Запись температурное нейронную активность посредством мониторинга изменений кальция в обонятельной луковицы<em&gt; Xenopus Laevis</em

Резюме

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

Аннотация

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the γ-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the γ-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca²⁺ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Введение

Over the last years, temperature sensitivity has no longer been described as a somesthetic sense only, but also as a physiological function relevant for the olfactory system. In rodents, the main olfactory bulb receives input from the Grueneberg ganglion (GG), an organ in the nasal cavity, consisting of thermosensitive neurons. GG neurons respond to cool temperatures¹ as well as to chemical stimuli, and their chemosensitivity is modulated by temperature fluctuations². These observations suggest that the olfactory bulb may integrate chemical and temperature information collected at the nose. In order to explore this hypothesis, we present here a set of experiments enabling the detection of temperature responses in the olfactory bulb of non-transgenic animals, using the Xenopus laevis larva as a model. The organization of the olfactory system in these animals closely resembles that of mammals. The olfactory receptor neurons of premetamorphic X. laevis terminate in tufts, and make synaptic contacts with the dendrites of second-order neurons, the mitral cells. Pre- and postsynaptic fibers intermingle and form skein-like neuropil structures called glomeruli³. The abundant synapses of the glomerular layer represent the first processing center of olfactory information. Mitral cells further integrate the sensory input and convey it to higher olfactory areas.

We have developed a protocol combining electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) with calcium-sensitive and non-sensitive dyes followed by bolus loading of the postsynaptic network of glomeruli and mitral cells. The staining by electroporation of two spectrally distinct dyes loaded in the nasal cavities serves to single out the γ-glomerulus³ through its bilateral innervation by ORNs from both olfactory epithelia. Thus, the location of the γ-glomerulus is identified prior to further measurements. Subsequently, bolus loading⁴ with Fluo-8 acetoxymethyl (Fluo-8 AM) is carried out in a volume comprising the γ-glomerulus. Imaging calcium changes with fast confocal microscopy allows the visualization of temperature responses in the 3D neuropil surrounding the γ-glomerulus, a unique temperature-sensitive glomerulus in this system⁵. Mitral cells innervating this specific structure can also be identified by their Ca²⁺ signals responsive to induced temperature drops. Next, activity correlation imaging⁶ uses the specific Ca²⁺ traces of these cells to reveal the dendritic morphology of thermosensitive mitral cells. Alternating repeated applications of cold Ringer solution and chemical odorants in one measurement can be used to visualize the mitral cell networks for odor and temperature processing surrounding the γ-glomerulus and identify potential overlaps. To unambiguously assign the responses to either the chemical or the temperature stimulus, we constantly monitor temperature at the olfactory epithelium.

протокол

Все эксперименты с Xenopus Laevis головастиков были проведены в соответствии с руководящими принципами , утвержденными Комитетом по Университетской Геттингена этики в экспериментированию животного происхождения .

1. Электропорация

1. Выбор животных этапов 49-54 в соответствии с Nieuwkoop и Faber ^7.
2. Убедитесь, что настройки записи состоит из стереомикроскопа с большим рабочим расстоянием и электропорации устройством, которое может применяться импульсы напряжения 20 В в течение 20 мс с частотой не менее 2 Гц. Применение импульсов напряжения с помощью двух платиновых электродов с шероховатой диаметром 200 мкм, таким образом, что они могут быть вставлены в ноздри головастиков ", не причинив ущерба.
3. Готовят кристаллы декстрана конъюгированного красителя (например, кальций Зеленый 10 кДа декстран, или Alexa Fluor 647 10 кДа декстран) путем растворения обычно поставляется количестве 5 мг в течение примерно 100 мкл дистиллированной воды и давая маленькие капельки2 мкл сухого на листе парафильмом.
   Примечание: Кристаллы сухой менее чем за один день и может храниться после этого при -18 ° C в морозильной камере в течение более года.
4. Обезболить животных, помещая их в водопроводной воде, содержащей 3% Tricaine метансульфоната в течение 1-2 мин, пока он не достигнет хирургического состояния наркоза характеризуется снижением частоты сердечных сокращений, потеря всех движений и отсутствие реакции на механические раздражители.
5. Погрузить наркозом животное в течение 10 сек в чистой водопроводной воде.
6. Поместите животное на гелевой подушке и зафиксировать его путем размещения иглы вокруг него, не нанося ущерба его.
   Примечание: Не закрепляйте животное тыкая иглы через кожу.
7. Осторожно высушить область вокруг ноздрей с тканью.
8. Поместите животное под стереомикроскопа и сосредоточиться на ноздри.
9. Используйте пинцет, чтобы забрать кристалл красителя размера, соответствующего ноздрю отверстие, поместите его в одном из носовой полости и ждать, пока он не растворится полностью, шHICH занимает менее 1 мин. Если кристаллы имеют меньшие размеры, добавьте 2 или 3 в каждую полость, пока они не производят, не полупрозрачный высокооплачиваемую концентрированного раствора.
10. Поместите катод на коже головастика и анодом в одну из ноздрей.
    Примечание: Данный параметр применяется к красителей, приведенных в пункте 1.3. Для красителей с различной полярности, результаты окрашивания могут быть улучшены путем размещения катода в ноздри. Если вы не уверены полярности красителя, оба электрода могут быть размещены одновременно в ноздри (по одному на ноздрю), а также полярность чередовались между одиночными импульсами напряжения.
11. Применить шесть импульсов 20 V и 20 мс с примерно 0,5 сек интервала стимула.
    Примечание: Мелкие пузырьки должны появляться вокруг электрода в ноздрю во время электропорации при условии, что электроды находятся в контакте с кожей, и раствор в ноздрю. Если никаких пузырей не видно, проверьте соединительные кабели и убедитесь, что электропорации Девиче доставляет желаемый импульс напряжения.
12. Повторите эту процедуру (1.9-1.11) для второго ноздрю.
13. Перенести электропорации головастика в стакан, наполненный водопроводной водой при комнатной температуре. Подождите от 5 до 10 мин, пока животное приходит в сознание и продолжает свое плавание. Кормить его и дайте ему восстановиться в течение по крайней мере 1 день, в течение которого краситель транспортируется вдоль обонятельного нерва в обонятельную луковицу.
14. Использование электропорации животных в течение 1-7 дней после электропорации для достижения наилучших результатов визуализации. Дайте по крайней мере 24 раз ч для транспортировки красителя и восстановления до визуализации.

2. Всего горе Подготовка

1. Обезболить животное в водопроводной воде, содержащей 3% Tricaine метансульфоната, пока все движения не прекратились, и он больше не реагирует на механические раздражений.
2. Перенести головастика в гель подушки под стереомикроскопа и закрепить его плотно тыкая иглы через кожу на каждой стороне фоrebrain.
3. Жертвоприношение головастика путем разъединять его спинной мозг.
4. Используйте скальпель , чтобы рассечь из блока ткани , содержащей оба носовые полости, обонятельные нервы и обонятельные луковицы (рис 1А). Сделайте первый надрез близко к левой ноздрей-не прикасаясь к нему-и переместить лезвие вперед резку рядом с левой обонятельного нерва и луковице до конечного мозга-диэнцефальных границы. Сделать то же самое с правой стороны. Изолировать препарат от остальной части нервной системы, сделав окончательный вырезать заднюю к телэнцефалоне.
5. Утилизировать тело головастика и аккуратно переверните блок ткани с ног на голову так, чтобы брюшная сторона подготовки мозга была обращена вверх.
6. Зафиксируйте блок ткани снова, вставив две иглы между обонятельных нервов.
7. Поместите каплю раствора лягушки Рингера (98 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 1 мМ CaCl _2, 2 мМ MgCl _2, 5 мМ глюкозы, 5 мМ Na-пируват, 10 мМ HEPES, рН доводили до 7,8, osmolaпасности 230 мОсмоль / л) на ткани.
8. Удалить мозговых оболочек, покрывающих зону сортировки аксонов и обонятельные луковицы, сделав три насечки с помощью тонких ножниц. Начиная от заднего края блока ткани, не разрезать caudorostrally близко вдоль левого обонятельную луковицу до точки входа обонятельных нервов в луковицы (сортировки зоны аксонов).
9. Повторите шаг 2.8 для правого полушария.
10. Поднимите мозговые оболочки с пинцетом и сделать третий разрез, перпендикулярно к предыдущим на сортировочной зоне аксона.
    Примечание: брюшная сторона обонятельной луковицы теперь доступна для работы с изображениями и болюсной нагрузки.
11. Для улучшения качества изображения в проходящем свете изображения, повторите процедуру для спинной стороне. Эти дополнительные шаги могут облегчить навигацию микропипетки для загрузки болюса, но не является строго необходимым.
12. Передача образца в регистрирующей камере, заполненной лягушкой Рингера для дальнейшей обработки и визуализации. Сделать sЮр, что брюшная сторона обращена вверх и закрепить образец с сеткой из нейлоновых волокон, натянутых над небольшой рамкой платины.
13. Для более легкого применения раздражителей место носовой полости в верхней части одной из нейлоновых волокон.

3. Пилюли Загрузка

1. Растворить 50 мкг AM кальция красителя (например, Fluo-8 АМ) в 20 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) , содержащих 20% Pluronic F-127 (вес / объем) , чтобы приготовить исходный раствор AM красителя. Замораживание растворы в виде небольших аликвот 1-2 мкл объема. Исходный раствор стабилен в течение по крайней мере полгода, но избежать циклов замораживания-оттаивания.
2. Используйте микропипетки съемник и тянуть пипетки с сопротивлением 5-8 МОм и диаметром кончика 1-2 мкм.
3. Растворите Приготовленный исходный раствор красителя в растворе Frog Рингера при концентрации 250-500 мкМ.
4. Добавить MK571, чтобы достичь концентрации 500 мкМ блокировать транспортеров множественной лекарственной устойчивости.
5. Заполните микропипетки с 10 мкл раствора, используя удлиненный наконечник пипетки и удалить все пузырьки воздуха, щелкая микропипетки.
6. Установите микропипетки в держатель пипетки и убедитесь, что давление может быть применен либо вручную с помощью шприца или устройства выброса лекарственного средства пневматического и контроля приложенного давления с манометром.
7. Если возможно, используйте настройки микроскопа с возможностью возбуждения впрыскивается краситель, так что отток из кончика микропипетки можно визуализировать и корректироваться. В идеале, используйте конфокальной настройки изображения. Используйте прямой микроскоп с целью погружения таким образом, что ткань может быть достигнуто с помощью микропипетки.
8. Поместите весь препарат гору под микроскопом, не следовать обонятельный нерв до лампочки и сосредоточиться на интересующей области в обонятельную луковицу.
9. Заливать свежий раствор Рингера через камеру для записи с целью повышения жизнеспособности препарата и вымывать протечки красителяот кончика микропипетки.
10. Опустить пипетку на поверхность обонятельной луковицы, с кончиком, направленным в ростральной направлении подготовки.
11. Нанесите небольшое и постоянное положительное давление (~ 25 гПа) к микропипетки, чтобы предотвратить засорение пипетки и аккуратно вставьте его в ткань.
12. После того, как пипетка нарушила слои внешние ткани, переместить его в ростро-спинные направлении в митрального слоя клеток. (Обратите внимание, что счетчик окрашивание обонятельных нейронов рецепторов путем электропорации является полезным для регулировки положения микропипетки в.) В идеале, поместить кончик пипетки на расстоянии 50-100 мкм от нужного участка записи.
    1. Для окрашивания термочувствительный гамма-клубочки, целевая область около 50 мкм ростральным с позиции пресинаптической нейропиле & gamma; клубочка.
13. Нанести положительное давление в диапазоне 100-200 гПа. Регулировка силы давления в зависимости от размерамикропипетки наконечник. Подтвердите отток из пипетки, наблюдая за движениями незначительные ткани, видимые под Brightlight освещении, когда давление применяется впервые.
14. Поддерживать постоянное давление в течение приблизительно 10 мин в то время как микропипетка остается в ткани. Если это возможно, проверьте нейропиля в то же время для клеточной нагрузки при флуоресцентном освещении, как успешная загрузка приведет к видимым клеток somata окрашивание с увеличением интенсивности с течением времени.
    Примечание: Часто причиной неудачной загрузки является пипетка засорение из-за ткани, поступающей в наконечник или агрегированных кластеров красителя. Иногда удается спасти пипетку, аккуратно нарушая ее кончик к нижней поверхности камеры записи. Тем не менее, кончик пипетки не должен превышать нескольких микрометров. Компенсировать большие отверстия пипетки путем применения более низкого давления во время болюсной нагрузки.
15. После 10 мин нагрузки, снижения приложенного давления до нуля и проверить окрашивание.
    Заметка: Размер запятнанной области значительно варьируется и зависит от нескольких параметров, таких как количество впрыскиваемого красителя и местоположение участка выброса. Хорошее окрашивание занимает площадь около 100 мкм × 100 мкм.
16. Если окрашивали область слишком мала или не покрывает нужного участка записи, повторите шаги 3.10-3.13. Используйте тот же микропипетки для следующей инъекции, если он еще не забит.
17. Подождите, по крайней мере, через 30 мин после последней инъекции перед началом каких-либо экспериментов, чтобы позволить поглощение красителя и деэтерификацией. Продолжайте заливать записи камеры со свежим раствором Рингера во все времена.

4. Настройки измерения

1. Убедитесь, что установка измерения состоит из конфокальной микроскопии с достаточной скоростью, чтобы записывать трехмерные объемы. Выберите скорость получения по меньшей мере 1 Гц на стек.
   Примечание: Подходящие расстановок включают, например, линии освещения микроскопов сканирования образца линии премудрого вместо точки на рoint. Простая реализация такой установки было описано ранее ^6. Другие опции вращающийся диск микроскопов. Если такая настройка не доступна, она по-прежнему можно измерить меньшие площади с нормальной установки точки сканирования.
2. Установите параметры измерений, так что могут быть покрыты объем достаточно большой, чтобы соответствовать размеру клубочка.
   Примечание: Типичная толщина объема записи находится в диапазоне от 20 мкм, которые должны быть защищены, по крайней мере, 5 слоев.
3. Проверьте все пресинаптические измерения для отбеливания. Регулировка мощности лазера до тех пор, средней интенсивности флуоресценции записанных изображений не не падает в течение временного хода записи.
4. Ограничение времени измерения и область для записи на постсинаптической стороне, чтобы избежать отбеливания как можно больше, хотя для измерений, превышающих 20-30 сек отбеливанию, вероятно, произойдет.

5. Запах Применение и температуры Эксперименты

1. Залить 25мл свежего раствора Рингера (ранее хранили при 4 ° C) в 50 мл пробирку. Поместите пробирку в ведерке со льдом.
2. Монитор температуры охлажденного Ringer, вставив чистый щуп термометра в трубку. Подождите, пока температура не опустится ниже 1 ° С перед началом эксперимента.
3. Приготовьте 50 мл L-гистидин, растворенный в растворе Рингера при концентрации 10 мкМ.
4. Используйте воронку аппликатор ⁸ или аналогичные системы , приложение позволяет доставку стимула одновременно к перфузионного Ringer так, чтобы поток воды в камере остается постоянным и непрерывным во время выпуска раствора стимула. Поместите воронку таким образом, чтобы дистальный выход составляет менее 1 мм от обонятельный эпителий.
5. Поместите датчик температуры NiCr-Ni, соединенный с цифровым термометром близко к эпителию и выходе из воронки аппликатора. Соедините выход термометр порт к компьютеру для записи и визуально дисиграть изменения напряжения, отражающие небольшие колебания температуры.
6. Перед началом эксперимента, подключить другой термодатчик к стандартному термометра, чтобы установить коэффициент масштабирования напряжения к температуре.
7. Произведите съемку температуры ванны в регистрирующей камере, и обеспечить, чтобы она не превышала 22 ° С.
8. Начало получения изображения и последовательно применять 200-400 мкл холодной Ringer, L-гистидин и при комнатной температуре Ringer (20-22 ° C) с помощью электронной пипетки с межстимульный интервалом 20-30 сек. Для лучшего контроля применения стимула, выпустите стимул с триггерным сигналом, посланного от выбранной настройки изображения на пипетке, если это возможно. Повторите прикладной протокол для воспроизводимых результатов.
9. Возьмите наборы длинных записей с нескольких раундов стимуляции, так как они являются более предпочтительными для анализа пост-обработки изображений с активностью корреляционной обработки изображений.
   Примечание: компромисс между временем записи и жизнеспособность среза имеетбыть найденным. Измерения приблизительно 2 мин , охватывающих 6 стимул приложений обеспечивают достаточную активность для хорошей реконструкции сети.

6. Обработка изображений с помощью активности Корреляция изображений (ACI)

1. Обработка изображений из пресинаптических записей
   1. В записях с стимуляции холодным раствором Рингера и гистидин, различают термочувствительный гамма-нейропиля из соседнего гистидин-чувствительных клубочки их различными профили отклика (см Kludt и др. ^5).
   2. Создание максимальную проекцию интенсивности в осевом направлении от записи препарата мозга, в котором ORNs были электропорации с использованием двух различных красителей для визуализации двустороннюю иннервацию гамма-клубочка.
2. Изображение Обработка постсинаптической записи с использованием корреляции активности визуализации (ACI)
   1. Выберите записи с достаточными моменты времени (более 100 кадров) и приличное количество активности (по крайней мере, два события).
      Примечание: активность может быть либо стихийное выявить процессы одиночных митральных клеток или индуцированных несколькими применениями раздражителей во время той же записи, чтобы выявить сотовые сети, активированные обонятельные раздражители.
   2. Выберите записи, где измеренные структуры двигаться не более 2-3 пикселя за время хода записи.
      Примечание: Записи со слишком большим количеством движения можно спасти путем применения процедуры коррекции сдвига , описанный в Kludt и др ^5.
   3. Проверьте, правильно ли страдают записи с отбеливанием. Если средняя интенсивность всего изображения падает на время хода записи, коррекция отбеливателя необходимо, в противном случае пропустите следующие два шага.
   4. Вычислить линейный тренд для времени следа каждого пикселя путем выполнения линейной регрессии.
   5. Вычтем из каждого пикселя в отдельности, чтобы устранить линейную COMPONENт при отбеливании.
      Примечание: В качестве альтернативы Лежандра фитинг может быть использован , как описано Bao и Schild ^9.
   6. Скачать готовый к использованию MATLAB сценарий вместе с руководством шаг за шагом для активности корреляционной обработки изображений (ACI) , как описано Junek и др. ⁶
      Примечание: Выполните шаги , описанные в Junek и др ⁶ в качестве альтернативы , используя предоставленный MATLAB сценарий..
   7. Переместить файлы 'aci.m', 'matVis.m' и '' aci_roiSelector.m из загруженного контейнера в пути MATLAB системы, используемой для оценки данных.
   8. Загрузите исходные данные , полученные на этапе 5.8 в качестве переменной в пользовательское рабочее пространство MATLAB организовал как [х, у, г, т] -матрица с х и у ссылаясь на поперечных размеров, г, в осевом направлении и т, время хода ,
   9. Call "ACI" из командной строки MATLAB.
   10. В пользовательском интерфейсе (UI),который появляется, выберите "Подготовка данных", а затем выбрать переменную, содержащую данные и каталог, в котором будут сохранены результаты.
       Примечание: Для получения полного описания пользовательского интерфейса см руководстве пользователя сценарий ACI.
   11. Прокрутка измеренных Z-слоев, перемещая соответствующий ползунок в пользовательском интерфейсе, чтобы получить обзор карты отклонений отображается.
   12. Введите размер области интереса (ROI) в пользовательском интерфейсе. Для митральной клетки сомы регулировать ROI, чтобы охватить приблизительно 10 мкм в поперечном и 5 мкм в осевом направлении. Для клубочка, что несколько выше значения 20 мкм с боков и 10 мкм в осевом направлении являются подходящими.
       Примечание: Размер ROI должен быть введен как число пикселей, которое зависит от масштабирования пикселей, выбранного для записи.
   13. Выберите ROI, содержащий гамма-клубочки и дополнительные области для каждого видимого сомы окружающих митральных клеток, нажав на среднюю кнопку мыши на центрог клеточного / клубочек.
   14. Закройте главный пользовательский интерфейс, который инициирует вычисление корреляции карт для всех эталонных трасс. Результат автоматически сохраняется и отображается.

Результаты

Электропорации обонятельных нейронов рецепторов (ORNs) была достигнута с Alexa Fluor красители или индикаторы кальция, сопряженных с декстран молекул для маркировки антероградного через активные аксонов транспорта. В то время как прежние красители обеспечивают яркое окрашивание сенсорных нейронов и их аксонов разветвление в клубочковой слое луковицы, последние позволяют измерять нейронной активности в этих клетках (фиг.1 и 2). Во- первых, положение термочувствительной гамма-клубочки и ее иннервацию модель визуализировали электропорации Alexa Fluor 647 декстрана и Alexa Fluor 546 декстрана в левой и правой обонятельной эпителии, соответственно (Рис . 1А) Двадцать четыре часа после процедуры, то ORNs в ноздри, два обонятельные нервы и клубочки в обоих полушариях были видны при люминесцентной микроскопии. Различные кластеры клубочков были identifiaBLE их соответствующими позициями, в частности , малый кластер , содержащий гамма-клубочки (Фигура 1В). Небольшое количество контрлатеральных обонятельных волокон пролегал через контралатеральной обонятельной луковице, пересек переднюю спайки и прекращается в ипсилатеральная γ-клубочки (рис 2А).

Для записи ответов кальция пресинаптических волокон гамма-клубочки, кальция Зеленый декстран электропорации ORNs, в соответствии с той же процедурой. Отрицательные скачки температуры индуцировали в ноздрю с помощью контролируемого высвобождения льдом раствор Рингера (0-1 ° С). 3D-объем, содержащий гамма-клубочки изображался при быстрой линии освещения конфокальной микроскопии. ΔTs -1 ° C было достаточно , чтобы вызвать холодные реакции в гамма-клубочки и ее афференты, узнаваемый как обратимые пиков в следах ; F / F Ca ²⁺ (рис 2B </ сильный>, C).

Дальнейшие экспериментальные шаги были проведены для измерения холодной индуцированной активности в митральных клеток, связанных с гамма-клубочек через их разделяющийся дендритных окончаний. Эти постсинаптические волокна и окружающие нейропиля были эффективно окрашивали болюсной загрузки красителя кальций-чувствительный Fluo-8 утра, проводили через несколько дней после того, как Alexa 647 Декстран были электропорации в ORNs (рис 3A, B). Митральных клеток были заполнены Fluo-8 утра, а обонятельный эпителий был стимулирован дважды в соответствии со следующей парадигме: холодная Рингера, гистидин (10 мкМ) и при комнатной температуре Рингера, применяется впоследствии. Два опорных следов были взяты из областей, представляющих интерес в записанном объеме, один отвечая исключительно перепадов температуры, другой, на гистидин только. Корреляция активности томографию (ACI) ⁶ была вычислена на основании выбранной ссылкипрослеживает для визуализации с высоким контрастом дендритной морфологии постсинаптических сетей , соответствующих либо к температуре или гистидин реагирующих Ca ²⁺ сигнала (рис 3C, D). И, наконец, термочувствительные и чувствительных карты были цветом и наложены друг на друга, показывая , как температура и химическая информация передается от индивидуального клубочков от обонятельных нейронов второго порядка (рис 3e). Для описания интеграции и обработки обоих типов информации в совместно используемых обонятельные сетях см Kludt и др. , ⁵

Рисунок 1: Обзор ORN электропорации и болюсной нагрузки (А) обонятельные нейроны рецептора в обоих носовых полостей X.. Laevis личинки электропорации с Alexa красителей или calciuм чувствительные красители, соединенные с молекул декстрана. Флуоресцентные индикаторы не были перевезены anterogradely до терминала аксонов разветвление. 24 ч после электропорации, клубочковой слой в обоих полушариях показали флуоресцентного окрашивания. (Б) Схематическое клеточной организации обонятельной луковицы в одном полушарии. Клубочковой слой охватывает луковицу в кластерах: медиальной, малые, промежуточные и боковые кластеры. Обонятельный информация передается от нейронов рецепторов к митральных клеток с помощью возбуждающих синапсов в клубочках. Periglomerular клетки и клетки гранула являются ингибирующие нейроны модулирующие обонятельный обработку и кодирование. Γ-клубочек (циан) был легко идентифицирован как небольшой нейропиля где ипсилатеральное (красный) и контралатеральной (оранжевые) обонятельные волокна слиты. (С) болюса нагрузка была достигнута в непосредственной близости от гамма-клубочки окрашивать постсинаптической нейропиля , состоящих главным образом из митральных клеток и их dendriтиковые деревья значительно ветвящиеся в клубочковой слое. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Электропорация ORNs показывает структурную и функциональную связность (А) Двустороннее иннервации гамма-клубочки на ипсилатеральной (зеленый) и контралатеральной (красный) обонятельные нейроны рецептора (ORNs).. Шкала бар = 50 мкм. (B) , обонятельную луковицу после электропорации с кальцием красителя кальций-чувствительных Зеленый декстран. Интермедиальная (IMC), медиальная (MC) и малый кластер (SC) открыты. Изображение представляет собой максимальный выступ мкм толщиной измерительный объем 100. Шкала бар = 50 мкм. (C) Крупным планом вид небольшого кластера. Записанный объем (12 мкм)представлена ​​в максимальной проекции. Изображение изображает базального уровня флуоресцентного серым цветом и цветом / карте; F F в качестве наложения. Максимальный ответ на стимуляцию холодный раствор Рингера наносится. Γ-клубочек сильно реагировала в то время как два соседних клубочков молчать. На вставке показан след; F / F для гамма-клубочки, соответствующей указанной области, представляющей интерес. Синяя полоса представляет собой применение стимулов. Шкала бар = 20 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рис . 3: Пилюли погрузка и ACI диссоциируют термочувствительных и чувствительных сетей (А) аксоны ORNs , заканчивающихся в небольшом кластере окрашивали с помощью электропорации с не Calciгм чувствительный краситель Alexa 647 декстран. Пунктирная линия очерчивает гамма-клубочки. (Б) изображение той же области, что и в (А) во втором канале измерения после болюсной нагрузки с красителем кальция Fluo-чувствительный-8 утра. Некоторые митрального клеток somata были видны, но контраст был ограничен. После стрелок, два следа ответа были нанесены, которые были использованы для активности корреляционной обработки изображений (ACI). Синий, красный и черные полосы ниже следов изображают начало применения холодной Ringer, гистидин (10 мкМ) и при комнатной температуре Ringer в качестве отрицательного контроля, соответственно. Эти два Ca ²⁺ следы были взяты из различных областей , представляющих интерес измеренного объема. (C) ACI результат следа в (B) выделения областей реагируя преимущественно холодной Ringer. (D) ACI результат следа в (B) выделения областей реагируя преимущественно гистидин. (Е) Накладка из двух ACI карт. Митрального клетки реагируют на чistidine и иннервируются клубочек (красный) были легко отличимы от термочувствительных митральных клеток и гамма-клубочки (Cyan). Все изображения этой фигуры являются максимальными проекции интенсивности 28 мкм толщиной объема. Шкала бар = 20 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Методы , представленные здесь , направлены на температурной обработке записи в обонятельная луковица Xenopus Laevis головастиков. Протокола пятна первые и нейроны второго порядка в обонятельную луковицу и обеспечивает образец препарата, в котором обонятельная система остается в основном нетронутыми. Таким образом, активация чувствительного к температуре гамма-клубочек можно контролировать и по сравнению с его химио чувствительных соседних клубочков. Уникальный двусторонний иннервации этого клубочка визуализируется клеток электропорации с спектрально различных красителей. Кроме того, болюс нагрузка позволяет окрашивании митральных клеток, охватывающих большой объем в обонятельную луковицу. Нейронные сигналы температуры индуцированной обработки сети обнаруживается, проводя измерения кальция при повторных применений стимула и последующего анализа данных с активностью корреляционной обработки изображений.

Протокол выделяет два сложных окрашивания проце дур, оба из которых требуют осторожного манипулирования и практики с целью достижения удовлетворительных и воспроизводимых результатов. Во время электропорации любой травмы животных следует избегать, особенно при расположении электродов в ноздри. Оптимально, никакого контакта с обонятельный эпителий не должно происходить. Обратите внимание, что животные все еще живут после процедуры электропорации, и их время восстановления должны быть приняты во внимание. Если окрашивание остается слишком слабым, после того, как один раунд электропорации, который может произойти в зависимости от типов используемых красителей, его интенсивность может быть повышена за счет увеличения концентрации красителя в ноздри. Поскольку декстран связью молекулы транспортируются через несколько механизмов , в том числе и медленной аксонов транспорта (при скорости 1-2 мм / день ¹⁰⁾ и пассивной диффузии, другая альтернатива должна ждать 48 часов после электропорации , прежде чем умерщвления животных. В качестве альтернативы, электропорация может повторяться после того, как один день восстановления.

jove_content "> Пилюли загрузки является важным шагом, так как количество красителя ввод митральных клеток трудно регулировать и зависит от различных параметров, таких как размер пипетку и расположение приложения. Контроль процедуры под конфокальной флуоресцентной микроскопии оказывается полезным для регулируя длительность применения красителя и, таким образом, генерируя аналогичные результаты окрашивания через препаратов. Кроме того, ранее электропорации головастиков следует использовать для определения оптимального положения применения красящей путем определения положения небольшого кластера (включающего гамма-клубочки). наиболее важным шагом в процессе измерений, чтобы избежать как сдвиг и отбелки образца. сдвиг можно избежать путем тщательного позиционирования потока Ringer под микроскопом. Как ограничить отбеливанию интересующей области, измерение времени должно быть сведено к существенным ,

Пилюли нагрузка окрашивание кальция чувствительных красителей только обеспечивает оченьограниченный контраст, так как здоровые клетки, как правило, имеют низкий уровень кальция и, таким образом, показывают слабую базальной флуоресценции. Применяя деятельность корреляционной обработки изображений обходит это ограничение путем создания контраста на основе деятельности и выдвигает на первый план структур с аналогичными сигналами кальция. Этот метод анализа после приобретения вычисляет коэффициент корреляции между сигналом кальция выбранной области интереса (опорной трассы), и что каждого отдельного пикселя в 3D объеме. Таким образом, полученные результаты сильно зависят от характера активности, выбранной в качестве опорной трассы. Если основной акцент делается для визуализации митрального моделей клеток иннервации, опорный сигнал получен из спонтанной активности нейронов является предпочтительным, и выбор наиболее активных митральных клеток даст наилучшие результаты. Для выявления химио- или термочувствительным сети митральных клеток, опорные следы только содержащие ответы на любой из гистидина или холодной Ringer должны быть выбраны. Выбор целой клубочек OR митральный сомы клеток в области, представляющей интерес, может не всегда обеспечивают четкую опорной трассы, особенно если структуры, отвечающие на двух различных раздражителей, лежащих друг на друга. В таком случае, часто бывает полезно, чтобы выбрать меньшую площадь клубочек или тела клетки в качестве области, представляющей интерес.

В последние десятилетия, электропорации был описан как эффективный способ окрашивать одну или несколько ячеек ^11,12. Здесь он используется для специально маркировать обонятельные нейроны рецептора. Декстран-конъюгированные молекулы дают самую высокую эффективность, а также для чувствительных красителей без кальция, диапазон выбора широк и охватывает полный спектр обычно используемый в флуоресцентной микроскопии ^13. Тем не менее, кальций-чувствительные красители, которые успешно электропорации в обонятельные нейроны рецептора в настоящий момент ограничивается кальций-зеленый декстран, и Fluo-4 декстран, если до сих пор имеются в продаже. Кроме того, записи в первую очередь цель superficiaл слоев на вентральной поверхности только обонятельной луковицы, так как глубина проникновения быстрых методов измерений ограничено. визуализация Двухфотонного может частично преодолеть это ограничение, но часто не хватает скорости и ограничивает количество выбираемых кальция чувствительных красителей далее.

Мы описали здесь протокол для измерения температуры индуцированной активности в обонятельной луковице. Нейропиля мозг сканируется в качестве трехмерного объема для визуализации сложных сотовых сетей, участвующих в обонятельной обработке температуры. Измерение температуры индуцированной активности в обонятельной луковице было совсем недавно сообщили ⁵ и требует специально настроенную процедуру , комбинируя различные методы. Основным активом методов, представленных выше, является то, что сотни клеток изображаются в трех измерениях в препарате, где большая часть обонятельной системы остается неизменным. Эти преимущества предъявляет высокие требования к технике окрашивания, а также мозга рвозмещения ущерба и формирования изображения. Например, клетка электропорации и болюс нагрузка попадание больших количеств клеток в обонятельный эпителий и колбой, и, таким образом, позволяют визуализировать полных сотовых сетей. Кроме того, поставка химических показателей с помощью болюсной нагрузки вместо генетически кодируемых флуорофоров позволяет проводить измерения в потенциально больший набор видов. Другие альтернативы, как ванны инкубации с АМ красителей в основном работают в срезах, которые повреждают обонятельной луковицы сильно, оставляя лишь несколько сотен микрометров неповрежденной ткани. Для сравнения, вся подготовка монтирования используется в нашем протоколе гарантирует, например, что двусторонний иннервации гамма-клубочки остается неповрежденным и записи, таким образом, приняты в еще оперативной системе. Наконец, сама визуализация осуществляется с помощью линейного освещения микроскопии, позволяющей приобретение 3D томов. Line-подсветка микроскопии является одним из конфокальных методов , обеспечивающих самые высокие цены приобретения ^{6 <}/ SUP>, которые необходимы, чтобы покрыть большую часть обонятельной луковицы. Более медленные системы сбора данных могут быть использованы, но имеют тот недостаток, что размер записанного объема должен быть уменьшен. В последние годы, другие методы быстрого получения изображения были разработаны и могут быть использованы в качестве альтернативы ^14,15. Тем не менее, линии освещения микроскопии остается одним из самых простых способов, чтобы получить и достаточную скорость и разрешение. Далее следует некоторую информацию в качестве руководства для выбора подходящих установок визуализации. Поскольку визуализация кальция производится в пределах от толстых препаратов мозга, установка должна обеспечивать достойную confocality и задачи должны иметь числовой апертуры 1,0 или выше. Для опорной точки, записи, сделанные с помощью линии освещения микроскопа соответствуют снимков, сделанных с помощью стандартного лазерного сканирующего микроскопа с точечным отверстием размером 0,5-1 воздушных единиц. Быстрая скорость сбора желательно. Объем с толщиной 20 мкм, покрыта, по меньшей мере, 5 лАйерс, боковое поле зрения мкм х 100 мкм 100 и размером пикселя 0,5 мкм или меньше, должны быть отсканированы при минимальной скорости 1 Гц на стек. Снижение confocality может увеличить количество фотонов, подсчитанных и, таким образом, позволяет быстрее приобретения в случае необходимости, но имеет недостаток, заключающийся в записи больше из фокуса свет. Тем не менее, так как такой подход увеличивает толщину оптических срезов, он может на самом деле содействия отслеживанию дендритов через различные Z-плоскостей после применения ACI ^6.

Необходимые инструменты для изучения широко обработки температуры в обонятельных луковиц сети представлены в настоящем документе. Температурное активность регистрируется в первом и втором нейронами порядка с помощью кальций-чувствительных красителей и сигналов обоих прибывающих и вылетающих из гамма-клубочка. Кроме того, степень, в которой отдельные обрабатывать митральных клеток как химических, так и температуры информация может быть оценена. Поскольку препарат LEAVES обонятельной луковицы неповрежденной, роль двустороннего иннервации в обонятельной обработки может быть дополнительно изучена. Эта процедура также полезна для выявления ли и как термо- и chemoinformation кодируется в пересекающихся обонятельные сетей ^5. И, наконец, методы, упомянутые выше, не ограничиваются изучением реакций температуры в обонятельную луковицу, но может быть применен и для более общей оценки обонятельной системы, особенно сотовых сетей, для обработки в больших трехмерных объемов. Пилюли нагрузки и активность корреляции изображений являются мощными инструментами для наблюдения и сравнить активность десятков нейронов, что делает их применимыми к различным сетям мозга ^16.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Sodium chloride	Merck Millipore	1064040500
Potassium chloride	Merck Millipore	1049360250
Calcium chloride dihydrate	Merck Millipore	1023820250
Magnesium chloride hexahydrate	Merck Millipore	1058330250
D(+)-Glucose	Merck Millipore	1083371000
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
HEPES	Merck Millipore	1101100250
Calcium Green 10 kDa Dextran	Thermo Fisher Scientific	C-3713
Dextran, Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	D-22914
Dextran, Alexa Fluor 546	Thermo Fisher Scientific	D-22911
Fluo-8 AM	TEFlabs	203
MK571	Alexis Biochemicals	340-021-M005
MS-222	Sigma-Aldrich	E10521
Pluronic acid F-127	Sigma-Aldrich	P2443	powder
L-Histidine monohydrochloride monohydrate	Sigma-Aldrich	53370
DMSO	Merck Millipore	1029522500
Equipment
Electronic pipette	BrandTech	HandyStep Electronic Repeating Pipette
NiCr-Ni thermocouple	Greisinger Elektronik	GTF 300
Micropipette puller	Narishige	Model PC-10	two-step puller
Funnel applicator	(Custom-made)
Line-illumination microscope	(Custom-made)		otherwise, a commercially available spinning disk microscope
Objective W Plan-Apochromat 63X/1.0	Zeiss	441470-9900-000
Objective W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC	Zeiss	441452-9900-000
Software
MATLAB	The MathWorks		from R2010b upwards