Microfluidique Buffer Exchange pour sans interférence Micro / Nanoparticules ingénierie cellulaire

Résumé

Ce protocole décrit l'utilisation d'une stratégie d'échange de tampon inertielle à base microfluidique pour purifier les cellules modifiées micro / nanoparticules avec l'épuisement efficace des particules non liées.

Résumé

cellules d'ingénierie avec micro ingrédient actif chargé / nanoparticules (IP) devient une méthode de plus en plus populaire pour améliorer les propriétés thérapeutiques indigènes, activer bio imagerie et contrôler le phénotype cellulaire. Une question cruciale encore insuffisamment abordée est le nombre important de particules qui restent non liés après marquage des cellules qui ne peuvent pas être facilement éliminé par centrifugation classique. Cela conduit à une augmentation de la bio bruit imagerie de fond et peut donner des effets transformateurs sur des cellules non-cibles voisines. Dans ce protocole, nous présentons un tampon stratégie d'échange inertiel à base microfluidique appelé comme Dean flux Fractionnement (DFF) pour séparer efficacement les cellules marquées de NPs libres d'une manière à haut débit. Le microdispositif spirale développé facilite la collecte continue (> de récupération des cellules de 90%) des cellules purifiées (THP-1 et CSM) en suspension dans une nouvelle solution tampon, tout en atteignant> 95% épuisement de colorant fluorescent non lié ou NPs colorant chargé (silique ou PLGA). Cette seule étape, la stratégie de purification de cellules basée sur la taille permet de haute cellule de traitement débit (10 ⁶ cellules / min) et est très utile pour un grand volume de purification de cellules de micro cellules / nanoparticulaires conçue pour parvenir à une application clinique sans interférence.

Introduction

Ingénierie des cellules par l' agent chargé des micro / nanoparticules (NP) est une méthode sans intégration, et polyvalent simple, génomique pour améliorer la capacité de bioimagerie et d' augmenter / compléter ses propriétés thérapeutiques indigènes en médecine régénérative. ^1-3 modifications cellulaires sont atteints par l' étiquetage de la membrane plasmique ou le cytoplasme avec une concentration supérieure à NPs __gVirt_NP_NN_NNPS<__ agents chargés pour saturer les sites de liaison. Cependant, un inconvénient majeur de cette méthode est que les quantités importantes de particules libres restant en solution après les processus d'étiquetage des cellules, ce qui peut potentiellement confondre l' identification précise des cellules de particules-ingénierie ou compliquer les résultats thérapeutiques. ^4,5 En outre, l' exposition aux NPs contenant transformatrice agents (facteurs de croissance, corticoïdes, etc.) à trop forte concentration peut causer la cytotoxicité et l' exposition mal dirigée peut induire des conséquences inattendues sur les cellules non-cibles. Même comprenant des supports particulaires of matériaux "biocompatibles" [par exemple, le poly (acide co-glycolique), PLGA] peuvent inciter les réponses des cellules immunitaires puissantes dans certaines conditions ainsi. ⁶ Ceci est particulièrement risquée chez les personnes souffrant d'une déficience de l' immunité (par exemple, la polyarthrite rhumatoïde) qui potentiellement retards clairance systémique de nanoparticules. ⁷ Ainsi, une élimination efficace des particules libres avant l'introduction de cellules de particules conçu est d' une grande importance pour réduire au minimum le profil de toxicité et de réduire l' exposition mal acheminés aux particules d'agent chargé in vivo.

Classique centrifugation à gradient est souvent utilisée pour séparer les cellules modifiées à partir de particules libres, mais est laborieux et exploité en mode par lots. En outre, les contraintes de cisaillement subies par les cellules lors de centrifugation à grande vitesse et les constituants du milieu de gradient de densité peut compromettre l' intégrité des cellules et / ou le comportement des cellules influence. ⁸ microfluidique est une alternative intéressante avec sevles technologies de séparation , y compris plu- déplacement latéral déterministe (DLD) ^9, dieletrophoresis ^10,11 et acoustophorèse ¹² développé pour les petites particules de séparation et les applications d'échange de tampon. Cependant, ces méthodes souffrent d' une faible débit (1-10 pi · min ^{- 1)} , et sont sujettes à des problèmes de colmatage. séparations actives telles que les méthodes basées sur diélectrophorèse nécessitent également des différences dans les phénotypes cellulaires diélectrophorétique intrinsèques ou des étapes de marquage des cellules supplémentaires pour atteindre la séparation. Une approche plus prometteuse consiste à microfluidique inertielle - la migration latérale des particules ou des cellules à travers rationalise de se concentrer sur des positions distinctes en raison de forces de portance dominantes (F _L) à haute nombre de Reynolds (Re) ¹³ En raison de ses conditions d'écoulement élevées et la résolution de taille supérieure. , il a souvent été exploitée pour des applications d'échange basés sur la taille de séparation des cellules ^14,15 et tampon. ^16-18 However, la performance d'échange de tampon reste pauvre avec une solution contaminant ~10-30% comme les cellules séparées restent généralement à proximité de la frontière entre des solutions originales et de nouveaux tampons. ^16-18 Plus important encore , la distribution de taille des cellules cibles doit être similaire pour atteindre inertielle mise au point précise et la séparation de la solution tampon initiale qui pose un problème particulier dans le traitement des types de cellules hétérogènes telles que la taille des cellules souches mésenchymateuses (CSM). ¹⁹

Nous avons déjà mis au point une nouvelle technique cellule microfluidique inertielle de tri appelé Dean flux Fractionnement (DFF) pour isoler les cellules tumorales circulantes (CTC) ²⁰ et les bactéries ²¹ du sang entier en utilisant un 2-entrée, dispositif de microcanaux spirale 2-sortie. Dans ce protocole vidéo, nous allons décrire le processus de cellules d'étiquetage THP-1 (lignée humaine de cellules de leucémie monocytaire aiguë) suspension monocytes (~ 15 um) et MSCs (10-30 um) avec calcéine-lNPs oaded, suivie par la fabrication et le fonctionnement du microdispositif en spirale FFD pour la récupération efficace des cellules marquées et l' élimination des IP non liées. ²² Cette stratégie unique de purification de l' étape permet la récupération en continu de suspension marqué et les cellules adhérentes en suspension dans une solution tampon frais sans centrifugation. En outre, il peut traiter jusqu'à 10 millions de cellules · ml ^-1, une densité de cellules qui se prêtent à des applications en médecine régénérative.

Protocole

1. Nanoparticules (NPs) Étiquetage des Cellules souches mésenchymateuses et monocytes

1. Les cellules souches mésenchymateuses de la culture (MSC) dans un milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et des antibiotiques à ≥80% de confluence avant l'étiquetage. De même, la culture des cellules THP-1 (ATCC) à Roswell Memorial Institute Park (RPMI) 1640 complété avec 10% de FBS à une densité de ~ 10 ⁶ cellules / ml.
2. NPs de silice de charge (~ 500 um) avec une solution de colorant calcéine (200 uM) en utilisant une nuit d'agitation. Fabriquez PLGA-calcéine AM (CAM) en utilisant un protocole décrit précédemment. ²²
   1. Dissoudre 250 pg CAM et 100 mg de PLGA (50:50) dans le chloroforme à 4 ° C.
   2. Générer NPs d'émulsion unique en utilisant un homogénéisateur à grande vitesse (13600 xg, 60 sec) à la température ambiante. Evaporer le chloroforme dans une hotte chimique (≥3 h) avant la collecte par centrifugation (3400 xg pendant 5 min), le lavage (DISTI doubleseau remplie), la lyophilisation et le stockage dans -20 ° C.
3. Incuber CAM-PLGA IP (1 mg) ou IP de silice calcéine (150 pg) dans le poly-L-lysine (PLL), solution à 0,01% à la température ambiante pendant 15 - 20 min.
4. Centrifuger à 3400 xg pendant 5 min pour éliminer le surnageant PLL en excès avant la remise en suspension NPs dans 1 ml de milieu de culture respective.
5. Incuber les NPs avec des cellules (MSCS ou THP-1, ~ 1 - 2 x 10 ⁶ cellules au total) pendant environ 24 heures (0,1 mg · concentration ml ^-1 étiquetage).
6. Se dissocie et récolter les cellules souches mésenchymateuses adhérentes marquées à l'aide de 2 ml de trypsine à 0,25% (5 min, 37 ° C) et étancher avec 6 ml de DMEM. Centrifuger les cellules à (1000 xg, 4 min) et remise en suspension à une concentration de 10 ⁵ - 10 ⁶ cellules / ml pour le traitement microfluidique. Utiliser marqués cellules THP-1 (10 ⁵ - 10 ⁶ cellules / ml) directement pour la purification de la microfluidique.

2. microfluidique Préparation de l'appareil

1. Fabrication de périphériques
   1. Fabriquer le dispositif microfluidique en spirale (500 um (w) x 115 um (h)) avec le polydiméthylsiloxane (PDMS) à partir d' un kit commercial en utilisant des étapes de lithographie douce standard. ²³
   2. Mélanger 30 g de prépolymère de base et 3 g agent de durcissement à fond dans un bateau de pesage. Dégazer le mélange dans un dessicateur pendant 60 min pour éliminer les bulles d'air.
   3. Verser le mélange PDMS sur le moule maître de la plaquette de silicium à motif avec la conception du canal en spirale avec précaution à une hauteur de environ 5 - 10 mm.
   4. Dégazer le mélange sous vide dessicateur pendant 60 min à nouveau pour éliminer les bulles d'air. Répétez le processus jusqu'à ce que toutes les bulles sont éliminées.
   5. Cure le mélange PDMS dans un four C 80 ° pendant 2 heures jusqu'à ce que le PDMS est réglé. Vérifiez que la plaquette est pas incliné lors de la cuisson pour avoir une hauteur de périphérique constante.
   6. Découpez le dispositif en spirale PDMS en utilisant un scalpel et éplucher soigneusement la dalle PDMS du moule maître.
   7. Trim les bords de l'appareil avec un scalpel pour assurer que la surface lisse pour le collage.
   8. Poinçonner deux trous (1,5 mm) pour les entrées et deux trous (1,5 mm) pour les sorties de l'appareil PDMS à l'aide d'une biopsie perforateur 1,5 mm.
   9. Laver l'appareil avec de l'isopropanol (IPA) pour enlever les débris et sécher l'appareil dans un four à 80 ° C pendant 5 min.
   10. Nettoyer la surface inférieure du dispositif de PDMS (avec des caractéristiques de canal) en utilisant du ruban adhésif.
   11. Nettoyer un côté d'une lame de verre (2 "par 3") en utilisant du ruban adhésif.
   12. Placez soigneusement et d'exposer les surfaces nettoyées du dispositif de PDMS et lame de verre dans la chambre d'un nettoyeur à plasma et les soumettre à vide pendant 60 sec. Ensuite, allumer la puissance du plasma au maximum et abaisser la pression de la chambre jusqu'à ce que la chambre devient rose en couleur.
       1. Exposer les surfaces à plasma d'air pendant 60 secondes. Le plasma crée des espèces réactives sur les surfaces exposées des PDMS et du verre qui permet une liaison étanche lorsqu'elle est mise en physical contact. Coupez l'alimentation de plasma et de libérer la pression du nettoyeur à plasma pour récupérer la lame de l'appareil et le verre.
   13. Coller le dispositif de PDMS et lame de verre en pressant ensemble les surfaces exposées au plasma hermétiquement et faire en sorte que l'absence de bulles sont piégées entre les deux surfaces.
   14. Chauffer le dispositif lié à l'aide d'une plaque fixée à 80 ° C pendant 2 heures pour renforcer la liaison.
2. Fonctionnement de l' appareil
   1. Coupez deux morceaux de tube (1,52 mm OD) de ~ 15 - 20 cm pour les seringues d'entrée et de joindre un embout de la seringue (jauge 23) sur une extrémité de chaque tube.
   2. Coupez deux morceaux de tube (1,52 mm OD) de ~ 5 - 10 cm pour les sorties et fixer aux trous de sortie du dispositif PDMS.
   3. Avant l'exécution de l'échantillon, le premier dispositif manuellement avec une seringue contenant 70% d'éthanol jusqu'à ce qu'il coule hors de la tubulure de sortie. Laisser reposer l'éthanol pendant 30 s à 1 min pour stériliser l'appareil.
   4. Charger 30 ml de filtre(0,2 um pores) du tampon de gaine (tampon phosphate salin (PBS) contenant 0,1% de sérumalbumine bovine (BSA)) dans la seringue de 60 ml et fixer la seringue sur une pompe à seringue. Réglez la pompe pour les paramètres corrects (taille de seringue: 60 ml, Volume: 60 000 pi).
      Remarque: L'addition de BSA PBS est de minimiser la liaison cellule-cellule et la liaison non spécifique entre les cellules et le dispositif de PDMS.
   5. Charge 3 ml de cellules marquées dans la seringue de 3 ml et fixer la seringue sur une pompe à seringue séparée. Réglez la pompe pour les paramètres corrects (taille de seringue: 3 ml, Volume: 3000 pi).
   6. Vérifiez qu'il n'y a pas de bulles d'air piégées dans les seringues pour assurer un flux stable. Éliminer les bulles d'air en éjectant doucement quelques gouttes de liquide hors de la buse.
   7. Connecter les conseils d'entrée de seringue et un tube pour les seringues, et les insérer dans les entrées respectives du dispositif (gaine et entrée de l'échantillon). Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles le long du tube.
   8. Monter les dispositifs sur un invertied microscope à contraste de phase pour l'imagerie en temps réel durant le processus de tri cellulaire.
   9. Fixer un petit bécher de déchets et deux tubes de 15 ml à proximité de l'appareil sur la platine du microscope en utilisant des adhésifs.
   10. Placer les tubes de sortie dans le bécher de déchets.
   11. Réglez le rapport d'écoulement pour l'échantillon de tampon de gaine à 1:10 et démarrer les deux pompes à seringue pour amorcer le processus de tri (Exemple: min pour seringue d'échantillon et 1200 ul min pour la gaine seringue 120 pi / /; la vitesse d'écoulement du canal ~ 0,38 m / sec ).
   12. Faire fonctionner l'appareil pendant 1,5 min pour le débit se stabiliser. Cela peut être confirmé par la présence de cellules inertially ciblées près de la paroi interne canal sous champ lumineux avec un contraste de phase en utilisant une caméra à haute vitesse (~ 5000 - 10.000 images par seconde (fps), le temps d'exposition: 10-50 microsecondes).
   13. Positionner les tubes de sortie dans les différents tubes pour recueillir les éluats de la sortie de la cellule et à la sortie des déchets.

Résultats

Après marquage des cellules avec bio imagerie IP de l' agent chargé d'une nuit, les cellules marquées (contenant des particules libres) sont récoltées et purifiées par FFD spirale microdispositif pour éliminer les IP libres dans un processus en une seule étape (figure 1A). Le 2-entrée, microcanaux spirale 2-sortie est conçu par des logiciels d'ingénierie et de microfabriqué utilisant SU-8. La plaquette de silicium à motif est ensuite utilisé com...

Discussion

La technologie de purification des cellules DFF décrit ici permet une séparation rapide et continue de cellules marquées d'une manière à haut débit. Cette approche de séparation est idéale pour un grand volume d'échantillon élevé ou le traitement des échantillons de concentration cellulaire, et est meilleure que la filtration à membrane à base conventionnelle qui est sujette à l'encrassement, après une utilisation prolongée. De même, la séparation magnétique basée sur l'affinité né...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell lines & Media
Mesenchymal Stem Cells (MSCs)	Lonza	PT-2501
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Lonza	12-614F
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-106
THP-1 monocyte cells (THP-1)	ATCC	TIB-202
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media	Lonza	12-702F
Reagents & Materials
0.01% poly-L-lysine (PLL)	Sigma-Aldrich	P8920
3 ml Syringe	BD	302113	Syringe 3 ml Luer-Lock
60 ml Syringe	BD	309653	Syringe 60 ml Luer-Lock
Bovine Serum Albumin (BSA)	Biowest	P6154-100GR
Calcein, AM (CAM)	Life Technologies	C1430
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875
Isopropanol	Fisher Chemical	#P/7507/17	HPLC Grade 2.5 L
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Lonza	17-516Q/12
Plain Microscope Slides	Fisher Scientific	FIS#12-550D	75 x 25 x 1 mm3
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	SYLGARD® 184
Scotch tape	3M	21200702044	18 mm x 25 m
Silica NPs (∼200 μm)	Sigma-Aldrich	748161	Pore size 4 nm
Syringe Tip	JEC Technology	7018302	23 G 0.013 x 0.25
Trypsin-EDTA (0.25%)	Life Technologies	25200-056
Tygon Tubing	Spectra-Teknik	06419-01	0.02 x 0.06" 100
Poly (D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA; 50:50)	Sigma-Aldrich	P2191
Equipment
Biopsy punch	Harris Uni-Core	69036-15	1.50 mm
Dessicator	Scienceware	111/4 IN OD
High-speed Camera	Phantom	V9.1
Inverted phase-contrast microscope	Nikon	Eclipse Ti
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-002
Syringe Pump	Chemyx	CX Fusion 200