse (iv) un cathéter dans une veine de l'oreille pour permettre la perfusion de la solution de lactate de Ringer (200 ml / h). Frotter le porc et le couvrir avec des draps stériles.
6. Après garantir des conditions stériles, faire une laparotomie médiane Follomené par une extension latérale gauche. Utilisez une serviette pour couvrir de grandes et de petites entrailles avant de les déplacer vers le côté gauche.
7. Diviser le ligament falciforme et le ligament triangulaire utilisant un cautère.
8. Relâchez le foie de la membrane sur le côté droit en utilisant un électro-cautérisation; utiliser des ciseaux pour la partie supérieure entre la cave et le diaphragme. Disséquer la veine infrahepatic vers la branche de la veine surrénale sur le côté droit et la veine rénale sur le côté gauche.
9. Séparer la veine infrahepatic aorte distale et de l'autre; ligaturer les branches de l'aorte à la colonne vertébrale; isoler et artères rénales gratuits de tissus adhérents. Entourez chaque artère rénale avec une cravate 2-0.
10. Crânienne à la veine rénale gauche, disséquer l'aorte et l'artère mésentérique. Entourez l'artère mésentérique avec une cravate 2-0.
11. Après l'ouverture du péritoine crânienne à l'artère mésentérique, suivre attentivement l'aorte vers le tronc cœliaque. Disséquer le tronc cœliaque caudale vers le portail vedans; entourer les artères gastriques spléniques et gauche, qui branche arrière hors du tronc cœliaque. Disséquer le tronc cœliaque au large de la veine porte.
12. Relâchez la veine porte par une incision péritonéale entre le pancréas et la veine porte. Nouez veines qui drainent du pancréas à la veine porte.
13. Séparer le conduit de la bile du pédicule hépatique et le diviser distale après la ligature.
14. Ligaturer les vaisseaux lymphatiques au sein de l'épiploon pour empêcher une fuite lymphatique. Diviser l'artère gastro-duodénale et les artères gastriques droite entre les liens. Ligaturer les veines plus petites.
15. Disséquer l'aorte derrière la membrane entre le cœur et tronc cœliaque. Placez une cravate 2-0 autour du crâne aorte au tronc cœliaque.
16. Retirer la vésicule biliaire et cautériser le saignement du lit de la vésicule biliaire.
17. Ouvrez le diaphragme. Administrer 1000 UI / kg de poids du donneur d'héparine intracardiaque ou iv Réglez l'isoflurane à 5% (> 2,5 MAC) afin de parvenir àun niveau d'anesthésie profonde. Pour un donneur après la mort circulatoire (DCD) modèle, provoquer un arrêt cardiaque par injection intracardiaque de 40 mval KCl 3 minutes après l'administration d'héparine. Arrêt cardiaque définir comme point d'ischémie chaude de départ.
18. Nouez les liens déjà établis dans le rénale, splénique, mésentérique, et les artères gastrique gauche. Nouez l'aorte distale entre rénales et les artères iliaques et canuler l'aorte avec un organe ligne de rinçage.
19. Nouez la veine porte en tant proximale que possible et canuler avec un autre organe ligne de rinçage.
20. Après la fermeture de la pré-set cravate autour de l'aorte proximale, rincer le foie avec 2 L de l'Université du Wisconsin à froid (UW) solution en utilisant double perfusion via aorte (sac de pression) et la veine porte (axée sur la gravité).
21. Exciser le foie, laissant tous les navires restants de long. Laisser un rebord diaphragmatique généreuse autour de la veine sus-hépatique. Placer le foie dans un sac stérile d'organes sur de la glace.
22. Pendant retour table de préparation, clAmpère la veine sus-hépatique en utilisant une pince Satinsky et rincer le foie une deuxième fois avec environ 0,5 L de solution UW rétrograde par la veine cave inférieure inférieure jusqu'à ce que la sortie de la veine porte est clair.
23. Nouez toutes les branches artérielles de l'aorte et tronc cœliaque. Effectuez une pression artérielle perfusion back-table avec le 0,5 L restante de la solution UW ^12.
24. Rincer le canal biliaire en utilisant la solution UW.
25. Coupez le patch diaphragmatique à une taille décente. Fermez toutes les veines phréniques - habituellement de 3, 1 chacun gauche et à droite, et 1 postérieure - en utilisant 4-0 points de suture monofilament de polypropylène.
26. Fermez le sac d'organes et de stocker le foie sur de la glace.

2. Bénéficiaire hépatectomie

1. Anesthésier le cochon receveur par une injection im d'un mélange de kétamine (25 mg / kg), l'atropine (0,04 mg / kg), et le midazolam (0,15 mg / kg).
2. Placez le porc en position couchée sur une table chirurgicale sur le dessus d'un tapis chauffant. Couvrir le wi de porcth une couverture thermique à circulation.
3. Avant l'intubation, assurer le cochon respire spontanément 2 L d'oxygène dosé à 5% d'isoflurane. Vaporiser les cordes vocales avec 2% de lidocaïne 2 min avant l'intubation pour éviter des spasmes des cordes vocales. Pour un 35 kg de porc, utiliser un tube de 6,5 Fr trachéale. Bloquer le tube trachéal avec 3 - 5 ml d'air de la pièce.
4. Après l'intubation, utiliser capnométrie pour confirmer correcte intubation. Surveiller la fréquence cardiaque et la saturation en oxygène par oxymétrie de pouls à la queue du cochon. Placez et fixer une sonde de température dans le museau du porc. Abaisser le vaporisateur isoflurane à 2% (viser 2 à 2,5 MAC). Régler le ventilateur à 14-16 respirations / min et un volume courant de 10 à 15 ml / kg de poids corporel.
5. Utilisez pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
6. Utiliser une technique Seldinger ¹³ pour insérer un inducteur de la gaine (8,5 Fr) dans la veine jugulaire externe gauche. Utilisez ce cathéter plus tard pour un portail-cave-jugulaire dérivation active.
7. Utilisez Seldinger technique pour insérer une nutrition parentérale totale (NPT) cathéter totale (9,5 Fr) dans la veine jugulaire externe droite.
8. Dans des conditions stériles, disséquer l'artère carotide droite et insérer un cathéter de polypropylene (18 g) pour la surveillance invasive de la pression artérielle. Entourez l'artère avec une cravate de soie 2-0 pour permettre la ligature d'urgence.
9. Baissez le vaporisateur isoflurane à 1% (de 1,5 à 2 MAC) et ajouter propofol (5-8 mg / kg / h iv) de maintenir la profondeur de l'anesthésie. Pour l'analgésie, utilisez continue perfusion intraveineuse de citrate de fentanyl (plus préféré, 2 pg / kg / h) ou rémifentanil (deuxième choix, 15 ug / kg / h).
10. Avant incision de la peau, donner 1 000 mg de céfuroxime et 500 mg de métronidazole iv. Mettre en place une pompe à perfusion en utilisant le lactate de Ringer glucose à 5% à 150 ml / h.
11. Placez la couverture de chaleur circulant sur la région de la tête et du cou. Frotter le porc et le couvrir avec des draps stériles.
12. Dans des conditions stériles, faire une laparotomie médiane. Insérez une r abdominaleetractor pour obtenir un accès suffisant à le quadrant supérieur droit.
13. Diviser le ligament falciforme et le ligament triangulaire utilisant la cautérisation.
14. En plusieurs étapes, il faut diviser le ligament hépato proche du foie entre les liens. Identifier, diviser, et marquer les branches de la conduite de l'artère et de la bile hépatique.
15. Disséquer l'artère hépatique rétrograde jusqu'à ce que la division de l'artère gastro-duodénale. Assurez-vous que une pince bulldog adapte autour de la partie proximale de l'artère hépatique commune à l'artère gastro-duodénale pour serrer plus tard.
16. Libérez la veine porte du tissu adhérent.
17. Mobiliser la veine cave du rétropéritoine sur le côté droit en utilisant un électro-cautérisation. Utilisez des ciseaux pour la partie supérieure entre la cave et le diaphragme. Disséquer la veine infrahepatic vers la branche de la veine surrénale sur le côté droit et la veine rénale sur le côté gauche.
18. Exposer le hile de la rate. Environ à mi-chemin le long de la longueur de la rate, soigneusement claire def l'artère splénique et la veine de couches péritonéale adhéré. Entourez la fois artère splénique et la veine avec 4 2-0 cravates en soie.
19. Insérez une gaine Fr 8,5 inducteur avec 2 trous supplémentaires dans la pointe du cathéter dans la veine splénique, pointant distale vers la veine porte. Fixer le cathéter de manière distale pour son insertion avec l'un des liens 2-0 et fermer la proximale de la veine à l'insertion avec un autre 2-0 cravate. Laissez les 2 autres liens ouverte.
20. Prélever le sang du cathéter, rincer avec 10 ml de solution saline, et fermer la pince du cathéter.
21. Remplir une solution saline dans une dérivation composée d'un chef de la pompe centrifuge, un tube jugulaire (3/16 "), et l'afflux de fois une branche de portail (3/16") et une branche de la veine cave (1/4 ", connecteur Luer Lock sur proximale ouverture). Mettre une pince de tube sur l'extrémité proximale du tube caval.
22. Connectez le portail et l'ouverture jugulaire de la rocade à deux cathéters gaine d'introduction (Figure 1) et sceller la connection avec une bague de collier de serrage métallique. Placez la tête de pompe centrifuge dans sa position de pompe.
23. Donnez 1,000 mg d'acide tranexamique et 10 000 UI d'héparine 3 min iv avant clampage. Réduire le taux de perfusion de propofol à 2 mg / kg / h pendant le temps de la phase anhépatique. Ajuster la concentration d'isoflurane à la pression artérielle et la réactivité du porc.
24. Ouvrez les crochets des deux cathéters introducteurs de gaines et de clampage de la veine porte. Veiller à ce que le sang coule à travers la dérivation passive.
25. Démarrer la pompe centrifuge à environ 1500 tours / min. Continuer clampage si a) le cochon est cardiovascularly stable et b) la dérivation est en cours d'exécution à environ 500 ml / min. Si le cochon ne tolère pas le clampage, le volume substitut (cristalloïdes ou de colloïdes) et des agents de inotropes (noradrénaline dans le petit boli).
26. Croix serrer la veine cave crânienne infrahepatic simplement les veines rénales en utilisant une pince De Bakey-Beck. Appliquer une pression ferme sur les tiss du foieue de faire sortir une partie du sang reste. Croix-serrer la veine cave sus-hépatique, y compris une jante diaphragmatique aide d'une pince Satinsky tout en rétractant le foie caudale.
27. Couper la veine cave sus-hépatique directement à sa frontière pour le tissu hépatique. Ensuite, couper la veine porte près du hile hépatique.
28. Environ 4 cm crânienne de la pince infrahepatic de cava, découper un trou dans la paroi antérieure de la veine cave. Dans ce trou, placer le connecteur de l'ouverture de dérivation »de cave avec le Luer Lock face antérieure.
29. Fixez le connecteur dans la veine infrahepatic avec 1-0 cravates en soie. Ensuite, ouvrez la pince de tube de la branche cave de la rocade.
30. Enfin, ouvrir la veine pince infrahepatic pour permettre une dérivation cave-jugulaire en plus de la dérivation porto-jugulaire existant. Augmenter la vitesse de la pompe à environ 2500 tours / min de telle sorte que l'écoulement de dérivation sur le côté jugulaire est entre 900 - 1100 ml / min.
31. Exciser le foie au reste de son connection crânienne au connecteur de dérivation infrahepatic, veiller à ce que les liens de fixation du raccord de dérivation ne sont pas coupés. Positionner le tube bypass avec précaution pour éviter le vrillage. Donnez 500 mg de méthylprednisolone pour initialiser immunosuppression.

3. la reconstruction du navire

1. Utilisation 4-0 monofilament de polypropylène sutures, fermez toutes les 3 phrénique ostia des veines sur le côté du destinataire à l'ouverture de l'cava sus-hépatique. Piquez sutures en polypropylène double armé 4-0 monofilament intérieur-extérieur dans les deux coins de la veine sus-hépatique sur le côté du destinataire.
2. Retirer le sac de donneur d'organes à partir de la boîte de glace. Ouvrez le sac d'organes, enlever le foie d'un donneur, et le placer dans la cavité abdominale.
3. Pour une anastomose de la veine sus-hépatique de bout en bout, couper la veine sus-hépatique donateurs cava pour tenir du côté du destinataire. En utilisant les aiguilles à l'intérieur des points d'angle de côté des bénéficiaires, faire une piqûre de coin intérieur-extérieur sur chacun des côtés de la suprahcava donneur epatic.
4. Tourné deux extrémités de la droite suture ensemble. Rapprocher les deux ostia du receveur et le donneur cava, puis attacher les deux terminaisons de la suture gauche.
5. Tourné l'extrémité la plus courte et faire une maille à l'extérieur-intérieur de la veine destinataire paroi arrière à côté de la cravate. Courir sur le mur du fond, idéalement éversant les murs de la cave.
6. Ajouter 2-3 points de façade avec le même suture fois le côté droit a été atteint, puis abattu cette suture fin. Exécutez-dessus le mur avant à l'aide de la suture reste du coin gauche. Nouez les deux sutures utilisées pour le dos et les murs avant. Attachez les deux autres terminaisons de suture dans le coin droit.
7. Après le parage de la veine porte des bailleurs de fonds à une longueur appropriée, effectuer une anastomose veine bout-en-bout de la même manière, en utilisant 6-0 monofilament de polypropylène sutures. Peu de temps avant de finir avec la paroi frontale, intuber la lumière de la veine infrahepatic avec une autre ligne de rinçage et débusquer la solution UW avec 1 L de solution salineà la température ambiante par la veine cavaportal infrahepatic.
8. Compléter l'anastomose et nouer les sutures, laissant environ 0,5 cm de facteur de croissance. Autrement De Bakey- Beck pince sur le cava donneur d'infrahepatic.
9. Ouvrez la veine sus-hépatique pince et vérifier saignement. Ensuite, reperfuser le foie en ouvrant la pince portail.
10. Utilisez 6-0 monofilament sutures de polypropylène pour les points d'hémostatiques. Diminuer la vitesse de la pompe de dérivation à environ 1500 tours / min et fermer la pince de la gaine portail introducteur cathéter.
11. Reclamper du côté du destinataire de la veine cave infrahepatic et de mettre un collier de tube sur la partie cave de la rocade. Arrêter la pompe centrifuge.
12. Coupez les attaches du connecteur cave et le retirer. Retour le sang restant de la dérivation pour le porc à travers le cathéter jugulaire.
13. Fermez la pince du cathéter jugulaire et débranchez le bypass. Donnez 100 mg de sulfate de protamine à antagoniser l'héparine. Prenez soin de pil'hémodynamique g au cours de ces étapes; utiliser catécholamine pour support de pression et de bicarbonate de sodium pour remplacer l'acidose métabolique.
14. Effectuer une anastomose de la veine infrahepatic bout à bout encore une fois de la manière décrite ci-dessus, en utilisant 5-0 sutures monofilament de polypropylène. Reperfuser la veine inférieure infrahepatic en libérant les deux pinces.
15. Coupez un correctif aortique autour du tronc cœliaque du donateur. Nouez le destinataire artère gastro-duodénale à proximité de l'artère hépatique commune. Mettez une pince bulldog sur l'artère hépatique commune proximale à la jonction de l'artère gastro-duodénale. Coupez un petit patch artérielle avec une paire de ciseaux de Potts, utilisant le tissu vasculaire autour de la jonction.
16. Rincer l'artère hépatique du donneur avec 10 ml de sérum physiologique hépariné et de mettre une autre bulldog serrer encore distale pour éviter le retour de saignement. Anastomose bout-à-bout ostia artériel dans une technique de parachute cours d'exécution, en utilisant une suture 6-0 polypropylène monofilament. Reperfuser d'abord opeNing distale puis les pinces bulldog proximales.
17. Anastomoser la fin à la fin de la voie biliaire avec 2 6-0 sutures monofilament de polypropylène en utilisant la technique de course décrit ci-dessus. Veiller à ce que de grandes portions de tissu péribiliaire sont inclus parce que le canal biliaire porcine est très fragile et se déchire facilement.
18. Après vérification de l'hémostase, retirer le cathéter introducteur de la veine splénique. Fermez les extrémités proximales et distales avec les 2 liens restants.
19. Fermez la paroi abdominale avec un monofilament résorbable taille 1. Fermez la peau soit avec une agrafeuse de la peau ou toute 2-0 surjet.

Phase 4. post-opératoire

1. Utilisez le pavé de chauffage et couverture de chaleur circulant à garder au chaud de porc.
2. Exemples de gaz du sang horaires. Ajuster la déshydratation en augmentant la vitesse de perfusion.
3. Sevrer l'anesthésie. Aérer le porc pendant 2 heures.
4. Retirer le cathéter introducteur de la jugulaire gauche ve. Appuyez fermement pendant quelques minutes pour prévenir les saignements.
5. Tunnel de cathéter sous-cutané TPN sur le côté du cou du porc. Fixez-le avec 2-0 points de suture.
6. Retirer la ligne artérielle après 2 heures si le porc est hémodynamiquement stable sans catécholamines de soutien. Assurez-vous que le côté de ponction ne saigne pas. Sinon, faire un 6-0 sac-string maille autour du trou artérielle sans fermer l'artère. Fermez le site d'incision.
7. Arrêtez la ventilation une fois que le cochon est capable de respirer de façon autonome. Déconnecter le tuyau de ventilation de la sonde trachéale. À plusieurs reprises vérifier si le porc est la respiration suffisamment.
8. Placer le porc dans une position couchée dans un enclos seul animal muni d'une lampe de chauffage. Extuber fois le cochon est capable de tenir sa tête indépendamment. Ne pas laisser un animal sans surveillance tant qu'il a repris conscience suffisante pour maintenir décubitus sternal. Maison du porc séparément pour l'ensemble de la période post-opératoire.
9. Fournirmédicaments contre la douleur iv suffisante post-opératoire (par exemple, la buprénorphine de 0,01 à 0,05 mg / kg toutes les 6 heures).
10. Si le cochon ne boit pas indépendamment, substituer assez iv de volume
11. Continuer méthylprednisolone comme l'immunosuppression (jour 250 mg post-opératoire (POD) 1 matin, puis 125 mg chaque matin). Lancer la céphalosporine 2 mg / kg par voie orale deux fois par jour à partir de POD2 sur.
12. Administrer 500 mg de métronidazole et 1,000 mg de céfazoline deux fois par jour, ainsi que 20 mg de pantoprazole une fois par jour jusqu'à ce que POD3.
13. Surveiller de près le cochon. Ne pas hésiter à sacrifier si elle montre des signes de souffrance (par exemple, la léthargie, la refusion à boire, l'acidose ou l'hypoglycémie persistante, ou de signes d'hémorragie ou d'une péritonite). Pour l'euthanasie, le cochon être exsangue sous anesthésie profonde isoflurane (5%,> 2,5 MAC) en coupant la veine sus-hépatique.

Résultats

Dans une première étude de la transplantation, un modèle de donneur à cœur arrêté (HBD, n = 5) a été comparé à un modèle DCD (n = 10) est exposé à 45 min d'ischémie chaude in situ. Dans les deux groupes, les greffes ont été conservés sur de la glace pendant 10 heures après la passation des marchés.

Dans le groupe HBD, 100% des porcs bénéficiaires survécu jusqu'à la fin de suivi de 5 jours après la transplantation. Dans le groupe DCD, seulement 50% des porcs bénéficiaires ont survécu pendant 5 jours en raison de problèmes de coagulation ou de décompensation métabolique, à la suite de la fonction hépatique post-opératoire diminué.

Tous les échantillons de sang ont été prélevés à partir du cathéter veineux central. Après centrifugation, des échantillons de sérum ont été prélevés et analysés pour lésion hépatocellulaire (aspartate aminotransférase, AST), la fonction biliaire (bilirubine totale et la phosphatase alcaline), et la fonction hépatique (INR). Le décours temporel de chaque marqueur est représenté sur les figures 2-5.

AST niveaux ont atteint un pic après 24 heures (1414 ± 538 U / L dans le groupe HBD et 2296 ± 1313 U / L dans le groupe DCD, p = 0,13) et renvoyés à des valeurs presque normales après 5 jours. De même, les valeurs de phosphatase alcaline ont été nettement augmenté après 36 heures dans le groupe DCD (224 ± 111 U / L) par rapport au groupe HBD (162 ± 54 U / L, p = 0,27). Alors que la bilirubine totale était stable dans le groupe HBD (≤ 10 pmol / L tout au long), il a augmenté progressivement dans le groupe DCD jusqu'au jour 5 (23 ± 31 pmol / L, p = 0,43). Le grand écart-type dans les valeurs de bilirubine dans le groupe DCD montre une hétérogénéité blessures biliaire particulière dans ce groupe. INR comme un marqueur de la fonction hépatique a montré une tendance similaire aux valeurs de l'AST. Valeurs culminé à 24 heures et ont été restaurés à des valeurs presque normales après 5 jours. Le groupe HBD avaient des valeurs inférieures avec un pic à 1,47 ± 0,34 par rapport au groupe DCD (pic 1,70 ± 0,36, p = 0,32).

Figure 1. Schéma du shunt porto-cave-jugulaire. La dérivation est rempli avec la solution de Ringer lactate. Puis la partie cave est serré avec une pince de tube, les pièces jugulaires et spléniques sont reliées aux cathéters préétablis, la dérivation est ouvert, et la pompe centrifuge est commencé après serrage de la veine porte. Après résection du foie, la partie cave de la rocade est inséré et fixé dans la veine cave infrahepatic souche, crânienne aux veines rénales. La pince de tube est libéré pour permettre la décompression caval, en plus de la décompression du portail.

Figure 2. aspartate aminotransférase (AST) (HBD n = 5, DCD n = 10). AST est un marqueur sensible de lésion hépatocellulaire. L'arrière de pointeer 24 heures est plus faible dans le HBD que dans le groupe DCD, suggérant une lésion de reperfusion moins hépatique; l'écart-type plus petit montre des résultats plus homogènes dans le groupe HBD.

Figure 3. La bilirubine totale (HBD n = 5, DCD n = 10). La bilirubine totale, comme un marqueur de clairance biliaire et de l'intégrité de la voie biliaire, montre une tendance stable et homogène avec des valeurs inférieures à 10 pmol / L dans le groupe HBD. La courbe de la bilirubine dans le groupe DCD augmente progressivement au fil du temps et montre un écart type élevé, suggérant blessures biliaire dans seulement une partie du groupe expérimental.

Figure 4. phosphatase alcaline (HBD n = 5, DCD n = 10). Phosphatase alcaline is un indicateur de lésion biliaire. Les valeurs pour le groupe HBD sont plus faibles que celle du groupe DCD, ce qui implique des blessures moins biliaire.

Figure 5. INR (HBD n = 5, DCD n = 10). Une valeur élevée de l'INR indique fonction hépatocellulaire diminution due à une diminution libération de facteurs de coagulation. Dans les deux groupes DBC et DCD, les valeurs de l'INR reviennent à des valeurs normales 5 jours après la transplantation, ce qui suggère la récupération de la fonction hépatique. Les valeurs pour le groupe HBD apparaissent inférieure.

Discussion

Expérimentale porcine OLTx est une procédure difficile pour un cadre de recherche sans les ressources de soins intensifs d'un scénario clinique. Les complications possibles sont l'instabilité hémodynamique, l'hémorragie, l'ischémie d'organes, l'hypothermie, et métabolique, ainsi que des voies respiratoires, de décompensation. Pour tout groupe de recherche, de formation procédurale suffisante de la technique chirurgicale ⁵ ainsi que le ^14,15 de l'anesthésie de porc est obligatoire afin d'obtenir des résultats représentatifs et reproductibles.

Beaucoup de subtilités techniques ont été décrites dans la littérature, en particulier en ce qui concerne la phase de reconstruction vasculaire ^5. Le protocole décrit ci-dessus OLTx fournit les informations requises pour un modèle de cava-remplacement ressemblant OLTx humaine. Les résultats fournis démontrent la survie de l'animal fiable et la récupération de la greffe dans les deux modèles de DBC et DCD. Le protocole est applicable dans les scénarios de survie à court terme utilisés dans la greffe reperfusion expep é riences, par exemple, ainsi que dans les modèles de survie à long terme telles que des études de tolérance.

Un grand obstacle de OLTx porcine est relativement mauvaise tolérance de cava et veine clampage. La congestion splanchnique pendant la phase anhépatique provoque l'hypertension veineuse et capillaire dommages qui peuvent conduire à l'ischémie intestinale majeure et d'instabilité hémodynamique au point d'un choc irréversible même après reperfusion d'organes ^7. Depuis la veine cave est complètement noyé dans le parenchyme hépatique, une procédure de piggy-back cava-préservation est pas possible. L'occlusion totale de la veine cave dans la phase de reconstruction de la veine porte atteinte à la stabilité hémodynamique du porc. Bien que quelques rapports montrent que OLTx porcine peut être accompli au cours de cava et veine occlusion totale de moins de 25 min ^16,17, une technique de dérivation porto-cave-jugulaire pour le temps de la reconstruction vasculaire est l'option la plus sûre et plus pratique ^{7- 9,18.} Dans èmeL'expérience de e auteurs, un passif porto-jugulaire dérivation est pas optimale pour maintenir le plan hémodynamique de porc stable au cours de la phase anhépatique. Le modèle de dérivation, y compris la décompression active tant de cava infrahepatic et la veine porte, permet une phase de reconstruction calme des anastomoses veine cave et portail sus-hépatiques, même avec le temps de serrage prolongé en raison de complications imprévues. Contrairement aux rapports précédents ^7, une splénectomie est pas obligatoire lorsque le cathéter portail contournement est prélevé. Les deux artère splénique et la veine sont fermées à mi-chemin le long de la longueur de la rate en laissant la moitié proximale suffisamment perfusé. Les complications comme des saignements ou une embolie de l'air due à dérivation déconnexion sont évitables en assurant que la dérivation est soigneusement placé et fixé correctement.

Dans survie à long terme OLTx expériences, l'anastomose biliaire est considéré comme un point faible en raison de son taux élevé de complications ^19. Le tissu biliaire est très fragile et needs soin particulier lorsqu'il est manipulé. De nombreuses techniques d'anastomose différents ont été décrits ^5,19. Une anastomose bout-à-bout est techniquement simple et avec un minimum de complications associées ^19. Un fil de suture d'une aiguille continu sans enlèvement de copeaux notamment de grandes sections de tissu conjonctif péribiliaire semble être supérieure à une suture interrompue. La voie biliaire est placé sous tension inutile lorsque les points individuels de la suture interrompue sont noués. Cela peut entraîner des déchirures du tissu et les fuites biliaires consécutifs. Le matériau de suture - résorbables ou non résorbables - est généralement pas important, compte tenu de sa durée de vie limitée jusqu'à ce que le porc est terminée. Pour les modèles de survie à long terme sur plusieurs mois, sutures absorbables - comme dans OLTx humaine - sont préférables.

Soins spécifiques doivent être prises avec le post-opératoire suivi. Une alimentation suffisante et alimentation en fluide, un protocole de soulagement de la douleur fiable, et un bon immunosuppressionrégime sont obligatoires. Pour les expériences à long terme, immunosuppression apparaît particulièrement important. Comparé à d'autres mammifères, porcs montrent un taux de rejet immunologique étonnamment bas après OLTx ^20,21. Infiltrations de cellules rondes sont maximales au cours de la deuxième semaine après la transplantation et diminuent spontanément même sans immunosuppression. Le rejet est rarement la cause de décès après porcine OLTx ^22. Cependant, même avec le protocole d'immunosuppression impliquant l'administration de Steroides et iv inhibiteurs de la calcineurine po mentionné ici, le rejet de greffe est indiqué par une légère augmentation des transaminases à partir de environ 4 jours après OLTx et confirmée par champ apparent portail infiltration de cellules rondes. inhibiteurs de la calcineurine peuvent être donnés soit ^23,24 po ou iv ^25,26; deux méthodes présentent des inconvénients. Même avec les aides de l'application orale, la quantité réelle d'atteindre le tractus gastro-intestinal reste insaisissable. D'autre part, en perfusion intraveineuse continuela plume d'un cochon avec un animal actif est difficile. Par conséquent, l'application intraveineuse doit être effectuée sous forme de bolus, ce qui se traduit par des pics élevés de concentration de médicament avec des effets toxiques potentiels. Néanmoins, les deux procédés d'application semblent permettre la survie à long terme.

Semblable à un contexte clinique, la prophylaxie ulcère de stress post-opératoire est recommandé. Saignements post-opératoires d'ulcères gastro-duodénaux est un problème fréquent et peut être liée à une insuffisance hépatique ^27. Après quelques cas de saignements gastro-intestinaux dans les deux groupes OLTx, les auteurs ont commencé la prophylaxie réguliers avec le pantoprazole et ne subissent pas de saignements gastro-intestinaux depuis.

Entretien rigoureux des conditions stériles peropératoire, comparables aux conditions dans une salle d'opération clinique et antibioprophylaxie en découlent, diminue le risque de complications infectieuses.

En conclusion, cet article provides d'information pratique pour établir un programme OLTx porcine dans un cadre de recherche. Dévouement suffisante, la pratique et le travail d'équipe est important afin de diminuer la période d'apprentissage, afin de produire des résultats fiables, et de réduire les coûts et le nombre d'animaux de recherche.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atropine Sulphate 15 mg/30ml	Rafter 8 Products	238481
Buprenorphine 0.3 mg/ml	RB Pharmaceuticals LDT	N/A
Cefazolin 1 g	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	2237138
Cyclosporin Oral Solution 5,000 mg/50 ml	Novartis Pharmaceuticals Canada Inc.	2150697
Fentanyl Citrate 0.25 mg/5 ml	Sandoz Canada Inc.	2240434
Heparin 10,000 iU/10 ml	Leo Pharma A/S	453811
Isoflurane 99.9%, 250 ml	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	2231929
Ketamine Hydrochloride  5000 mg/50 ml	Bimeda-MTC Animal Health Inc.	612316
Lactated Ringer’s + 5% Dextrose, 0.5 L	Baxter Corporation	61131
Lacteted Ringer’s, 1 L	Baxter Corporation	61085
Metronidazole 500 mg/100 ml	Baxter Corporation	870420
Midazolam 50 mg/10 ml	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	2242905
Pantoprazole 40 mg	Sandoz Canada Inc.	2306727
Potassium Chloride 40 mEq/20 ml	Hospira Healthcare Corporation	37869
Propofol 1,000 mg/100 ml	Pharmascience Inc.	2244379
Protamine Sulfate 50 mg/5 ml	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	2139537
Saline 0.9%, 1 L	Baxter Corporation	60208
Sodium Bicarbonate 50 mEq/50 ml	Hospira Healthcare Corporation	261998
Solu-Medrol 500 mg	Pfizer Canada Inc.	2367963
Tranexamic Acid 1,000 mg/10 ml	Pfizer Canada Inc.	2064413
University of Wisconsin Solution, SPS-1	Organ Recovery Systems	SPS-1
Xylocaine Endotracheal 10 mg/50 ml	AstraZeneca	2003767
Appose ULC 35 W skin stapler	Covidien Canada	803712
Maxon, 1	Covidien Canada	606173
Sofsilk, 0	Covidien Canada	S606
Sofsilk, 2-0	Covidien Canada	S405
Sofsilk, 3-0	Covidien Canada	S404
Surgipro II, 4-0	Covidien Canada	VP581X
Surgipro II, 5-0	Covidien Canada	VP725X
Surgipro II, 6-0	Covidien Canada	VP733X
Catheter i.v, 18 G	BD Canada	381147
Cook TPN catheter, 9.5 Fr	Cook Medical Company	C-TPNS-9.5-90
PSI Kit for sheath catheter, 8.5 Fr	Arrow International	ASK-09803-UHN
Infusion Pump Line	Smith Medical ASD Inc.	21-0442-25
Liver Admin Set (flush line)	CardioMed Supplies Inc	17175
Mallinckrodt, Tracheal Tube, 6.5 mm	Covidien Canada	86449
Med-Rx Suction Connecting Tube	Benlan Inc.	70-8120
Organ Bag	CardioMed Supplies Inc	2990
Suction Tip	Tyco Healthcare Group LP	8888501023
Valleylab, Cautery Pencil	Covidien Canada	E2515H
Valleylab, Patient Return Electrode	Covidien Canada	E7507
Bypass Connector 3/8” x 1/4“	Raumedic AG	955083-001
Bypass Connector 3/8” x 3/8” Luer Lock	Raumedic AG	955163-001
Bypass Connector Y 3/8” x 3/8” x 1/4”	Raumedic AG	961360-002
Bypass Tubing 1/4” x 1/16”	Raumedic AG	039505-010
Bypass Tubing 3/8” x 3/32”	Raumedic AG	039535-005
Rotaflow Centrifugal Pump	Maquet-Dynamed	HC 2821
Stainless Steel Hose Clamp Ring, 5mm	Oetiker	16700007
Abdominal Retractor	Medite GmbH	N/A
De Bakey – Beck, Infrahepatic Cava Clamp	Aesculap Inc.	FB519R
Deithrich, Atraumatic Clamp (Portal Vein)	Aesculap Inc.	FB525R
Gregory Bulldog Clamp, curved	Aesculap Inc.	FB382R
Gregory Bulldog Clamp, straight	Aesculap Inc.	FB381R
Potts – De Martel, Scissors	Aesculap Inc.	BC648R
Satinsky, Suprahepatic Cava Clamp	Aesculap Inc.	FB605R
Symetrical Tubing Clamp	Codman Instruments	198010
Anesthesia Machine, Optimax	Moduflex Anesthesia Equipment	SN5180
Bypass Flow meter, HT 110	Transonic Systems Inc.	HT110B11106
Flow meter probe, H6XL	Transonic Systems Inc.	H6Xl689
Heat Therapy Pump, T/Pump	Gaymar Industries Inc	TP500-G89D19
Infusion Pump 3,000	SIMS Graseby LTD.	SN300050447
Isoflurane Vapor 19.1	Draeger Medical Canada Inc.	N/A
Monitor, Datex AS 3	Instrumentarium Corp./ Hitachi	D-VHC14-23-02
Rotaflow Centrifugal Drive Unit	Maquet-Dynamed	952301
Rotaflow Console	Maquet-Dynamed	706035
Temperature Therapy Pad	Gaymar Industries Inc	TP26E
Valleylab Force Tx	Valleylab Inc.	216151480
Ventilator, AV 800	DRE Medical Equipment	40800AVV
Warm Touch, Patient Warming System	Nellcor/ Covidien Canada	5015300A