Visualisation directe de la Dorsale murin Cochlear Nucleus pour optogénétiques stimulation de la voie auditive

Résumé

The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model.

Résumé

Enquête sur l'utilisation du transfert de gène à médiation virale pour arrêter ou inverser la perte auditive a largement été reléguée au système auditif périphérique. Peu d'études ont examiné le transfert de gènes au système auditif central. Le noyau cochléaire dorsal (DCN) du tronc cérébral, qui contient des neurones de second ordre de la voie auditive, est un site potentiel de transfert de gènes. Dans ce protocole, une technique pour une exposition directe et maximale de la DCN murin par une approche de la fosse postérieure est démontrée. Cette approche permet une chirurgie aiguë ou la survie. Suite à la visualisation directe de la DCN, une multitude d'expériences sont possibles, y compris l'injection de opsins dans le noyau cochléaire et une stimulation ultérieure par une fibre optique couplée à un laser à lumière bleue. D'autres expériences de neurophysiologie, telles que la stimulation électrique et tracés d'injection de neurones sont également possibles. Le niveau de visualisation et la durée de la stimulation font réalisables cette approche applicable à un large éventail d'expériences.

Introduction

Virus-mediated gene transfer to reverse hearing loss has largely been focused on the peripheral auditory system.¹ Targeting the cochlea, investigators have examined a host of delivery routes, including osmotic minipump infusion², vector-transgene complex-soaked Gelfoam®² or gelatin sponge³, direct microinjection⁴; numerous gene transfer vectors, including adeno-associated viral vectors^5,6, lentiviral vectors⁷, and cationic liposomes²; and the dissemination of gene transfer vectors beyond the target tissue². Most recently, adeno-associated virus (AAV)-1 has been introduced in the cochlea in order to treat deafness in mice due to loss of vesicular glutamate transporter-3.⁸ Further, the application of optogenetics in peripheral auditory system has recently been described.⁹

Few studies, however, have examined gene transfer to the central auditory system. The dorsal cochlear nucleus (DCN) of the brainstem contain second order neurons of the auditory pathway. While gene transfer techniques in the cochlear nucleus (CN) may be utilized for a host of investigations, gene transfer of opsins, light-sensitive proteins, to the DCN may also be utilized to enable optogenetics-based experimental techniques. Following virus-mediated gene transfer delivery of an opsin, such as channelrhodopsin-2 (ChR2), the neurons of the DCN becomes sensitive to light stimuli. Optogenetic gene transfer has been previously attempted in several brainstem regions, including the rat retrotrapezoid nucleus, mouse locus coeruleus, monkey superior colliculus, and mouse ventral tegmental area.^10-14

Recently, investigators have examined the use of optogenetics in the DCN.^15,16 The DCN is the location of placement of auditory brainstem implants in humans, making it an attractive part of the auditory system to study for translational studies on auditory neuroprostheses. However, given the location of the DCN, surgical exposure is challenging. The technique described herein provides a protocol for maximal exposure of the DCN via posterior fossa approach to enable viral vector gene transfer and optogenetics-based experiments in a murine model. Previous studies used stereotactic microinjection into the DCN with channelrhodopsin-2.¹⁶ Stereotaxic injections, however, are potentially less accurate than injections made by direct visualization, especially in a nucleus as small and deep along the brainstem as the DCN. Transgenic mice expressing tissue specific proteins in the CN are also an attractive option and would obviate the need for gene transfer. Our protocol for exposure of the DCN would also work in transgenic mice as the DCN would need to be directly exposed for optical stimulation. This technique for surgical exposure of the DCN is adapted from previous protocols involving recordings from the auditory nerve and cochlear nucleus in mice and rat models.^15,17-20

The overall goal of the protocol is to provide direct exposure to the CN to allow for gene transfer techniques. More specifically, the approach is compatible with both acute and survival surgery and the preparation can be repeated in the same animal for subsequent neurophysiological testing. The direct exposure of the DCN protocol has implications for optogenetics- and virus-mediated gene transfer-based experimentation in other nuclei of the brainstem.

Protocole

NOTE: Toutes les procédures expérimentales sont effectuées en conformité avec le soin et l'utilisation Comité pour les Animaux du Massachusetts Eye and Ear Infirmary et Harvard Medical School, qui suivent les lignes directrices de soins aux animaux nationaux, y compris la politique de santé publique service sur Humane soin et l'utilisation des animaux de laboratoire, le Guide ILAR, et la Loi sur la protection des animaux. Les procédures expérimentales énumérés ci-dessous l'exposition détaillée de la DCN gauche. Utilisez des instruments stériles tout en effectuant la chirurgie de survie.

1. Craniotomie primaire et Dorsale Cochlear Nucleus exposition

1. Anesthésie
   1. Anesthésier une souris, âgées de 8 à 12 semaines, pesant 18 à 24 g, de xylazine 20 mg / kg de kétamine et 100 mg / kg par une administration intrapéritonéale. Confirmez anesthésie appropriée par le taux de surveillance cardiaque, fréquence respiratoire, ainsi que pincement de l'orteil réflexe de retrait. Lieu vétérinaire onguent sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie. Une fois correctement sous anesthésie, cheveux rasage recouvrant til cuir chevelu pour fournir un accès libre sur le site chirurgical.
2. Positionnement chirurgical
   1. Placez la souris en toute sécurité dans un petit porte-stéréotaxique animal, maintenu en place par une pince de museau.
   2. Assurez-vous que la pince de museau est assez lâche pour permettre une respiration adéquate, mais assez serré pour immobiliser complètement la tête de la souris. Si la tête de la souris est lâche, l'animal est susceptible de tomber sur le support de tête pendant la partie craniotomie de la procédure.
   3. Placez électrodes implant du tronc cérébral à la mode standard, ce qui permet un suivi de la fréquence cardiaque. La fréquence respiratoire doit être surveillée par la visualisation. Notez que la fréquence cardiaque normale et la fréquence respiratoire varient en fonction de l'âge de la souris.
   4. Un thermomètre est placé et euthermia est assurée par le placement sur une couverture chauffante homéotherme.
3. incision de la peau et l'exposition des os interpariétales et occipital du crâne
   1. Sous un Microscope, faire une incision verticale à travers la peau à partir de la ligne médiane, directement entre le pavillon de l'oreille, et se étendant jusqu'à la partie caudale de l'occiput. Après incision médiane de la peau, la peau déplacer latéralement. Visualiser les muscles couvrant la gauche de la face postérieure du crâne.
   2. Retirer muscle recouvrant la pariétale gauche, interpariétal, et les os occipital du crâne par désarticulation des attaches musculaires à leurs os respectifs avec un scalpel ou de l'iris ciseaux. Observer un petit degré de saignement le long des bords de coupe de muscle. Réduire cette par une légère pression avec un applicateur coton-tige pour 10-15 sec.
4. Recouvrant Craniotomie Cochlear Nucleus
   1. Identifier les lignes de suture pertinents, y compris des sutures sagittale et lambda lignes (Figure 1, panneau de gauche).
   2. Utilisation de rongeurs, faire une craniotomie sur l'os interpariétal, à gauche de la ligne médiane, ~ 2 mm caudale à la ligne lambda de suture. Cette région recouvre la DCN.
   3. Following craniotomie, observer une mince couche de dure qui recouvre le cervelet. En utilisant une lame de scalpel, enlever la dure-mère. (Figure 1, panneau moyen).
      REMARQUE: Enlèvement de dure peut causer un faible degré de saignement. Ce processus d'utilisation de la lame de scalpel pour enlever la dure-mère est destiné à réduire la quantité de perte de sang pendant l'aspiration de cervelet, qui mettra en commun sur la surface du tronc cérébral et l'identification obscur de la DCN. Le volume de sang total de souris est d'environ 1,5 ml devraient pas dépasser> à 15%. Si le saignement dépasse ce montant, la souris doit être muni d'une supplémentation fluide.
   4. Retirer sang coagulé recouvrant le cervelet avec la pointe du coton applicateur. Eventuellement, égoutter doucement solution saline en utilisant un point dentaires sur le cervelet pour effacer le sang loin sang.
5. Cérébelleuse aspiration
   1. L'utilisation d'un 5 aspiration français, aspirer la partie latérale la plus du cervelet gauche recouvrant la DCN jusqu'à ce que la DCN est visUAL (Figure 1, panneau de droite). Retirer environ 1/4 à 1/3 du cervelet gauche. Le principal point de repère à côté de la DCN est l'ampoule du canal semi-circulaire supérieur.
      NOTE: L'aspiration du cervelet est l'étape clé du protocole. Réalisé aspiration du cervelet est effectué le plus de succès si elle se produit en une seule tentative et non avec de multiples passes de l'aspiration car cela pourrait causer des saignements. Pour aider à l'aspiration, régler le plan focal du microscope à la profondeur prévue de la NC, qui sera légèrement distale par rapport à la surface du cervelet. Réglage du plan focal du CN améliorer la visualisation et d'assurer une image nette.
   2. Après aspiration, le saignement, liquide céphalo-rachidien (LCR) accumulation, et le déplacement du cervelet sur la DCN sont attendus. Instiller 0,5 ml de solution saline stérile rapidement dans la craniotomie pour empêcher la coagulation du sang. Une combinaison de tamponnant doucement avec un point dentaire et aspiration peut alors êtreutilisé pour déblayer un chemin pour la visualisation directe de la DCN. Ne pas directement contact avec la surface de la DCN.

2. microinjection à pression à médiation virale Gene Transfer and Recovery chirurgical

1. Après la DCN est libre de sang recouvrant et le LCR et est clairement visible, assurez microinjections de pression dans la DCN en utilisant une seringue Hamilton de 10 ul sur une période de 2 min.
2. Introduire l'aiguille avec un micromanipulateur jusqu'au bout ne est plus visible sous la surface de la DCN.
3. Pour des performances optimales, utilisez une aiguille de calibre 33 ou 34 (utiliser une seringue étanche aux gaz avec l'aiguille 34 gauge) avec un biseau peu profonde, comme 45 °, afin de minimiser traumatisme contondant et localiser le volume d'injection dans le DCN, qui est un mince et la structure du tronc cérébral peu profondes (<300 um d'épaisseur).
   NOTE: D'autres instruments de micro-injection peuvent être fondées utilisé. Idéalement, l'instrument d'injection doit être souple pour permettre une légère bend, si nécessaire pour cibler directement la DCN. En outre, comme la souris se déplace légèrement tout au long de la procédure en raison de la respiration, l'instrument doit être suffisamment robuste pour supporter des quantités mineures de mouvement.

3. Récupération chirurgicale

1. Immédiatement après l'injection, re-rapprochant la peau et laissez la souris pour récupérer par la procédure de récupération standard. Restant tissu cicatriciel cervelet et remplira la cavité provoquée par l'aspiration du cervelet. Surveiller constamment animaux jusqu'à ce que la conscience suffisante est retrouvé à maintenir décubitus sternal. Surveiller le rythme cardiaque, fréquence respiratoire, ainsi que la capacité à nourrir.
   REMARQUE: Aucun animal qui a subi une intervention chirurgicale est retourné dans une cage avec les autres animaux jusqu'à guérison complète.
2. Si une souris commence à tourner en rond après l'opération (<5% des cas), généralement 2-4 heures après la fermeture de l'incision de la peau, immédiatement sacrifier la souris, comme il aurait probablement un temps à se nourrir difficile. Tson effet secondaire est probablement due à l'aspiration du cervelet. L'animal doit être surveillé pour la douleur post-opératoire, et les stupéfiants appropriées devrait être accordée pour assurer le confort des animaux basée sur des normes institutionnelles. Les antibiotiques peuvent être nécessaires, si la preuve de l'infection.

4. secondaire exposition Craniotomie et Cochlear Nucleus

1. Après 2-4 semaines de cicatrisation et virus transfert génique à médiation par incubation, re-anesthésier une souris et répétez les étapes 1.1 à 1.5 temps d'incubation optimal précédemment injectée varie en fonction du type de gène transféré.
2. Retirer le tissu de cicatrice sur le site de craniotomie par une combinaison de pinces, scalpel, et rongeurs.
3. Après la visualisation de la craniotomie, identifier une combinaison de cervelet et tissu cicatriciel recouvrant la DCN reste. Utilisez un 5 aspiration française pour aspirer cervelet recouvrant / tissu cicatriciel (similaire à l'aspiration cérébelleuse précédente).
4. Après aspiration, attendre le saignement, CSF benforcer-up, et les bits restants du cervelet. Introduire rapidement une solution saline dans la craniotomie pour empêcher la coagulation du sang. Utilisez une combinaison de douceur dentaires tamponnant point et d'aspiration pour dégager le chemin pour la visualisation directe de la DCN.
5. Observer la surface de la DCN. Effectuer des expériences de physiologie base optogénétique-DCN est maintenant accessible. Présentez un stimulus lumineux, par exemple avec une fibre optique (Figure 2), à conduire une expérience basée optogénétique.

5. histologie

1. Après la conclusion d'expériences, euthanasier la souris avec une surdose de kétamine. Perfuser la souris avec une solution saline normale suivie par 4% de paraformaldéhyde.
2. Extraire le tronc cérébral du crâne et de post-correctif pour 2 heures. Cryoprotect le tronc cérébral dans 30% de saccharose pendant 24-48 h. Section du tronc cérébral au moyen d'un cryostat standard en utilisant 60 sections um.

Résultats

Partielle cérébelleuse aspiration démontre avoir accès à noyau cochléaire

Après la peau et le muscle recouvrant le crâne, les sites d'intérêt sont éliminés de la surface du crâne, comme les lignes de suture coronale et lamda, démontrer la localisation approximative de la craniotomie. Après craniotomie avec rongeurs, le cervelet est visualisée. Une aspiration soigneuse de la petite partie du cervelet montre la visualisation de la NC, qui peut alors être injecté ...

Discussion

Cet article décrit la technique de visualisation directe de la DCN dans le modèle murin pour la manipulation du système auditif central. L'approche décrite de la visualisation directe offre des avantages significatifs par rapport à la principale alternative, qui sont des approches stéréotaxiques. Principalement, la visualisation directe de la DCN permet de confirmation immédiate du site du tronc cérébral, alors que les approches stéréotaxiques ne offrent pas la visualisation directe. Dans les expérience...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotaxic holder	Stoelting	51500
Homeothermic blanket	Harvard	507214
Scalpel blade #11	Fine Surgical Tools	10011-00
Iris scissor	Fine Surgical Tools	14084-08
5 French suction	Symmetry Surgical	2777914
Dental Points	Henry Schein	100-8170
Bone rongeur	Fine Surgical Tools	16020-14
10 µl Hamilton syringe	Hamilton	7633-01
34 gauge, needle	Hamilton	207434
Rongeurs	Fine Surgical Tools	16021-14