Visualizzazione diretta del Murine Dorsale Cochlear Nucleus per optogenetic stimolazione del percorso uditivo

Riepilogo

The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model.

Abstract

Indagine sull'uso di trasferimento genico virus-mediata di arrestare o invertire la perdita dell'udito è stata in gran parte relegato al sistema uditivo periferico. Pochi studi hanno esaminato il trasferimento di geni al sistema uditivo centrale. Il nucleo dorsale cocleare (DCN) del tronco encefalico, che contiene neuroni secondo ordine del percorso uditivo, è un sito di capacità di trasferimento genico. In questo protocollo, una tecnica per l'esposizione diretta e massima della murino DCN mediante un approccio posteriore fossa è dimostrata. Questo approccio permette sia per la chirurgia acuta o sopravvivenza. Dopo la visualizzazione diretta del DCN, una serie di esperimenti sono possibili, compresa l'iniezione di opsine nel nucleo cocleare e la stimolazione successiva da una fibra ottica accoppiata ad un laser a luce blu. Altri esperimenti di neurofisiologia, come la stimolazione elettrica e tracciati iniettori neurali sono anche possibili. Il livello di Visualizazione e la durata della stimolazione rendono realizzabile questo approccio applicabile ad una vasta gamma di esperimenti.

Introduzione

Virus-mediated gene transfer to reverse hearing loss has largely been focused on the peripheral auditory system.¹ Targeting the cochlea, investigators have examined a host of delivery routes, including osmotic minipump infusion², vector-transgene complex-soaked Gelfoam®² or gelatin sponge³, direct microinjection⁴; numerous gene transfer vectors, including adeno-associated viral vectors^5,6, lentiviral vectors⁷, and cationic liposomes²; and the dissemination of gene transfer vectors beyond the target tissue². Most recently, adeno-associated virus (AAV)-1 has been introduced in the cochlea in order to treat deafness in mice due to loss of vesicular glutamate transporter-3.⁸ Further, the application of optogenetics in peripheral auditory system has recently been described.⁹

Few studies, however, have examined gene transfer to the central auditory system. The dorsal cochlear nucleus (DCN) of the brainstem contain second order neurons of the auditory pathway. While gene transfer techniques in the cochlear nucleus (CN) may be utilized for a host of investigations, gene transfer of opsins, light-sensitive proteins, to the DCN may also be utilized to enable optogenetics-based experimental techniques. Following virus-mediated gene transfer delivery of an opsin, such as channelrhodopsin-2 (ChR2), the neurons of the DCN becomes sensitive to light stimuli. Optogenetic gene transfer has been previously attempted in several brainstem regions, including the rat retrotrapezoid nucleus, mouse locus coeruleus, monkey superior colliculus, and mouse ventral tegmental area.^10-14

Recently, investigators have examined the use of optogenetics in the DCN.^15,16 The DCN is the location of placement of auditory brainstem implants in humans, making it an attractive part of the auditory system to study for translational studies on auditory neuroprostheses. However, given the location of the DCN, surgical exposure is challenging. The technique described herein provides a protocol for maximal exposure of the DCN via posterior fossa approach to enable viral vector gene transfer and optogenetics-based experiments in a murine model. Previous studies used stereotactic microinjection into the DCN with channelrhodopsin-2.¹⁶ Stereotaxic injections, however, are potentially less accurate than injections made by direct visualization, especially in a nucleus as small and deep along the brainstem as the DCN. Transgenic mice expressing tissue specific proteins in the CN are also an attractive option and would obviate the need for gene transfer. Our protocol for exposure of the DCN would also work in transgenic mice as the DCN would need to be directly exposed for optical stimulation. This technique for surgical exposure of the DCN is adapted from previous protocols involving recordings from the auditory nerve and cochlear nucleus in mice and rat models.^15,17-20

The overall goal of the protocol is to provide direct exposure to the CN to allow for gene transfer techniques. More specifically, the approach is compatible with both acute and survival surgery and the preparation can be repeated in the same animal for subsequent neurophysiological testing. The direct exposure of the DCN protocol has implications for optogenetics- and virus-mediated gene transfer-based experimentation in other nuclei of the brainstem.

Protocollo

NOTA: Tutte le procedure sperimentali sono eseguite in conformità con la cura e l'uso degli animali Comitato del Massachusetts Eye and Ear Infirmary e Harvard Medical School, che seguono le linee guida nazionali per la cura degli animali, tra cui la politica di sanità pubblica Service Humane cura e l'uso di animali da laboratorio, la ILAR Guida, e la legge sulla protezione degli animali. Procedure sperimentali elencate di seguito dettagliato esposizione della DCN di sinistra. Usare strumenti sterili durante l'esecuzione di un intervento chirurgico di sopravvivenza.

1. primario Craniotomia e dorsale cocleare Nucleus Esposizione

1. Anestesia
   1. Anestetizzare un mouse, età 8-12 settimane, del peso di 18-24 g, con xilazina 20 mg / kg e 100 mg ketamina / kg tramite somministrazione intraperitoneale. Verificare il corretto anestesia per il monitoraggio della frequenza cardiaca, frequenza respiratoria, nonché punta ritiro pizzico reflex. Luogo veterinario pomata sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. Una volta adeguatamente sotto anestesia, capelli barba sovrastante tegli cuoio capelluto per fornire libero accesso al sito chirurgico.
2. Posizionamento chirurgico
   1. Posizionare il mouse saldamente in un piccolo supporto stereotassico animali, tenuto in posizione da un morsetto muso.
   2. Assicurarsi che il morsetto muso è abbastanza largo per permettere un'adeguata respirazione, ma abbastanza stretto per immobilizzare completamente la testa del mouse. Se la testa del mouse è allentato, l'animale rischia di cadere dal supporto testa durante la parte craniotomia di procedura.
   3. Posizionare uditive elettrodi impianto tronco in modo standard, che consente il monitoraggio della frequenza cardiaca. La frequenza respiratoria deve essere monitorata da visualizzazione. Si noti che la frequenza cardiaca normale e la frequenza respiratoria variano a seconda dell'età del mouse.
   4. Un termometro è posto e eutermia è assicurata tramite il posizionamento su una coperta riscaldamento omeotermi.
3. Incisione cutanea e l'esposizione delle ossa interparietale e occipitale del cranio
   1. Sotto un microscOPE, fare una incisione verticale attraverso la pelle a partire dalla linea mediana, direttamente tra il padiglione auricolare, e si estende alla porzione caudale dell'occipite. Dopo mediana pelle incisione, spostare la pelle lateralmente. Visualizza i muscoli che coprono la sinistra la faccia posteriore del cranio.
   2. Rimuovere sovrastante parietale sinistra, interparietale muscolare, e le ossa occipitali del cranio per disarticolazione di inserzioni muscolari ai rispettivi ossa con un bisturi o iris forbice. Osservare un piccolo grado di sanguinamento lungo i bordi muscolari taglio. Minimizzare questo con una leggera pressione con un applicatore con punta di cotone per 10-15 sec.
4. Sovrastante Craniotomy Cochlear Nucleus
   1. Identificare linee di sutura pertinenti, tra cui suture sagittale e lambda linee (Figura 1, pannello di sinistra).
   2. Utilizzando rongeurs, fare una craniotomia sopra l'osso interparietale, a sinistra di linea mediana, ~ 2 mm caudale alla linea lambda sutura. Questa regione si sovrappone il DCN.
   3. Following craniotomia, osservare un sottile strato di dura che sovrasta il cervelletto. Usando un bisturi, rimuovere la dura. (Figura 1, pannello centrale).
      NOTA: La rimozione di dura può causare un piccolo grado di sanguinamento. Questo processo di utilizzare il bisturi per rimuovere la dura lo scopo di ridurre la quantità di perdita di sangue durante l'aspirazione del cervelletto, che riunirà in superficie tronco encefalico e oscura l'identificazione del DCN. Volume di sangue totale di mouse è ~ 1,5 ml non deve superare i> del 15%. Se l'emorragia supera tale importo, il mouse deve essere provvisto di integrazione con il fluido.
   4. Rimuovere sangue coagulato sovrapponendo il cervelletto con il cotton-fioc. Facoltativamente, gocciola delicatamente salina con un punto dentale sul cervelletto per eliminare il sangue via il sangue.
5. Cerebellare Aspirazione
   1. Utilizzando una aspirazione 5 French, aspirare la porzione laterale più a sinistra del cervelletto sovrastante il DCN finché il DCN è visUAL (Figura 1, pannello di destra). Rimuovere circa 1/4 a 1/3 del cervelletto sinistro. Il punto di riferimento principale adiacente al DCN è l'ampolla del canale semicircolare superiore.
      NOTA: L'aspirazione del cervelletto è il passo fondamentale del protocollo. Diretto aspirazione del cervelletto viene eseguita con maggior successo se si verifica in un unico tentativo, e non con più passaggi di aspirazione ciò causerebbe sanguinamento. Per facilitare l'aspirazione, impostare il piano focale del microscopio alla profondità prevista della NC, che sarà leggermente distale alla superficie del cervelletto. Impostazione del piano focale per il CN migliorare la visualizzazione e di garantire un'immagine nitida.
   2. Dopo l'aspirazione, ulteriori emorragie, liquido cerebrospinale (CSF) accumulo, e lo spostamento del cervelletto sulla DCN sono attesi. Instillare 0,5 cc di soluzione fisiologica sterile rapidamente nel craniotomia per evitare la coagulazione del sangue. Una combinazione di dolce tamponando con un punto dentale e di aspirazione può quindi essereutilizzata per eliminare un percorso per la visualizzazione diretta del DCN. Non contattare direttamente la superficie del DCN.

2. Pressione microiniezione di trasferimento genico Virus-mediata e ripristino chirurgico

1. Dopo l'DCN è libera di sangue sovrastante e CSF ed è chiaramente visibile, fare microiniezioni pressione nel DCN utilizzando una siringa da 10 microlitri Hamilton un periodo di 2 min.
2. Introdurre l'ago con un micromanipolatore finché la punta non è più visibile sotto la superficie della DCN.
3. Per ottenere prestazioni ottimali, utilizzare un ago calibro 33 o 34 (utilizzare una siringa a tenuta di gas con l'ago 34 gauge) con uno smusso superficiale, come ad esempio 45 °, per ridurre al minimo il trauma smussato e localizzare il volume di iniezione ai DCN, che è un sottile e struttura tronco superficiale (<300 micron di spessore).
   NOTA: Altri strumenti microiniezione possono basarsi utilizzato. Idealmente, lo strumento di iniezione deve essere flessibile per consentire qualche lieve bend, se necessario di indirizzare direttamente il DCN. Inoltre, come il mouse si sposta un po 'tutta la procedura a causa di respirazione, lo strumento dovrebbe essere abbastanza robusta per sopportare piccole quantità di movimento.

3. Recupero Surgical

1. Subito dopo l'iniezione, ri-approssimare la pelle e lasciare il mouse per recuperare per procedura di recupero standard. Rimanendo cervelletto e tessuto cicatriziale riempirà nella cavità causata dalla aspirazione del cervelletto. Monitorare costantemente animali fino coscienza sufficiente riguadagnato a mantenere decubito sternale. Monitorare la frequenza cardiaca, frequenza respiratoria, nonché la capacità di nutrire.
   NOTA: Nessun animale che ha subito un intervento chirurgico viene restituita una gabbia con altri animali fino alla completa guarigione.
2. Se un mouse comincia a camminare in cerchio post-operatorio (<5% dei casi), tipicamente 2-4 ore dopo la chiusura della incisione cutanea, sacrificare immediatamente il mouse, come sarebbe probabilmente un'alimentazione momento difficile. Til suo effetto collaterale è probabilmente dovuto all'aspirazione del cervelletto. L'animale deve essere monitorata per il dolore postoperatorio, e narcotici appropriate deve essere somministrato a garantire il comfort degli animali sulla base di norme istituzionali. Gli antibiotici possono essere necessarie, se le prove di infezione.

4. secondaria Craniotomia e Cochlear Nucleus Esposizione

1. Dopo 2-4 settimane di guarigione e virus-mediata gene trasferimento incubazione, ri-anestetizzare un precedentemente iniettato mouse e ripetere il passo 1,1-1,5 tempo di incubazione ottimale varia con il tipo di gene trasferito.
2. Rimuovere il tessuto cicatriziale sul sito craniotomia da una combinazione di pinzette, bisturi, e rongeurs.
3. Dopo visualizzare la craniotomia, individuare una combinazione di rimanere cervelletto e tessuto cicatriziale sovrastante il DCN. Utilizzare un 5 di aspirazione francese per aspirare cervelletto sovrastante / tessuto cicatriziale (simile al precedente aspirazione cerebellare).
4. Dopo l'aspirazione, si aspettano ulteriori emorragie, CSF build-up, e rimanenti bit di cervelletto. Introdurre rapidamente salina nel craniotomia per prevenire la coagulazione del sangue. Utilizzare una combinazione di dolce punto tamponando e di aspirazione dentale per spianare la strada per la visualizzazione diretta del DCN.
5. Osservare la superficie della DCN. Effettuare esperimenti di fisiologia basato optogenetics-come DCN è ora accessibile. Introdurre un stimolo luminoso, ad esempio con una fibra ottica (Figura 2), per guidare un esperimento basato optogenetics-.

5. Istologia

1. Dopo la conclusione degli esperimenti, eutanasia il mouse con una overdose di ketamina. Profumato il mouse con soluzione fisiologica seguita da 4% paraformaldeide.
2. Estrarre il tronco cerebrale dal cranio e post-fix per 2 ore. Cryoprotect tronco encefalico nel 30% di saccarosio per 24-48 ore. Sezione tronco cerebrale utilizzando un criostato standard utilizzando 60 sezioni micron.

Risultati

Parziale cerebellare aspirazione possa accedere alla Cochlear Nucleus

Dopo la pelle ei muscoli sovrastante il cranio vengono rimossi, monumenti superficie del cranio, come le linee di sutura coronale e Lamda, dimostrano la localizzazione approssimativa della craniotomia. A seguito di craniotomia con rongeurs, il cervelletto è visualizzato. Accurata aspirazione della piccola porzione del cervelletto dimostra visualizzazione della NC, che possono poi essere iniettato (Figura ...

Discussione

Questo documento descrive la tecnica di visualizzazione diretta del DCN nel modello murino per la manipolazione del sistema uditivo centrale. L'approccio delineato di visualizzazione diretta offre notevoli vantaggi rispetto l'alternativa principale, che sono approcci stereotassica. In primo luogo, la visualizzazione diretta della DCN consente conferma immediata del sito del tronco encefalico, considerando approcci stereotassica non danno visualizzazione diretta. In esperimenti che necessitano prolungati periodi ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotaxic holder	Stoelting	51500
Homeothermic blanket	Harvard	507214
Scalpel blade #11	Fine Surgical Tools	10011-00
Iris scissor	Fine Surgical Tools	14084-08
5 French suction	Symmetry Surgical	2777914
Dental Points	Henry Schein	100-8170
Bone rongeur	Fine Surgical Tools	16020-14
10 µl Hamilton syringe	Hamilton	7633-01
34 gauge, needle	Hamilton	207434
Rongeurs	Fine Surgical Tools	16021-14