Прямая визуализация мышиный Спинной Cochlear Nucleus для Optogenetic стимуляции слухового пути

Резюме

The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model.

Аннотация

Исследование в области использования вируса-опосредованного переноса генов, чтобы арестовать или обратить вспять процесс утраты слуха в значительной степени были отнесены к периферической слуховой системы. В нескольких исследованиях изучали перенос генов к центральной слуховой системы. Спинной Cochlear Nucleus (DCN) ствола мозга, который содержит второй нейронов порядка слухового пути, это потенциальное место для переноса генов. В этом протоколе, техника для прямого и максимальному облучению мышиного DCN через задней черепной ямки подхода продемонстрирована. Такой подход позволяет любой острой или выживания хирургии. После прямой визуализации DCN, хозяин экспериментов можно, в том числе инъекции опсинов в кохлеарной ядра и последующим стимуляции оптического волокна в сочетании с синим светом лазера. Другие эксперименты нейрофизиологии, такие как электрической стимуляции и нейронных начертаний форсунок также возможны. Уровень visualizaции и продолжительность стимуляции достижимо делают этот подход применим к широкому кругу экспериментов.

Введение

Virus-mediated gene transfer to reverse hearing loss has largely been focused on the peripheral auditory system.¹ Targeting the cochlea, investigators have examined a host of delivery routes, including osmotic minipump infusion², vector-transgene complex-soaked Gelfoam®² or gelatin sponge³, direct microinjection⁴; numerous gene transfer vectors, including adeno-associated viral vectors^5,6, lentiviral vectors⁷, and cationic liposomes²; and the dissemination of gene transfer vectors beyond the target tissue². Most recently, adeno-associated virus (AAV)-1 has been introduced in the cochlea in order to treat deafness in mice due to loss of vesicular glutamate transporter-3.⁸ Further, the application of optogenetics in peripheral auditory system has recently been described.⁹

Few studies, however, have examined gene transfer to the central auditory system. The dorsal cochlear nucleus (DCN) of the brainstem contain second order neurons of the auditory pathway. While gene transfer techniques in the cochlear nucleus (CN) may be utilized for a host of investigations, gene transfer of opsins, light-sensitive proteins, to the DCN may also be utilized to enable optogenetics-based experimental techniques. Following virus-mediated gene transfer delivery of an opsin, such as channelrhodopsin-2 (ChR2), the neurons of the DCN becomes sensitive to light stimuli. Optogenetic gene transfer has been previously attempted in several brainstem regions, including the rat retrotrapezoid nucleus, mouse locus coeruleus, monkey superior colliculus, and mouse ventral tegmental area.^10-14

Recently, investigators have examined the use of optogenetics in the DCN.^15,16 The DCN is the location of placement of auditory brainstem implants in humans, making it an attractive part of the auditory system to study for translational studies on auditory neuroprostheses. However, given the location of the DCN, surgical exposure is challenging. The technique described herein provides a protocol for maximal exposure of the DCN via posterior fossa approach to enable viral vector gene transfer and optogenetics-based experiments in a murine model. Previous studies used stereotactic microinjection into the DCN with channelrhodopsin-2.¹⁶ Stereotaxic injections, however, are potentially less accurate than injections made by direct visualization, especially in a nucleus as small and deep along the brainstem as the DCN. Transgenic mice expressing tissue specific proteins in the CN are also an attractive option and would obviate the need for gene transfer. Our protocol for exposure of the DCN would also work in transgenic mice as the DCN would need to be directly exposed for optical stimulation. This technique for surgical exposure of the DCN is adapted from previous protocols involving recordings from the auditory nerve and cochlear nucleus in mice and rat models.^15,17-20

The overall goal of the protocol is to provide direct exposure to the CN to allow for gene transfer techniques. More specifically, the approach is compatible with both acute and survival surgery and the preparation can be repeated in the same animal for subsequent neurophysiological testing. The direct exposure of the DCN protocol has implications for optogenetics- and virus-mediated gene transfer-based experimentation in other nuclei of the brainstem.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все экспериментальные процедуры выполняются в соответствии с уходу и использованию комитета животных из Массачусетского глаз и ушей лазарет и Гарвардской медицинской школы, которые следуют национальные руководящие принципы по уходу за животными, в том числе политики общественного здравоохранения по гуманное лечение и использования лабораторных животных, ИЛАР Руководство и Закон защиты животных. Экспериментальные процедуры, перечисленные ниже подробно воздействии на левой DCN. Используйте стерильные инструменты при выполнении операции выживания.

1. Первичная Краниотомия и Спинной Cochlear Nucleus экспозиции

1. Анестезия
   1. Обезболить мыши в возрасте 8-12 недель, весом 18-24 г, с ксилазина 20 мг / кг кетамина и 100 мг / кг через внутрибрюшинного введения. Подтвердите надлежащего анестезии сердечного ритма мониторинга, частоту дыхания, а также ног щепотку отмены рефлекса. Место ветеринар мазь на глазах, чтобы предотвратить сухость в то время как под наркозом. После того, как адекватно под наркозом, бритье волос, покрывающий тон скальп, чтобы обеспечить беспрепятственный доступ к хирургической операции.
2. Хирургическое позиционирования
   1. Наведите надежно в небольшом владельца животного стереотаксической, удерживается на месте с помощью рыла зажима.
   2. Убедитесь, что морда зажим достаточно свободно, чтобы обеспечить адекватное дыхание, но достаточно плотно, чтобы полностью обездвижить голову мыши. Если головка мышь свободно, животное может выпасть из держателя головки во время краниотомии части процедуры.
   3. Поместите слуховые ствола мозга имплантатов электродов в стандартном моды, что позволяет для мониторинга сердечного ритма. Частота дыхания должны контролироваться визуализации. Следует отметить, что нормальный сердечный ритм и частота дыхания может изменяться в зависимости от возраста мыши.
   4. Термометр помещают и euthermia обеспечивается путем размещения на теплокровных одеяло отопления.
3. Разрез кожи и разоблачение interparietal и затылочной костей черепа
   1. Под microscОПЕ, сделать вертикальный разрез через кожу, начиная с средней линии, непосредственно между ушной раковины, а также включить в каудальной части затылка. После срединный разрез кожи, вытеснять кожу с боков. Представьте мышцы, охватывающие левую заднюю сторону черепа.
   2. Удалить мышцы, покрывающий левую теменную, interparietal и затылочные кости черепа по экзартикуляции вложений мышечных их соответствующих костей с помощью скальпеля или радужной оболочки глаза ножницами. Соблюдайте небольшую степень кровотечения по разрезу мышечных краев. Свернуть это при слабом давлении с ватным наконечником аппликатора на 10-15 сек.
4. Краниотомия вышележащих Cochlear Nucleus
   1. Определить соответствующие строки шов, в том числе в сагиттальной и лямбда швов линий (рис 1, слева).
   2. Использование кусачек, сделать трепанацию черепа над Кость инков, слева от срединной линии, ~ 2 мм каудально к лямбда шва. Этот регион покрывает DCN.
   3. Followinг трепанация черепа, наблюдать тонкий слой твердой мозговой оболочки, что перекрывает мозжечок. Использование лезвие скальпеля, удалить твердую мозговую оболочку. (Рисунок 1, средняя панель).
      Примечание: Удаление твердой мозговой оболочки может вызвать небольшую степень кровотечения. Этот процесс с использованием лезвие скальпеля, чтобы удалить твердую мозговую оболочку предназначен, чтобы уменьшить количество кровопотери во время мозжечка аспирации, которая будет бассейн на поверхности мозга и неясной идентификации DCN. Общий объем крови мыши ~ 1,5 мл не должна превышать> чем на 15%. Если кровотечение превышает эту сумму, мышь должна быть обеспечена с добавками жидкости.
   4. Удалить свернувшейся крови, покрывающий мозжечок ватным наконечником аппликатором. При желании, мягко капать солевой раствор с помощью зубной точку на мозжечке, чтобы очистить кровь от крови.
5. Мозжечка Стремление
   1. Использование 5 французскую всасывания, аспирации в поперечном направлении наиболее части левой мозжечка, покрывающей DCN до DCN не по отношениюUAL (рис 1, справа). Удалить примерно от 1/4 до 1/3 от левой мозжечка. Главная достопримечательность рядом с DCN является ампула высшего полукружных каналов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стремление мозжечка ключевым шагом протокола. Режиссер стремление мозжечка наиболее успешно выполняется, если это происходит в одной попытке, а не с несколькими проходами всасывания, так как это вызовет кровотечение. Чтобы помочь в стремлении, установлен в фокальной плоскости микроскопа на ожидаемой глубины CN, которая будет немного удален от поверхности мозжечка. Установка фокальной плоскости в CN улучшит визуализацию и обеспечить четкое изображение.
   2. После аспирации, в дальнейшем кровотечения, спинномозговой жидкости (ликвора) наращивание и мозжечок смещение на DCN ожидается. Привить 0,5 см стерильного физиологического раствора быстро в трепанации черепа, чтобы предотвратить свертывание крови. Сочетание нежного вытирать с зубной точки всасывания и может быть затемиспользуется для расчищать путь для прямой визуализации DCN. Есть непосредственно не контактирует с поверхностью DCN.

2. Давление Микроинъекция для Касперского опосредованного переноса гена и хирургической восстановления

1. После DCN свободна от вышележащих крови и спинномозговой жидкости, и отчетливо видно, чтобы микроинъекций давления в DCN с использованием 10 мкл Hamilton шприца в течение 2 мин.
2. не вносят иглу микроманипулятор до кончика больше не видны под поверхностью DCN.
3. Для оптимальной производительности используйте 33 или 34 иглы (используйте герметичное шприц с 34 датчик иглы) с мелкой фаски, например, 45 °, чтобы свести к минимуму тупой травмы и локализовать объем впрыска в пределах DCN, который тонкий и мелкой структуры ствола мозга (<300 мкм).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Другие микроинъекции инструменты могут быть использованы на основе. В идеале, инъекции инструмент должен быть гибким, чтобы позволить некоторую небольшим Бенd, если нужно, чтобы непосредственно нацелены на DCN. Кроме того, как мышь слегка движется в течение всей процедуры за счет дыхания, прибор должен быть достаточно прочным, чтобы выдерживать незначительные количества движения.

3. Хирургическое восстановление

1. Сразу после инъекции, вновь приблизить кожу и позволяют мышь, чтобы восстановить в стандартной процедуры восстановления. Оставшееся мозжечок и рубцовая ткань заполнит полости, вызванного стремлением мозжечка. Постоянно следить животных, пока достаточно сознание не восстанавливается поддерживать грудины лежачее положение. Монитор сердечного ритма, частоты дыхания, а также способность прокормить.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нет животное, которое перенес операцию возвращается в клетку с другими животными, пока полностью выздоровел.
2. Если мышь начинает ходить кругами после операции (<5% случаев), как правило, 2-4 часа после закрытия разреза кожи, немедленно пожертвовать мышь, так как это, скорее всего, имеют трудное время кормления. Tего побочный эффект, скорее всего, из-за стремления мозжечка. Животное должно контролироваться на боли в послеоперационном периоде, а также соответствующие наркотики следует уделять обеспечить комфорт животных на основе институциональных стандартов. Антибиотики могут быть необходимы, если признаков инфекции.

4. Средняя Краниотомия и Cochlear Nucleus экспозиции

1. Через 2-4 недель заживления и вируса-опосредованного генного переноса инкубации, повторно обезболить ранее вводили мыши и повторите шаг 1,1-1,5 Оптимальное время инкубации зависит от типа гена перевода.
2. Удалить рубцовой ткани над трепанации черепа сайте сочетанием пинцетом, скальпелем, и кусачек.
3. После визуализации трепанацию черепа, определить комбинацию остальные мозжечок и рубцовой ткани, покрывающий DCN. Используйте 5 французскую всасывания аспирации лежащего мозжечок / рубцовой ткани (по аналогии с предыдущим мозжечка аспирация).
4. После аспирации, ожидать дальнейшего кровотечения, CSF бuild-до, и оставшиеся биты мозжечка. Быстро ввести физиологический раствор в краниотомия, чтобы предотвратить свертывание крови. Используйте сочетание нежной зубной точки вытирая и всасывания, чтобы очистить путь для прямой визуализации DCN.
5. Обратите внимание на поверхность DCN. Выполните Оптогенетика на основе экспериментов физиологии как DCN теперь доступна. Внедрение световой раздражитель, например, с помощью оптического волокна (рисунок 2), для привода эксперимент Оптогенетика основе.

5. Гистология

1. После заключения экспериментов, усыпить мышь с передозировкой кетамина. Заливать мышь с физиологическим раствором, а затем 4% параформальдегидом.
2. Экстракт ствол мозга из черепа и после исправления в течение 2 часов. Cryoprotect ствол мозга в 30% сахарозы в течение 24-48 часов. Раздел ствола головного мозга с помощью стандартного криостата с помощью 60 мкм разделов.

Результаты

Частичное мозжечка Стремление Демонстрирует Доступ к Cochlear Nucleus

После кожу и мышцы вышележащих черепа удаляются, поверхности черепа ориентиры, такие как корональных и Lamda линий шва, показывают приблизительное локализацию краниотомия. После трепанации черепа с куса...

Обсуждение

Эта статья описывает методику прямой визуализации DCN в мышиной модели для манипуляции центральной слуховой системы. Изложил подход непосредственной визуализации обеспечивает значительные преимущества по сравнению с основной альтернативы, которые стереотаксической подходы. В перву...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotaxic holder	Stoelting	51500
Homeothermic blanket	Harvard	507214
Scalpel blade #11	Fine Surgical Tools	10011-00
Iris scissor	Fine Surgical Tools	14084-08
5 French suction	Symmetry Surgical	2777914
Dental Points	Henry Schein	100-8170
Bone rongeur	Fine Surgical Tools	16020-14
10 µl Hamilton syringe	Hamilton	7633-01
34 gauge, needle	Hamilton	207434
Rongeurs	Fine Surgical Tools	16021-14