Enregistrement Neuronal activité induite de Température-travers le contrôle des modifications de calcium dans le bulbe olfactif de<em&gt; Xenopus laevis</em

Résumé

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

Résumé

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the γ-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the γ-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca²⁺ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Introduction

Over the last years, temperature sensitivity has no longer been described as a somesthetic sense only, but also as a physiological function relevant for the olfactory system. In rodents, the main olfactory bulb receives input from the Grueneberg ganglion (GG), an organ in the nasal cavity, consisting of thermosensitive neurons. GG neurons respond to cool temperatures¹ as well as to chemical stimuli, and their chemosensitivity is modulated by temperature fluctuations². These observations suggest that the olfactory bulb may integrate chemical and temperature information collected at the nose. In order to explore this hypothesis, we present here a set of experiments enabling the detection of temperature responses in the olfactory bulb of non-transgenic animals, using the Xenopus laevis larva as a model. The organization of the olfactory system in these animals closely resembles that of mammals. The olfactory receptor neurons of premetamorphic X. laevis terminate in tufts, and make synaptic contacts with the dendrites of second-order neurons, the mitral cells. Pre- and postsynaptic fibers intermingle and form skein-like neuropil structures called glomeruli³. The abundant synapses of the glomerular layer represent the first processing center of olfactory information. Mitral cells further integrate the sensory input and convey it to higher olfactory areas.

We have developed a protocol combining electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) with calcium-sensitive and non-sensitive dyes followed by bolus loading of the postsynaptic network of glomeruli and mitral cells. The staining by electroporation of two spectrally distinct dyes loaded in the nasal cavities serves to single out the γ-glomerulus³ through its bilateral innervation by ORNs from both olfactory epithelia. Thus, the location of the γ-glomerulus is identified prior to further measurements. Subsequently, bolus loading⁴ with Fluo-8 acetoxymethyl (Fluo-8 AM) is carried out in a volume comprising the γ-glomerulus. Imaging calcium changes with fast confocal microscopy allows the visualization of temperature responses in the 3D neuropil surrounding the γ-glomerulus, a unique temperature-sensitive glomerulus in this system⁵. Mitral cells innervating this specific structure can also be identified by their Ca²⁺ signals responsive to induced temperature drops. Next, activity correlation imaging⁶ uses the specific Ca²⁺ traces of these cells to reveal the dendritic morphology of thermosensitive mitral cells. Alternating repeated applications of cold Ringer solution and chemical odorants in one measurement can be used to visualize the mitral cell networks for odor and temperature processing surrounding the γ-glomerulus and identify potential overlaps. To unambiguously assign the responses to either the chemical or the temperature stimulus, we constantly monitor temperature at the olfactory epithelium.

Protocole

Toutes les expériences avec Xenopus laevis têtards ont été réalisées conformément aux lignes directrices approuvées par le Comité d'éthique de l' Université de Göttingen en expérimentation animale.

1. électroporation

1. Choisissez animaux de stades 49-54 selon Nieuwkoop et Faber ^7.
2. Assurez-vous que la configuration d'enregistrement est constitué d'un stéréomicroscope avec une grande distance de travail et un dispositif d'électroporation qui peut appliquer des impulsions de tension de 20 V pendant 20 msec à une fréquence d'au moins 2 Hz. Appliquer les impulsions de tension par l'intermédiaire de deux électrodes de platine ayant un diamètre approximatif de 200 pm de sorte qu'ils puissent être insérés dans les narines de têtards sans causer de dommages.
3. Préparer des cristaux d'un colorant conjugué dextrane (par exemple, le calcium vert 10 kDa Dextran, ou Alexa Fluor 647 10 kDa Dextran) en dissolvant la quantité délivrée habituellement de 5 mg à environ 100 pi d'eau distillée et laisser de petites gouttelettes d'2 ul sec sur une feuille de Parafilm.
   Remarque: Les cristaux secs en moins d'un jour et peuvent être stockées ensuite à -18 ° C au congélateur pendant une période de plus d'un an.
4. Anesthetize les animaux en les plaçant dans l'eau du robinet contenant 3% Tricaine méthane sulfonate pendant 1-2 min jusqu'à ce qu'il atteigne l'état d'anesthésie chirurgicale caractérisée par une diminution de la fréquence cardiaque, la perte de tous les mouvements et le manque de réponses à des stimuli mécaniques.
5. Immerger l'animal anesthésié pendant 10 secondes dans de l'eau du robinet pure.
6. Placez l'animal sur un coussin de gel et de le fixer en plaçant des aiguilles autour de lui sans lui nuire.
   Note: Ne pas fixer l'animal en poussant des aiguilles à travers sa peau.
7. Séchez délicatement la zone entourant les narines avec un mouchoir en papier.
8. Placez l'animal sous la loupe binoculaire et se concentrer sur les narines.
9. Utilisez une pince pour ramasser un cristal de colorant de taille correspondant à l'orifice narine, placez-le dans une des cavités nasales et attendre jusqu'à ce qu'il se dissout complètement, wUEL prend moins de 1 min. Si les cristaux sont plus petits, ajouter 2 ou 3 dans chaque cavité jusqu'à ce qu'ils produisent une solution de haute concentrée non translucide.
10. Placer la cathode sur la peau du têtard et l'anode dans l'une des narines.
    Remarque: Ce paramètre particulier applique aux colorants cités dans l'étape 1.3. Pour les colorants ayant une polarité différente, les résultats de la coloration peut être améliorée en plaçant la cathode dans les narines. En cas de doute à propos de la polarité du colorant, les deux électrodes peuvent être placés simultanément dans les narines (un par narine), et la polarité alterne entre des impulsions de tension unique.
11. Appliquer six impulsions de 20 V et 20 msec à environ 0,5 secondes d'intervalle de stimulus.
    Nota: Les petites bulles doivent apparaître autour de l'électrode dans la narine lors de l'électroporation à condition que les électrodes sont en contact avec la peau et la solution dans la narine. Si aucune bulle sont visibles vérifier les câbles de connexion et assurez-vous que le devic de électroporatione délivre l'impulsion de tension souhaitée.
12. Répétez la procédure (01/09 à 01/11) pour la deuxième narine.
13. Transférez le têtard électroporation dans un bécher rempli d'eau du robinet à la température ambiante. Attendre 5 à 10 min jusqu'à ce que l'animal ne reprenne conscience et reprend sa piscine. Nourrissez-le et laissez-le récupérer pendant au moins 1 jour au cours de laquelle le colorant est transporté le long du nerf olfactif vers le bulbe olfactif.
14. Utilisez les animaux électroporation dans les 1-7 jours suivant la électroporation pour les meilleurs résultats d'imagerie. Donnez au moins 24 fois h pour le transport de colorant et de récupération avant l'imagerie.

2. Monter entier Préparation

1. Anesthetize l'animal dans l'eau du robinet contenant 3% Tricaine méthane sulfonate jusqu'à ce que tous les mouvements ont cessé et il ne répond plus aux stimulations mécaniques.
2. Transférez le têtard à un coussin de gel sous un stéréomicroscope et le fixer solidement en enfonçant des aiguilles à travers la peau de chaque côté de la forebrain.
3. Sacrifiez le têtard en sectionnant sa moelle épinière.
4. Utilisez un scalpel pour disséquer un bloc de tissu contenant les deux cavités nasales, les nerfs olfactifs et bulbes olfactifs (Figure 1A). Faire la première incision près de narine gauche, sans le toucher et déplacer la lame de coupe avant le long du nerf olfactif gauche et le bulbe jusqu'à la frontière télencéphalique-diencéphale. Faites de même sur le côté droit. Isoler la préparation du reste du système nerveux en faisant un postérieur finale de coupe du télencéphale.
5. Éliminer le corps du têtard et retourner soigneusement le bloc de tissu à l'envers de sorte que la face ventrale de la préparation du cerveau tournée vers le haut.
6. Pin à nouveau le bloc de tissu en insérant deux aiguilles entre les nerfs olfactifs.
7. Mettre une goutte de solution Frog Ringer (NaCl 98, 2 mM de KCl, CaCl2 ₁ mM, MgCl2 ₂ mM, glucose 5 mM, 5 mM de Na-pyruvate, HEPES 10 mM, ajusté à pH 7,8, Osmolarité de 230 mOsmol / L) sur le tissu.
8. Retirez les méninges couvrant la zone de tri des axones et les bulbes olfactifs en faisant trois incisions à l'aide de ciseaux fins. A partir du bord postérieur du bloc de tissu, couper caudorostrally étroitement le long du bulbe olfactif gauche jusqu'à ce que le point d'entrée des nerfs olfactifs dans les ampoules (la zone de tri des axones).
9. Répétez l'étape 2.8 pour l'hémisphère droit.
10. Soulever les méninges avec des pinces et faire de la troisième coupe, perpendiculaire aux précédents dans la zone de tri des axones.
    Remarque: La face ventrale du bulbe olfactif est maintenant accessible pour l'imagerie et bolus chargement.
11. Pour améliorer la qualité d'image dans l'image lumineuse transmise, répétez la procédure pour la face dorsale. Ces mesures supplémentaires peuvent faciliter la navigation de la micropipette pour bolus chargement, mais ne sont pas strictement nécessaires.
12. Transférer l'échantillon à une chambre d'enregistrement rempli de Frog Ringer pour un traitement ultérieur et l'imagerie. Fait duure que la face ventrale est orientée vers le haut et de sécuriser l'échantillon avec un filet de fibres de nylon a duré plus d'un petit cadre de platine.
13. Pour une application plus facile des stimuli placer les cavités nasales au-dessus de l'une des fibres de nylon.

3. Bolus Loading

1. Dissoudre 50 pg du calcium AM colorant (par exemple, Fluo-8 heures) dans 20 pi de diméthylsulfoxyde (DMSO) contenant 20% de Pluronic F-127 (p / v) pour préparer une solution de réserve de colorant AM. Congeler les solutions mères en petites aliquotes de 1-2 volumes ul. La solution mère est stable pendant au moins une demi-année, mais éviter les cycles de gel-dégel.
2. Utilisez un extracteur micropipette et tirez pipettes avec une résistance de 5-8 MQ et un diamètre de 1-2 um de pointe.
3. Dissoudre la solution mère préparée du colorant dans la solution de Frog Ringer à une concentration de 250-500 pM.
4. Ajouter MK571 pour atteindre une concentration de 500 uM pour bloquer multirésistantes transporteurs de résistance.
5. Remplir la micropipette avec 10 pi de la solution à l'aide d'une pointe de pipette allongé et enlever toutes les bulles d'air en tapotant la micropipette.
6. Monter la micropipette dans le porte-pipette et assurez-vous que la pression peut être appliqué manuellement à l'aide d'une seringue ou d'un dispositif d'éjection pneumatique médicament et de surveiller la pression appliquée avec une jauge.
7. Si possible, utilisez une configuration de microscope avec la capacité d'exciter le colorant injecté de telle sorte que la sortie de la pointe de micropipette peut être visualisé et ajusté. Idéalement, utilisez une configuration d'imagerie confocale. Utiliser un microscope droit avec un objectif à immersion de telle sorte que le tissu peut être atteint avec la micropipette.
8. Placez l'ensemble de la préparation de montage sous le microscope, suivre le nerf olfactif jusqu'à ce que l'ampoule et de se concentrer sur la zone d'intérêt dans le bulbe olfactif.
9. Perfuser solution fraîche de Ringer à travers la chambre d'enregistrement afin d'accroître la viabilité de la préparation et laver la fuite de colorantde la pointe de micropipette.
10. Abaisser la pipette sur la surface du bulbe olfactif, avec la pointe pointant vers la direction rostrale de la préparation.
11. Appliquer une petite pression positive et constante (environ 25 hPa) à la micropipette pour éviter le colmatage de la pipette et doucement l'insérer dans le tissu.
12. Une fois la pipette a violé les couches de tissu extérieur, la déplacer dans une direction rostro-dorsale dans la couche cellulaire mitrale. (Notez qu'une contre-coloration des neurones récepteurs olfactifs par électroporation est utile pour ajuster la position de la micropipette). Idéalement, placer la pointe de la pipette à une distance de 50 à 100 um à partir du site d'enregistrement souhaité.
    1. Pour la coloration de la γ-glomérule sensible à la température, cible une zone d'environ 50 um à partir de la position rostrale du neuropile présynaptique de la γ-glomérule.
13. Appliquer une pression positive dans la plage de 100-200 hPa. Ajuster la force de la pression en fonction de la taille dela pointe de la micropipette. Confirmer la sortie de la pipette en regardant pour de légers mouvements de tissus visibles sous brightlight illumination lorsque la pression est appliquée pour la première fois.
14. Maintenir une pression constante pendant environ 10 minutes tandis que la micropipette reste dans le tissu. Si possible, vérifiez le neuropile dans l'intervalle pour la cellule de chargement sous un éclairage fluorescent chargement réussi entraînera visible coloration soma cellulaire avec une intensité croissante au fil du temps.
    Remarque: Souvent, la raison pour le chargement qui succombe est pipette colmatage en raison de tissus entrant dans la pointe ou des grappes de colorants agrégés. Il est parfois possible de sauver la pipette en brisant doucement sa pointe contre la surface inférieure de la chambre d'enregistrement. Cependant, la pointe de la pipette ne doit pas dépasser quelques micromètres. Compenser plus grandes ouvertures de pipettes en appliquant une pression plus faible pendant bolus chargement.
15. Après les 10 min de chargement, de réduire la pression appliquée à zéro et vérifier la coloration.
    RemarqueLa taille de la zone tachée varie considérablement et dépend de plusieurs paramètres tels que la quantité de colorant et l'emplacement du site d'éjection injecté. Une bonne coloration couvre une superficie d'environ 100 um x 100 um.
16. Si la zone tachée est trop petit ou ne couvre pas le site d'enregistrement désiré, répétez les étapes de 3,10 à 3,13. Utiliser les mêmes micro-pipette pour l'injection suivante, si elle n'a pas encore obstruée.
17. Attendre au moins 30 minutes après la dernière injection avant de commencer toute expérimentation pour permettre l'absorption de colorant et désestérification. Continuer à perfuser la chambre d'enregistrement avec une solution de Ringer fraîche en tout temps.

4. Paramètres de mesure

1. Assurez-vous que la configuration de mesure se compose d'un microscope confocal à une vitesse suffisante pour enregistrer trois volumes tridimensionnels. Choisissez un taux d'au moins 1 Hz par pile d'acquisition.
   Remarque: les configurations appropriées comprennent par exemple des microscopes line-éclairage balayant la ligne par ligne à la place du point par p échantillonoint. Une simple réalisation d'une telle installation a été décrit précédemment ^6. D'autres options sont la filature microscopes de disque. Si aucune configuration est disponible, il est encore possible de mesurer des zones plus petites avec une configuration normale de point de balayage.
2. Définissez les paramètres de mesure de sorte qu'un volume assez grand pour accueillir la taille d'un glomérule peut être couvert.
   Note: L'épaisseur typique d'un volume d'enregistrement est dans la plage de 20 pm qui devrait être couverte par au moins 5 couches.
3. Vérifiez toutes les mesures présynaptiques pour le blanchiment. Régler la puissance du laser jusqu'à ce que l'intensité de fluorescence moyenne des images enregistrées ne diminue pas au cours du temps de l'enregistrement.
4. Limiter le temps de mesure et de la zone pour les enregistrements sur le côté postsynaptique pour éviter le blanchiment autant que possible, bien que pour des mesures supérieures à 20-30 sec blanchiment est susceptible de se produire.

5. Odeur application et expériences de température

1. Verser 25ml de solution de Ringer fraîche (précédemment stockée à 4 ° C) dans un tube de 50 ml. Placer le tube dans un seau à glace.
2. Surveiller la température du Ringer refroidie par l'insertion de la sonde propre d'un thermomètre dans le tube. Attendez jusqu'à ce que la température descend en dessous de 1 ° C avant de commencer l'expérience.
3. Préparer 50 ml de L-histidine dissous dans une solution de Ringer à une concentration de 10 uM.
4. Utilisez un applicateur d'entonnoir ⁸ ou systèmes d'application similaires permettant la livraison de stimulation concomitante à la sonnerie perfuser de sorte que le débit d'eau dans la chambre reste constante et ininterrompue pendant la libération de la solution de relance. Positionnez l'entonnoir de telle sorte que la sortie distale est inférieure à 1 mm de l'épithélium olfactif.
5. Placer un capteur de température NiCr-Ni relié à un thermomètre numérique à proximité de l'épithélium et la sortie de l'applicateur en forme d'entonnoir. Câbler le port de sortie du thermomètre à un ordinateur pour enregistrer et visuellement disjouer des variations de tension reflétant les petites variations de température.
6. Avant de commencer l'expérience, connecter un autre thermosenseur à un thermomètre étalon pour établir le facteur d'échelle de tension-température.
7. Enquête sur la température du bain dans la chambre d'enregistrement et de veiller à ce qu'elle ne dépasse pas 22 ° C.
8. Démarrez l'acquisition d'images et d'appliquer séquentiellement 200-400 pi de Ringer à froid, L-histidine et Ringer température ambiante (20-22 ° C) par l'intermédiaire d'une pipette électronique avec un intervalle interstimulus de 20-30 sec. Pour un meilleur contrôle de l'application du stimulus, avec le stimulus libérer un signal de déclenchement envoyé par l'installation de formation d'image choisie à la pipette, si possible. Répéter le protocole d'application pour obtenir des résultats reproductibles.
9. Prenez des ensembles de plus longs enregistrements avec plusieurs séries de stimulation car ils sont préférables pour l'analyse post-imagerie avec l'imagerie activité de corrélation.
   Note: Un compromis entre la durée d'enregistrement et la viabilité de la tranche aêtre trouvé. Mesures d'environ 2 min couvrant 6 applications de relance fournissent une activité suffisante pour une bonne reconstruction du réseau.

6. Traitement d'images en utilisant l'activité Corrélation Imaging (ACI)

1. Traitement de l'image des enregistrements pré-synaptiques
   1. Dans des enregistrements avec une stimulation par une solution de Ringer froide et de l' histidine, de distinguer le γ-neuropile sensible à la température du glomérule histidine sensibles voisins par leurs profils de réponse différents (voir Kludt et al. ^5).
   2. Créer une projection d'intensité maximale dans la direction axiale à partir des enregistrements de la préparation du cerveau dans lequel Orns ont été électroporées avec deux colorants différents pour visualiser l'innervation bilatérale du γ-glomérule.
2. Traitement de l'image des enregistrements post-synaptiques Utilisation Activité Corrélation Imaging (ACI)
   1. Sélectionnez des enregistrements avec des points de temps suffisant (plus de 100 cadres) et une bonne quantité d'activité (au moins deux événements).
      Note: L'activité peut être soit spontanée de révéler les processus de cellules mitrales simples ou induite par plusieurs applications de stimuli au cours de la même enregistrement pour révéler les réseaux cellulaires activés par les stimuli olfactifs.
   2. Choisir les enregistrements où les structures de mesure se déplacent pas plus de 2 à 3 pixels au cours du temps de l'enregistrement.
      Remarque: Les enregistrements avec trop de mouvement peuvent être sauvés par l' application d' une procédure de correction de décalage décrit dans Kludt et al ^5.
   3. Vérifiez si les enregistrements souffrent de blanchiment. Si l'intensité moyenne de l'ensemble de l'image diminue au cours du temps de l'enregistrement, la correction de l'eau de Javel est nécessaire, sinon sauter les deux étapes suivantes.
   4. Calculer la tendance linéaire de la trace temporelle de chaque pixel en effectuant une régression linéaire.
   5. Soustraire le résultat de chaque pixel individuellement pour éliminer le componen linéairet du blanchiment.
      Remarque: En tant que raccord Legendre alternatif peut être utilisé comme décrit par Bao et Schild ^9.
   6. Télécharger le script prêt à utiliser MATLAB conjointement avec un guide étape par étape pour l' imagerie activité de corrélation (ACI) comme décrit par Junek et al. ⁶
      Remarque: Suivez les étapes décrites dans Junek et al ⁶ comme une alternative à l' aide du script MATLAB fourni..
   7. Déplacer de la aci.m 'les fichiers,' matVis.m 'et' aci_roiSelector.m 'du conteneur téléchargé sur le chemin MATLAB du système utilisé pour l'évaluation des données.
   8. Charger les données brutes acquises à l' étape 5.8 en tant que variable à l' utilisateur l'espace de travail Matlab organisée comme une -MATRIX [x, y, z, t] avec x et y se référant aux dimensions latérales, z, la direction axiale et t, au cours du temps .
   9. Call 'aci' à partir de la ligne de commande MATLAB.
   10. Dans l'interface utilisateur (UI),qui apparaît, sélectionnez «Préparer les données», puis sélectionnez la variable contenant les données et un répertoire dans lequel les résultats seront sauvegardés.
       Remarque: Pour une description complète de l'interface utilisateur voir le manuel accompagnant le script aci.
   11. Faites défiler les z-couches mesurées en déplaçant le curseur correspondant dans l'interface utilisateur pour obtenir une vue d'ensemble de la carte de la variance affichée.
   12. Entrez la taille de la région d'intérêt (ROI) dans l'interface utilisateur. Pour un corps cellulaire mitrale ajuster la ROI pour couvrir environ 10 um dans le sens latéral et 5 micromètres dans la direction axiale. Pour un glomérule, les valeurs légèrement plus élevées de 20 um latéralement et 10 um axialement sont appropriées.
       Note: La taille de retour sur investissement doit être entré comme un certain nombre de pixels, qui dépend de la mise à l'échelle du pixel choisi pour l'enregistrement.
   13. Sélectionnez un ROI contenant le γ-glomérule et des régions supplémentaires pour chaque soma visible des cellules mitrales environnantes en cliquant avec le bouton central de la souris sur le center de la cellule / glomérule.
   14. Fermez l'interface principale qui déclenche le calcul de la corrélation des cartes pour toutes les traces de référence. Le résultat est automatiquement enregistré et affiché.

Résultats

L'électroporation des neurones récepteurs olfactifs (NRO) a été réalisée avec des colorants Alexa Fluor ou des indicateurs de calcium conjugués avec des molécules Dextran pour l'étiquetage antérograde via le transport axonal actif. Alors que les anciens colorants fournissent une coloration brillante des neurones sensoriels et leurs terminaux axone ramification dans la couche glomérulaire du bulbe, ce dernier permettent la mesure de l' activité neuronale dans ces cellules (figures 1 et 2). En premier lieu , la position de la γ-glomérule thermosensibles et de son innervation a été visualisé par électroporation de Alexa Fluor 647 Dextran et Alexa Fluor 546 Dextran dans l'épithélium olfactif gauche et à droite, respectivement (figure 1A). Vingt-quatre heures après la procédure, les Orns dans les narines, les deux nerfs olfactifs et les glomérules, dans les deux hémisphères sont visibles en microscopie à fluorescence. Les différents groupes de glomérulaire étaient Identifiable par leurs positions respectives, notamment le petit groupe comprenant le γ-glomérule (figure 1B). Un petit nombre de fibres olfactives controlatérale a couru à travers le bulbe olfactif controlatéral, traversé la commissure antérieure et terminée dans le ipsilatéral γ-glomérule (figure 2A).

Afin d'enregistrer les réponses calciques présynaptiques des fibres de la γ-glomérule, le calcium vert Dextrane a été électroporé dans Orns, selon la même procédure. Négatif sauts de température ont été induites à la narine par la libération contrôlée de solution de Ringer glacée (0-1 ° C). Un volume 3D comprenant le γ-glomérule a été imagée sous une ligne à illumination microscope confocal rapide. ATS de -1 ° C sont suffisantes pour déclencher des réponses froides dans le γ-glomérule et ses afférences, reconnaissables comme des pics réversibles dans les AF / F Ca ²⁺ traces (figure 2B </ strong>, C).

D'autres étapes expérimentales ont été réalisées pour mesurer l'activité induite par le froid dans les cellules mitrales reliées à la γ-glomérule par l'intermédiaire de leurs terminaisons dendritiques ramifiées. Ces fibres postsynaptiques et le neuropile environnant ont effectivement été colorées par bolus de chargement du colorant sensible au calcium Fluo-huit heures, effectuées quelques jours après Alexa 647 Dextran avait été électroporation dans ORNs (figure 3A, B). mitrale cellules ont été remplis avec du Fluo-huit heures, et l'épithélium olfactif a été stimulé deux fois selon le modèle suivant: Ringer froid, l'histidine (10 pM) et la température ambiante de Ringer, appliqué par la suite. Deux traces de référence ont été prélevés dans des régions d'intérêt dans le volume enregistré, un répondant exclusivement aux baisses de température, l'autre, à l'histidine seulement. Activité corrélation imagerie (ACI) ⁶ a été calculé basé sur la référence sélectionnéetraces pour visualiser avec un contraste élevé de la morphologie dendritique des réseaux postsynaptiques correspondant soit à la température ou le signal de ^{Ca2 +} histidine sensible (figure 3C, D). Enfin, des cartes thermosensibles et chimiosensibles étaient codés par couleur et superposées les unes sur les autres, en montrant comment la température et de l' information chimique est transporté de glomérules individu aux neurones de second ordre olfactifs (Figure 3E). Pour une description de l'intégration et de traitement des deux types d'information dans les réseaux olfactifs partagés, consultez Kludt et al. ⁵

Figure 1: Vue d' ensemble de l'ORN électroporation et bolus chargement (A) neurones récepteurs olfactifs dans les deux cavités nasales de X.. laevis larves ont été électroporation avec des colorants Alexa ou Calcium sensibles à des colorants couplés à des molécules de dextrane. Les indicateurs fluorescents ont été transportés anterogradely jusqu'à ce que l'arborisation axonale terminal. 24 heures après l'électroporation, la couche glomérulaire dans les deux hémisphères a présenté une coloration fluorescente. (B) Représentation schématique de l'organisation cellulaire du bulbe olfactif dans un hémisphère. La couche glomérulaire couvre l'ampoule en grappes: les grappes médiales, petites, intermédiaires et latérales. informations olfactives sont transférées à partir des neurones récepteurs de cellules mitrale via les synapses excitatrices glomérules. cellules periglomerular et les cellules granulaires sont des neurones inhibiteurs modulant le traitement et le codage olfactif. Le γ-glomérule (cyan) a été facilement identifié comme étant le petit neuropile où ipsilatéral (rouge) et de fibres olfactives (orange) controlatéral fusionnés. (C) Bolus chargement a été réalisé au voisinage de la γ-glomérule pour colorer le neuropile post-synaptique comprenant principalement des cellules mitrales et leur dendriarbres tic ramification considérablement dans la couche glomérulaire. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2: Electroporation de Orns révèle une connectivité structurelle et fonctionnelle (A) innervation bilatérale du γ-glomérule par ipsilatéral (vert) et (rouge) neurones récepteurs olfactifs controlatérale (NRO).. Barre d'échelle = 50 pm. (B) le bulbe olfactif après électroporation avec le colorant Calcium sensible au calcium vert dextran. Le intermédial (IMC), médian (MC) et le petit groupe (SC) sont visibles. L'image est une projection maximale de 100 um volume de mesure d'épaisseur. Barre d'échelle = 50 pm. (C) Vue rapprochée du petit groupe. Le volume enregistré (12 pm) estreprésentée dans une projection maximale. L'image représente le niveau de fluorescence basale sur la carte grise et le AF code couleur / F comme une superposition. La réponse maximale à la stimulation avec une solution de Ringer à froid est tracée. Le γ-glomérule a réagi fortement tandis que les deux glomérules voisins restent silencieux. L'encart montre le tracé AF / F pour la γ-glomérule correspondant à la région d'intérêt indiqués. La barre bleue représente l'application du stimulus. Barre d'échelle = 20 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3:. Bolus chargement et ACI dissocient thermosensible et réseaux chimiosensibles (A) axones des ORNs se terminant dans le petit groupe ont été colorées par électroporation avec le non-calcium colorant sensible Alexa 647 Dextran. La ligne en pointillés indique le γ-glomérule. (B) Image de la même région que dans (A) dans le second canal de mesure après un bolus de chargement avec le colorant sensible au calcium Fluo-huit heures. Certains corps cellulaires mitrale étaient visibles, mais le contraste était limité. Suivant les flèches, deux traces de réponse ont été tracées, qui ont été utilisés pour l'imagerie activité de corrélation (ACI). Bleu, barres rouges et noirs en dessous des traces représentent le début d'application de Ringer froide, histidine (10 uM) et la température ambiante Ringer de contrôle négatif, respectivement. Les traces ^des deux Ca ont été prises à partir de différentes régions d'intérêt du volume mesuré. (C) Le résultat ACI de la trace dans (B) mettant en évidence les zones répondant principalement à Ringer froide. (D) Le résultat ACI de la trace dans (B) en soulignant les domaines qui répondent principalement à l' histidine. (E) Superposition des deux cartes ACI. cellules mitrales répondant à histidine et le glomérule innervé (rouge) étaient faciles à distinguer des cellules mitrales thermosensibles et le γ-glomérule (cyan). Toutes les images de cette figure sont des projections d'intensité maximale d'un volume de 28 um d'épaisseur. Barre d'échelle = 20 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Les méthodes présentées ici visent à la transformation de la température d'enregistrement dans le bulbe olfactif de têtards de Xenopus laevis. Les taches de premier protocole et des neurones de second ordre dans le bulbe olfactif et fournit une préparation de l'échantillon, dans lequel le système olfactif reste essentiellement intact. Ainsi, l'activation de la γ-glomérule sensible à la température peut être contrôlée et comparée à ses glomérules voisins chimio-sensibles. L'innervation bilatérale unique de cette glomérule est visualisée par électroporation cellulaire avec spectralement différents colorants. En outre, bolus de chargement permet la coloration des cellules mitrales couvrant un grand volume dans le bulbe olfactif. Les signaux induits par la température de traitement de réseau de neurones est révélée par la prise de mesures de calcium avec des applications répétées de relance et d'analyser ensuite les données avec l'imagerie activité de corrélation.

Le protocole met en évidence deux coloration sophistiquée proce dures, qui exigent tous deux la manipulation et à la pratique prudente afin d'obtenir des résultats satisfaisants et reproductibles. Au cours de l'électroporation toute blessure des animaux doit être évitée, en particulier lors du positionnement des électrodes dans les narines. De manière optimale, sans contact avec l'épithélium olfactif doit se produire. Notez que les animaux sont encore vivants après la procédure d'électroporation et de leur temps de récupération doivent être prises en compte. Si la coloration est encore trop faible après un tour de l'électroporation, qui peut se produire en fonction des types de colorants utilisés, son intensité peut être améliorée en augmentant la concentration de colorant dans les narines. Etant donné que les molécules de dextrane couplées sont transportés par l' intermédiaire de plusieurs mécanismes , y compris le transport axonal lent (à une vitesse de 1 à 2 mm / jour ¹⁰⁾ et la diffusion passive, une autre solution consiste à attendre 48 heures après l' électroporation avant de sacrifier les animaux. En variante, l'électroporation peut être répétée après un jour de récupération.

jove_content "> Bolus chargement est une étape cruciale puisque la quantité de colorant entrant dans les cellules mitrales est difficile à réguler et dépend de différents paramètres tels que la taille de la pointe de la pipette et l'emplacement de l'application. Le suivi de la procédure sous un microscope à fluorescence confocale se révèle être utile pour le réglage de la durée d'application de colorant et générant ainsi des résultats de coloration similaires dans les préparations. en outre, les têtards précédemment électroporation devrait être utilisé pour déterminer la meilleure position pour l'application du colorant en identifiant la position du petit groupe (comprenant le γ-glomérule). la plupart étape critique lors des mesures est d'éviter à la fois décalage et le blanchiment de l'échantillon. le décalage peut être évité en positionnant soigneusement le flux Ringer sous le microscope. Comme pour limiter le blanchiment de la zone d'intérêt, le temps de mesure doit être réduite à l'essentiel .

Bolus chargement de coloration avec des colorants sensibles au calcium ne fournit qu'une trèscontraste limité puisque les cellules saines ont généralement faible taux de calcium et donc montrer faible fluorescence basale. L'application de l'imagerie activité de corrélation contourne cette limitation en générant contraste sur la base de l'activité et met en évidence les structures avec des signaux calciques similaires. Cette méthode d'analyse post-acquisition calcule le facteur de corrélation entre le signal de calcium d'une région sélectionnée d'intérêt (trace de référence) et celle de chaque pixel individuel dans le volume 3D. Par conséquent, les résultats obtenus dépendent fortement sur le modèle d'activité sélectionnée comme trace de référence. Si l'objectif principal est de visualiser les modèles d'innervation des cellules mitrales, un signal de référence dérivé de l'activité neuronale spontanée est préférable, et en choisissant les cellules mitrales les plus actifs produira les meilleurs résultats. Pour révéler les réseaux chimio- ou thermosensibles de cellules mitrales, des traces de référence ne contenant que des réponses aux deux histidine ou Ringer à froid doivent être choisis. La sélection d'un ensemble de glomérule or soma cellulaire mitrale comme région d'intérêt ne peuvent pas toujours fournir une trace de référence clair, surtout si les structures répondant aux deux stimuli différents sont couchés les uns sur les autres. Dans un tel cas, il est souvent utile de sélectionner une zone plus petite du glomérule ou le corps cellulaire comme région d'intérêt.

Au cours des dernières décennies, l' électroporation a été décrite comme une méthode efficace pour colorer les cellules uniques ou multiples ^11,12. Ici, il est utilisé pour marquer spécifiquement les neurones récepteurs olfactifs. Des molécules de dextrane conjuguées donnent le rendement le plus élevé, et la non-colorants sensibles au calcium, la gamme de choix est large et couvre tout le spectre généralement utilisé dans la microscopie à fluorescence ^13. Cependant, les colorants sensibles au calcium, qui sont soumises à une électroporation avec succès dans les neurones récepteurs olfactifs sont actuellement limitées à dextran de calcium-vert, et Fluo-4 dextran si elle est toujours disponible dans le commerce. En outre, les enregistrements ciblent principalement superficial couches sur la face ventrale du bulbe olfactif seulement, car la profondeur des techniques de mesure rapides de pénétration est limitée. l'imagerie à deux photons peut partiellement surmonter cette limitation mais manque souvent de vitesse et limite la quantité de colorants sensibles au calcium sélectionnables davantage.

Nous avons décrit ici un protocole de mesure de l'activité induite par la température dans le bulbe olfactif. Le neuropile du cerveau est analysé comme un volume en trois dimensions pour visualiser les réseaux cellulaires complexes impliqués dans le traitement olfactif de la température. Mesure de l' activité induite par la température dans le bulbe olfactif a été très récemment rapporté ⁵ et nécessite une procédure spécialement personnalisée combinant différentes techniques. Un atout majeur des techniques présentées ci-dessus est que des centaines de cellules sont imagées en trois dimensions dans une préparation où la majeure partie du système olfactif reste intact. Ces avantages ont des exigences élevées sur les techniques de coloration, ainsi que le cerveau pla réparation et l'imagerie. Par exemple, l'électroporation des cellules et un bol de chargement ont atteint une grande quantité de cellules dans l'épithélium olfactif et du bulbe, et permettent ainsi la visualisation des réseaux cellulaires complets. En outre, la fourniture d'indicateurs chimiques via bolus chargement au lieu de fluorophores génétiquement encodés permet des mesures dans un ensemble potentiellement plus d'espèces. D'autres alternatives comme l'incubation de bain avec des colorants AM travaillent principalement dans les tranches qui endommagent le bulbe olfactif sévèrement, ne laissant que quelques centaines de micromètres de tissu intact. En comparaison, l'ensemble de la préparation de montage utilisé dans notre protocole garantit par exemple que l'innervation bilatérale du γ-glomérule reste intacte et les enregistrements sont ainsi pris dans un système encore en vigueur. Enfin, l'imagerie elle-même est effectuée par microscopie ligne d'éclairage permettant l'acquisition de volumes 3D. La microscopie Ligne-éclairage est l' une des techniques confocales fournissant les taux d'acquisition plus élevés possibles ^{6 <}/ Sup> qui sont nécessaires pour couvrir une grande partie du bulbe olfactif. Les systèmes d'acquisition plus lentes peuvent être utilisés mais présentent l'inconvénient que la taille du volume nominal doit être réduite. Au cours des dernières années, d' autres méthodes pour l' acquisition rapide d'images ont été développées et peuvent être utilisés comme solutions de rechange ^14,15. Néanmoins, la microscopie line-éclairage reste l'une des méthodes les plus simples pour gagner de la vitesse et une résolution suffisante. Voici quelques informations suivantes comme lignes directrices pour la sélection des configurations d'imagerie appropriés. Depuis l'imagerie de calcium se fait dans des préparations de cerveau épais, la configuration devrait fournir confocalité décent et les objectifs devraient avoir des ouvertures numériques de 1.0 ou supérieur. Pour un point de référence, les enregistrements effectués avec le microscope d'éclairage linéaire correspondent à des images prises avec un microscope à balayage laser standard avec une taille sténopé de 0,5-1 unités spacieuses. la vitesse d'acquisition rapide est souhaitable. Un volume d'une épaisseur de 20 um recouverte d'au moins 5 layers, un champ latéral de vue de 100 um x 100 um et une taille de pixel de 0,5 um ou moins doit être balayé à une vitesse minimale de 1 Hz par pile. La réduction de la confocalité peut augmenter la quantité de photons comptés et permet ainsi des acquisitions plus rapides si nécessaire, mais présente l'inconvénient d'enregistrer plus de lumière out-of-focus. Toutefois, étant donné qu'une telle approche augmente l'épaisseur des tranches optiques, il peut effectivement faciliter le traçage des dendrites à travers les différents plans z après l' application de l' ACI ^6.

Les outils nécessaires pour étudier intensivement le traitement de la température dans les réseaux de bulbe olfactif sont présentés ici. l'activité induite par la température est enregistrée dans les première et deuxième neurones d'ordre par l'intermédiaire des colorants et des signaux à la fois arrivée et au départ de la γ-glomérule sensibles au calcium. En outre, la mesure dans laquelle les processus à la fois chimique et thermique des informations peuvent être évaluées cellules mitrales individuelles. Depuis la préparation de leafs le bulbe olfactif intact, le rôle de l'innervation bilatérale dans le traitement olfactif peut encore être étudiées. La procédure est également utile pour révéler si et comment thermo- et chemoinformation est codé dans les réseaux qui se chevauchent ⁵ olfactifs. Enfin, les techniques mentionnées ci-dessus ne sont pas limitées à l'étude des réponses de température dans le bulbe olfactif, mais peuvent être appliqués à une évaluation plus générale du système olfactif, en particulier les réseaux de traitement cellulaires en trois volumes de grandes dimensions. Bolus chargement et imagerie activité de corrélation sont des outils puissants pour observer et comparer l'activité de dizaines de neurones, ce qui les rend applicables aux différents réseaux cérébraux ^16.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Sodium chloride	Merck Millipore	1064040500
Potassium chloride	Merck Millipore	1049360250
Calcium chloride dihydrate	Merck Millipore	1023820250
Magnesium chloride hexahydrate	Merck Millipore	1058330250
D(+)-Glucose	Merck Millipore	1083371000
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
HEPES	Merck Millipore	1101100250
Calcium Green 10 kDa Dextran	Thermo Fisher Scientific	C-3713
Dextran, Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	D-22914
Dextran, Alexa Fluor 546	Thermo Fisher Scientific	D-22911
Fluo-8 AM	TEFlabs	203
MK571	Alexis Biochemicals	340-021-M005
MS-222	Sigma-Aldrich	E10521
Pluronic acid F-127	Sigma-Aldrich	P2443	powder
L-Histidine monohydrochloride monohydrate	Sigma-Aldrich	53370
DMSO	Merck Millipore	1029522500
Equipment
Electronic pipette	BrandTech	HandyStep Electronic Repeating Pipette
NiCr-Ni thermocouple	Greisinger Elektronik	GTF 300
Micropipette puller	Narishige	Model PC-10	two-step puller
Funnel applicator	(Custom-made)
Line-illumination microscope	(Custom-made)		otherwise, a commercially available spinning disk microscope
Objective W Plan-Apochromat 63X/1.0	Zeiss	441470-9900-000
Objective W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC	Zeiss	441452-9900-000
Software
MATLAB	The MathWorks		from R2010b upwards