청각 통로의 Optogenetic 자극에 대한 쥐의 등쪽 달팽이 핵의 직접 시각화

요약

The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model.

초록

체포 또는 청력 손실을 반대하는 바이러스 매개 유전자 전달의 사용에 대한 조사는 크게 말초 청각 시스템에 이관되었다. 연구는 거의 중앙 청각 시스템에 유전자 전달을 조사 하였다. 청각 경로의 2 차 뉴런을 포함 뇌간의 등쪽 달팽이관 핵 (DCN)를, 유전자 전달을위한 잠재적 인 위치이다. 이 프로토콜에서 후두와 접근법을 통해 쥐의 DCN의 직접적이고 최대 노출에 대한 기술은 증명된다. 이 방법은 하나 급성 또는 생존 수술을 할 수 있습니다. DCN의 직접적인 시각화에 이어, 실험 호스트는 청색 레이저에 연결된 광 파이버에 의한 인공 핵 및 후속 자극으로 opsins의 주입을 포함 할 수있다. 이러한 전기 자극과 신경 인젝터 트레이싱과 같은 다른 신경 생리학 실험도 가능하다. visualiza의 수준기 및 자극 지속 기간은 달성 실험 광범위한 적용이 접근법 만든다.

서문

Virus-mediated gene transfer to reverse hearing loss has largely been focused on the peripheral auditory system.¹ Targeting the cochlea, investigators have examined a host of delivery routes, including osmotic minipump infusion², vector-transgene complex-soaked Gelfoam®² or gelatin sponge³, direct microinjection⁴; numerous gene transfer vectors, including adeno-associated viral vectors^5,6, lentiviral vectors⁷, and cationic liposomes²; and the dissemination of gene transfer vectors beyond the target tissue². Most recently, adeno-associated virus (AAV)-1 has been introduced in the cochlea in order to treat deafness in mice due to loss of vesicular glutamate transporter-3.⁸ Further, the application of optogenetics in peripheral auditory system has recently been described.⁹

Few studies, however, have examined gene transfer to the central auditory system. The dorsal cochlear nucleus (DCN) of the brainstem contain second order neurons of the auditory pathway. While gene transfer techniques in the cochlear nucleus (CN) may be utilized for a host of investigations, gene transfer of opsins, light-sensitive proteins, to the DCN may also be utilized to enable optogenetics-based experimental techniques. Following virus-mediated gene transfer delivery of an opsin, such as channelrhodopsin-2 (ChR2), the neurons of the DCN becomes sensitive to light stimuli. Optogenetic gene transfer has been previously attempted in several brainstem regions, including the rat retrotrapezoid nucleus, mouse locus coeruleus, monkey superior colliculus, and mouse ventral tegmental area.^10-14

Recently, investigators have examined the use of optogenetics in the DCN.^15,16 The DCN is the location of placement of auditory brainstem implants in humans, making it an attractive part of the auditory system to study for translational studies on auditory neuroprostheses. However, given the location of the DCN, surgical exposure is challenging. The technique described herein provides a protocol for maximal exposure of the DCN via posterior fossa approach to enable viral vector gene transfer and optogenetics-based experiments in a murine model. Previous studies used stereotactic microinjection into the DCN with channelrhodopsin-2.¹⁶ Stereotaxic injections, however, are potentially less accurate than injections made by direct visualization, especially in a nucleus as small and deep along the brainstem as the DCN. Transgenic mice expressing tissue specific proteins in the CN are also an attractive option and would obviate the need for gene transfer. Our protocol for exposure of the DCN would also work in transgenic mice as the DCN would need to be directly exposed for optical stimulation. This technique for surgical exposure of the DCN is adapted from previous protocols involving recordings from the auditory nerve and cochlear nucleus in mice and rat models.^15,17-20

The overall goal of the protocol is to provide direct exposure to the CN to allow for gene transfer techniques. More specifically, the approach is compatible with both acute and survival surgery and the preparation can be repeated in the same animal for subsequent neurophysiological testing. The direct exposure of the DCN protocol has implications for optogenetics- and virus-mediated gene transfer-based experimentation in other nuclei of the brainstem.

프로토콜

참고 : 모든 실험 절차는 보건 서비스 동물 애호 관리에 대한 정책 및 실험 동물의 사용을 포함하여 국가 동물 관리 지침을 따르 매사추세츠 눈의 동물 관리 및 사용위원회와 귀 의무실과 하버드 의과 대학,에 따라 수행된다 ILAR 가이드 및 동물 복지 법. 실험 절차는 왼쪽 DCN의 세부 노출 아래에 나열된. 생존 수술을 수행하는 동안 멸균 악기를 사용합니다.

1 차 개두술 등쪽 달팽이 핵 노출

1. 마취
   1. 복강 내 투여를 통해 자일 라진 (xylazine) 20 ㎎ / ㎏과 케타민 100 ㎎ / ㎏ 18-24 g의 무게 8~12주, 세 마우스를, 마취. 모니터링 심박수, 호흡 수,뿐만 아니라 발가락 핀치 철수 반사에 의한 적절한 마취를 확인합니다. 눈에 장소 수의사 연고 마취 동안 건조를 방지합니다. 일단 적절하게 마취, 면도 머리 위에 놓인 t그는 수술 부위에 접근이 수월를 제공하기 위해 두피.
2. 외과 위치
   1. 주둥이 클램프로 고정 작은 동물 정위 홀더에 안전하게 마우스를 놓습니다.
   2. 주둥이 클램프가 완전히 마우스의 머리를 고정하는 적절한 호흡하지만 꽉 충분히 허용 할 정도로 느슨한 있는지 확인하십시오. 마우스 머리가 느슨한 경우, 동물 절차의 개두술 부분에서 헤드 홀더에서 떨어질 가능성이있다.
   3. 심장 박동 모니터링 할 수 표준 방식에서 청성 뇌간 이​​식 전극을 배치합니다. 호흡 비율은 시각화하여 모니터링해야합니다. 정상적인 심장 박동과 호흡이 마우스의 연령에 따라 달라질 수 있습니다.
   4. homeothermic 가열 담요에 배치를 통해 온도계는 배치되고 euthermia이 보장된다.
3. 피부 절개하고 두개골의 interparietal과 뒤통수 뼈의 노출
   1. microsc에서OPE, 피부를 통해 수직 절개가 직접 날개 사이의 중간 선에서 시작하고, 후두부의 꼬리 부분까지 연장합니다. 정중선 피부 절개를 따라 횡 방향으로 피부를 변위. 두개골의 왼쪽 후방 측면을 덮고있는 근육을 시각화.
   2. 메스 홍채 가위와 각각의 뼈에 근육 첨부 파일의 이단에 의해 근육 왼쪽 정수리, interparietal 위에 놓인, 두개골의 후두 뼈를 제거합니다. 컷 근육의 가장자리를 따라 출혈의 작은 정도를 관찰한다. 10 ~ 15 초 동안 면봉으로 부드럽게 압력이 최소화.
4. 개두술을 덮는 인공 와우 핵
   1. 시상 및 람다 봉합 라인 (그림 1, 왼쪽 패널)을 포함하여 관련 봉합 라인을 확인합니다.
   2. rongeurs를 사용하여 람다 봉합 라인에 중간 선 왼쪽 interparietal 뼈를 통해 개두술, ~ 2mm의 꼬리를합니다. 이 지역은 DCN 위에 놓인다.
   3. 따라와g의 개두술은 소뇌 위에 놓여 두라의 얇은 층을 관찰합니다. 메스 블레이드를 사용하여 경질을 제거합니다. (그림 1, 가운데 패널).
      참고 : 경질의 제거는 약간의 출혈이 발생할 수 있습니다. 경질을 제거 메스 블레이드를 사용하는이 프로세스는 뇌간 표면 및 DCN 모호한 식별 할 풀, 소뇌 흡입 동안 혈액 손실의 양을 감소시키기위한 것이다. 마우스의 총 혈액량은 15 %보다> ~ 1.5 ml를 초과하지 않아야합니다. 출혈이 금액을 초과하면, 마우스는 유체 보충과 함께 제공되어야한다.
   4. 면 팁 어플리케이터 소뇌를 오버레이 응고 된 혈액을 제거합니다. 선택적으로, 부드럽게 혈액을 혈액을 멀리 취소 소뇌에 치과 지점을 사용하여 식염수 물방울.
5. 소뇌 포부
   1. DCN이 힘을 될 때까지 5 프랑스어 흡입을 사용하면, DCN 위에 놓인 왼쪽 소뇌의 측면 - 대부분의 부분을 대기음연간 (그림 1, 오른쪽 패널). 왼쪽 소뇌의 약 1/4 ~ 1/3를 제거합니다. DCN에 인접한 주요 랜드 마크는 우수한 반규관의 팽대부입니다.
      참고 : 소뇌의 포부는 프로토콜의 핵심 단계이다. 이 출혈의 원인이됩니다이 같은 흡입의 다중 패스와 함께 하나의 시도에서 발생하지 않을 경우 소뇌의 감독 흡입은 가장 성공적으로 수행된다. 흡입을 돕기 위해, 소뇌의 표면에 약간 원위 것이다 CN의 예상 깊이 현미경의 초점면을 설정한다. CN에 초점면을 설정하면 시각화를 개선하고 선명한 이미지를 보장합니다.
   2. DCN에 따라 흡입, 더 출혈, 뇌척수액 (CSF) 빌드 업, 그리고 소뇌 변위가 예상된다. 혈액 응고를 방지하기 위해 신속 개두술에 멸균 생리 식염수를 주입 시키 0.5 CC. 치과 점과 흡입과 부드러운 dabbing의 조합은 할 수있다DCN의 직접 시각화를위한 경로를 멀리 취소하는 데 사용됩니다. 직접 DCN의 표면에 접촉하지 마십시오.

바이러스 매개 유전자 전달 및 외과 복구를위한 2. 압력 미세 주입

1. DCN은 상부의 혈액과 뇌척수액의 무료이며 명확하게 볼 수 있습니다 후 2 분 동안 10 μL 해밀턴 주사기를 사용하여 DCN에 압력 microinjections을합니다.
2. 팁은 더 이상 DCN의 표면 아래에 보일 때까지 미세 조작기로 바늘을 도입하지 않는다.
3. 최적의 성능을 위해, 외상을 최소화하고 얇은 DCN 내 주입 볼륨을, 지역화, 45 °로, 얕은 경사와 등을 33 또는 34 게이지 바늘 (34 게이지 바늘 기밀 주사기를 사용)을 사용하는 얕은 뇌간 구조 (<300 μm의 두께).
   참고 : 다른 미세 주입 장비가 활용 기초 할 수있다. 이상적으로, 주사 기기는 약간의 벤 있도록 유연해야D는 경우 직접 D​​CN을 대상으로 할 필요가 있었다. 마우스 인해 호흡에 절차 전반에 걸쳐 약간 이동하면서 또한, 악기는 운동의 소량을 견딜 수 있도록 충분히 견고해야한다.

3. 수술 복구

1. 주사 직후 피부를 다시 근사 및 마우스 표준 복구 절차 당 복구 할 수있다. 남은 소뇌와 흉터 조직은 소뇌의 흡인에 의한 공동으로 채울 것입니다. 충분한 의식이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 회복 될 때까지 지속적으로 동물을 모니터링 할 수 있습니다. 심박수, 호흡 수,뿐만 아니라 공급하는 능력을 모니터한다.
   참고 : 완전히 회복 될 때까지 아니 동물 수술을 한 다른 동물 케이지에 반환됩니다.
2. 마우스는 수술 후 원에서 도보로 시작하는 경우가 가능성이 힘든 시간 공급을하는 것처럼 (<사례 5 %), 피부 절개의 폐쇄 후 일반적으로 2-4 시간은, 바로, 마우스를 희생. 티그의 부작용으로 인해 소뇌 흡인하기 쉽다. 동물은 수술 후 통증에 대해 모니터링되어야하고, 적절한 마약 제도적 표준을 기반으로 동물의 편안함을 보장하기 위해 부여해야합니다. 항생제는 필요 감염의 경우 증거 할 수 있습니다.

4. 차 개두술 달팽이 핵 노출

1. 치유와 바이러스 매개 유전자 전달 배양 2-4 주 후, 이전에 주입 마우스 단계를 반복 1.1-1.5 최적의 배양 시간이 전송 유전자의 종류에 따라 다릅니다 다시 마취.
2. 핀셋, 메스 및 rongeurs의 조합에 의해 개두술 사이트를 통해 흉터 조직을 제거합니다.
3. 개두술을 시각화 한 후, DCN을 덮는 소뇌 및 흉터 조직을 나머지의 조합을 식별한다. 위에있는 소뇌 / (이전 소뇌의 열망과 유사) 흉터 조직을 흡인하기 위해 5 프랑스어 흡입을 사용합니다.
4. 흡인 후, 추가 출혈, 뇌척수액 B 기대uild 업 및 소뇌의 나머지 비트. 빠르게 혈액 응고를 방지하기 위해 식염수에 개두술을 소개한다. DCN의 직접 시각화에 대한 경로를 취소 부드러운 치과 점 dabbing 및 흡입의 조합을 사용합니다.
5. DCN의 표면을 관찰한다. DCN 이제 액세스 가능한 optogenetics 기반 생리학 실험을 수행합니다. optogenetics 기반 실험을 구동하기 위해, 광섬유 (도 2)와, 예를 들면 광 자극을 소개.

5. 조직학

1. 실험의 결론에 따라, 마취제의 과다 복용으로 마우스를 안락사. 4 % 파라 포름 알데히드이어서 생리 식염수로 마우스를 관류.
2. 2 시간의 두개골 및 사후 수정에서 뇌간의 압축을 풉니 다. 24 ~ 48 시간 동안 30 % 자당의 뇌간을 Cryoprotect. 제 60 ㎛의 섹션을 사용하여 표준 저온 유지 장치를 이용 뇌간.

결과

부분 소뇌 흡입은 코 클리어 핵에 대한 액세스를 보여줍니다

두개골을 덮는 피부와 근육이 같은 관상과 람다 봉합 선으로, 두개골 표면 랜드 마크를 제거한 후, 개두술의 대략적인 현지화를 보여줍니다. rongeurs와 개두술에 따라, 소뇌가 보여집니다. 소뇌의 작은 부분을주의 깊게 흡입 후 주입 할 수있는 CN, (그림 1)의 시각화를 보여줍니다.

토론

이 논문은 중앙 청각 시스템의 조작 생쥐 모델에서 DCN의 직접 시각화 기술을 설명합니다. 직접 시각화의 설명 방식은 정위 적 방법을 주요 대안에 비해 상당한 장점을 제공합니다. 정위 방법은 직접 시각화 여유가없는 반면, 주로, DCN의 직접 시각화, 뇌간의 사이트를 즉시 확인 할 수 있습니다. 바이러스 - 매개 유전자 전달의 경우에서와 같이, 인큐베이션 기간을 필요로 장기간 실험에서, 주입 대?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotaxic holder	Stoelting	51500
Homeothermic blanket	Harvard	507214
Scalpel blade #11	Fine Surgical Tools	10011-00
Iris scissor	Fine Surgical Tools	14084-08
5 French suction	Symmetry Surgical	2777914
Dental Points	Henry Schein	100-8170
Bone rongeur	Fine Surgical Tools	16020-14
10 µl Hamilton syringe	Hamilton	7633-01
34 gauge, needle	Hamilton	207434
Rongeurs	Fine Surgical Tools	16021-14