Scambio Buffer Microfluidic per senza interferenze micro / nanoparticelle cellulare Ingegneria

Riepilogo

Questo protocollo descrive l'uso di una strategia di scambio tampone microfluidica basata inerziale per purificare cellule ingegnerizzate micro / nanoparticelle con efficiente esaurimento delle particelle non legate.

Abstract

cellule Engineering con micro-ingrediente attivo-caricato / nanoparticelle (NP) sta diventando un metodo sempre più popolare per migliorare le proprietà terapeutiche nativi, abilitare l'imaging bio e controllare il fenotipo delle cellule. Un problema critico ancora affrontato in modo inadeguato è il numero di particelle che rimangono non legato dopo l'etichettatura delle cellule che non può essere facilmente rimosso per centrifugazione convenzionale. Questo porta ad un aumento della bio rumore delle immagini di sfondo e può impartire effetti trasformativi sulle cellule non bersaglio adiacenti. In questo protocollo, presentiamo una strategia inerziale microfluidica a base di buffer di scambio definito come Dean flusso Frazionamento (DFF) per separare in modo efficiente cellule marcate da NP liberi in un modo elevato throughput. Il Microdevice spirale sviluppato facilita raccolta continua (> il recupero delle cellule del 90%) delle cellule purificate (THP-1 e MSC) sospese in nuova soluzione tampone, oltre a raggiungere> 95% esaurimento di colorante fluorescente non legato o NP dye-caricato (silica o PLGA). Questo single-step, la strategia di purificazione delle cellule size-based permette un throughput di elaborazione ad alta cella (10 ⁶ cellule / min) ed è molto utile per la purificazione delle cellule di grandi volumi di micro / cellule nanoparticelle progettato per realizzare applicazioni cliniche senza interferenze.

Introduzione

Ingegneria delle cellule da agenti caricato micro / nanoparticelle (NP) è un metodo di integrazione libera e versatile semplice, genomica per migliorare la capacità bioimmagini e aumentare / integrare le sue proprietà terapeutiche nativi nella medicina rigenerativa. ^1-3 modificazioni cellulari si ottengono l'etichettatura del membrana plasmatica o nel citoplasma con un eccesso di concentrazione di NP agente-caricato di saturare i siti di legame. Tuttavia, un grave inconveniente di questo metodo è la quantità significative di particelle non legate rimangono in soluzione dopo i processi di etichettatura delle cellule, che possono potenzialmente confondere precisa identificazione delle cellule di particelle-ingegnerizzato o complicare risultati terapeutici. ^4,5 Inoltre, l'esposizione a NP contenenti trasformativa agenti (fattori di crescita, corticosteroidi, ecc) a eccessivamente alta concentrazione possono causare citotossicità e l'esposizione mal possono indurre conseguenze non volute sulle cellule non bersaglio. Anche i portatori di particolato composto of materiali "biocompatibili" [per esempio, poli (co-glicolico acido lattico), PLGA] possono incitano potenti risposte delle cellule immunitarie in determinate condizioni pure. ⁶ Ciò è particolarmente rischiosa in individui con sistema immunitario compromesso (per esempio, l'artrite reumatoide) che potenzialmente ritardi sistemica pallone nanoparticella. ⁷ Pertanto, rimozione efficiente di particelle libere prima dell'introduzione delle cellule particelle-ingegnerizzato è di grande importanza per minimizzare profilo di tossicità e ridurre l'esposizione alle particelle misdirected agenti caricata in vivo.

Conventional centrifugazione gradiente è spesso usato per separare le cellule ingegnerizzate da particelle libere, ma è laboriosa e gestito in modalità batch. Inoltre, sforzi di taglio con esperienza da parte delle cellule durante la centrifugazione ad alta velocità ed i costituenti del mezzo gradiente di densità possono compromettere l'integrità delle cellule e / o il comportamento delle cellule influenza. ⁸ microfluidica è un'alternativa attraente con SEVtecnologie di separazione rale tra cui spostamento laterale deterministico (DLD) ^9, dieletrophoresis ^10,11 e acoustophoresis ¹² sviluppata per le piccole particelle di separazione e le applicazioni di scambio di buffer. Tuttavia, questi metodi soffrono di bassa produttività (1-10 ml · min ^{- 1)} e sono soggetti a intasamento problemi. separazioni attivi quali i metodi dielettroforesi basati richiedono anche le differenze di fenotipi cellulari dielettroforetica intrinseche o aggiuntive misure di etichettatura delle cellule per realizzare la separazione. Un approccio più promettente coinvolge microfluidica inerziale - la migrazione laterale di particelle o cellule attraverso semplifica mettere a fuoco in posizioni distinte a causa di forze di sollevamento dominanti (F _L) ad alto numero di Reynolds (Re) ¹³ Grazie alle sue condizioni di alta portata e la risoluzione dimensione superiore. , è stato spesso sfruttato per applicazioni di scambio di dimensioni basate su separazione delle cellule ^14,15 e di buffer. ^16-18 HoweveR, le prestazioni di Exchange tampone rimane povero con una soluzione di contaminante ~10-30% come le cellule separate di solito rimangono in prossimità del confine tra soluzioni originali e nuovo buffer. ^16-18 Ancora più importante, la distribuzione delle dimensioni delle cellule bersaglio deve essere simile a raggiungere precisa inerziale focalizzazione e separazione dalla soluzione tampone originale che pone un problema particolare nel trattamento di tipi cellulari eterogenei dimensioni come le cellule staminali mesenchimali (MSC). ¹⁹

Abbiamo già messo a punto una nuova tecnica di smistamento delle cellule inerziale microfluidica chiamato Dean flusso Frazionamento (DFF) per isolare le cellule tumorali circolanti (CTC) ²⁰ e batteri ²¹ dal sangue intero con un 2-ingresso, 2-outlet dispositivo microcanali spirale. In questo protocollo video, descriveremo il processo di cellule THP-1 di etichettatura (acuta linea cellulare monocitica leucemia umana) sospensione monociti (~ 15 micron) e MSC (10-30 micron) con calceina-lNP oaded, seguita da realizzazione e di funzionamento della spirale Microdevice DFF per recupero efficiente di cellule marcate e rimozione delle NP non legati. ²² Questa strategia unica purificazione passo consente il ripristino continuo della sospensione etichettati e cellule aderenti sospese in soluzione tampone fresco senza centrifugazione. Inoltre, si può elaborare fino a 10 milioni di cellule · ml ^-1, una densità cellulare suscettibili per applicazioni di medicina rigenerativa.

Protocollo

1. Le nanoparticelle (NP) Etichettatura delle cellule staminali mesenchimali e monociti

1. Le cellule staminali mesenchimali Cultura (MSC) in terreno di Dulbecco modificato Eagle (DMEM) supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS) e antibiotici per ≥80% di confluenza prima di etichettatura. Analogamente, la cultura cellule THP-1 (ATCC) in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 supplementato con 10% FBS ad una densità di ~ 10 ⁶ cellule / ml.
2. NP carico di silice (~ 500 micron), con soluzione colorante calceina (200 micron) con agitazione durante la notte. Realizzare PLGA-calceina AM (CAM) utilizzando un protocollo descritto in precedenza. ²²
   1. Sciogliere CAM 250 mg e 100 mg PLGA (50:50) in cloroformio a 4 ° C.
   2. Generare NP emulsione singoli utilizzando un omogeneizzatore ad alta velocità (13.600 xg, 60 sec) a temperatura ambiente. Si evapora il cloroformio in una cappa chimica (≥3 ore) prima della raccolta mediante centrifugazione (3.400 xg per 5 min), lavaggio (doppia distinta sacqua riempito), congelare-essiccazione e stoccaggio in -20 ° C.
3. Incubare CAM-PLGA NP (1 mg) o NP di silice calceina (150 mcg) a poli-L-lisina soluzione 0,01% (PLL) a temperatura ambiente per 15 - 20 min.
4. Centrifugare a 3.400 xg per 5 minuti per rimuovere l'eccesso PLL surnatante prima risospensione NP in 1 ml di terreno di coltura rispettivo.
5. Incubare le NP con le cellule (MSC o THP-1, ~ 1 - 2 x 10 ⁶ cellule in totale) per circa 24 ore (0,1 mg · concentrazione ml ^-1 etichettatura).
6. Dissociarsi e raccogliere le cellule staminali mesenchimali aderenti etichettati con 2 ml di 0,25% tripsina (5 min, 37 ° C) e spegnere con 6 ml di DMEM. Centrifugare le cellule a (1.000 xg, 4 min) e risospendere ad una concentrazione di 10 ⁵ - 10 ⁶ cellule / ml per l'elaborazione microfluidica. Utilizzare etichettati cellule THP-1 (10 ^{Giugno 5-10} cellule / ml) direttamente per la purificazione microfluidica.

2. Preparazione dispositivo a microfluidi

1. fabbricazione di dispositivi
   1. Realizzare il dispositivo a spirale microfluidica (500 micron (w) x 115 micron (h)) con polidimetilsilossano (PDMS) da un kit commerciale utilizzando passi litografia soft standard. ²³
   2. Mescolare 30 g del prepolimero base e 3 g induritore accuratamente in una barca pesatura. De-gas la miscela in un essiccatore per 60 minuti per eliminare le bolle d'aria.
   3. Versare il composto PDMS sul master stampo di wafer di silicio modellata con il disegno del canale a spirale attenzione ad un'altezza di ~ 5 - 10 mm.
   4. De-gas la miscela sotto vuoto essiccatore per 60 minuti ancora per rimuovere eventuali bolle d'aria. Ripetere il processo fino a quando tutte le bolle vengono eliminati.
   5. Curare la miscela PDMS in un forno a 80 ° C per 2 ore fino a quando il PDMS è impostato. Assicurarsi che il wafer non sia inclinato durante l'indurimento ad avere un'altezza costante dispositivo.
   6. Tagliare il dispositivo a spirale PDMS con un bisturi e la buccia con attenzione la lastra PDMS dallo stampo master.
   7. Trim i bordi del dispositivo con un bisturi per assicurare superficie liscia per incollaggio.
   8. Punzone due fori (1,5 mm) per gli ingressi e due fori (1,5 mm) per le prese sul dispositivo PDMS utilizzando una biopsia perforatore 1,5 mm.
   9. Lavare il dispositivo con isopropanolo (IPA) per rimuovere eventuali detriti e asciugare il dispositivo in un forno a 80 ° C per 5 min.
   10. Pulire la superficie inferiore del dispositivo PDMS (con le caratteristiche del canale) con nastro adesivo.
   11. Pulire un lato di un vetrino (2 "3") mediante nastro adesivo.
   12. Posizionare con cura ed esporre le superfici pulite del dispositivo PDMS e vetrino nella camera di un pulitore plasma e sottoporli a vuoto per 60 sec. Successivamente, accendere il plasma potere al massimo e abbassare la pressione nella camera finché la camera diventa di colore rosa.
       1. Esporre le superfici a plasma ad aria per 60 sec. Il plasma crea le specie reattive sulle superfici esposte delle PDMS e vetro che consente di legame stretto quando entrano in fisicaal contatto. Spegnere l'alimentazione al plasma e rilasciare la pressione dal più pulito al plasma per recuperare il vetrino dispositivo e vetro.
   13. Incollare il dispositivo PDMS e vetrino insieme premendo le superfici plasma esposte ermeticamente, senza far bolle sono intrappolati tra le due superfici.
   14. Riscaldare il dispositivo accoppiato mediante una piastra fissata a 80 ° C per 2 ore per rafforzare il legame.
2. Funzionamento del dispositivo
   1. Tagliare due pezzi di tubo (1,52 millimetri OD) di ~ 15 - 20 cm per le siringhe di aspirazione e collegare una siringa (calibro 23) su una estremità di ciascun tubo.
   2. Tagliare due pezzi di tubo (1,52 millimetri OD) di ~ 5 - 10 cm per le prese e fissare i fori di uscita del dispositivo PDMS.
   3. Prima di campionare esecuzione, manualmente adescare il dispositivo con una siringa contenente il 70% di etanolo fino fuoriesce dal tubo di uscita. Lasciare il sit etanolo per 30 secondi a 1 minuto per sterilizzare il dispositivo.
   4. Caricare 30 ml di filtrato(0,2 micron pori) tampone guaina (Phosphate-Buffered Saline (PBS) con 0,1% di sieroalbumina bovina (BSA)) nella siringa 60 ml e fissare la siringa su una pompa a siringa. Impostare la pompa per le impostazioni corrette (dimensioni della siringa: 60 ml, Volume: 60.000 ml).
      Nota: L'aggiunta di BSA PBS è ridurre al minimo vincolante cellula-cellula e vincolante tra le cellule e il dispositivo PDMS non specifico.
   5. Carico 3 ml di cellule marcate nella siringa 3 ml e fissare la siringa su una pompa a siringa separata. Impostare la pompa per le impostazioni corrette (dimensioni della siringa: 3 ml, Volume: 3.000 ml).
   6. Verificare che non bolle d'aria intrappolate nelle siringhe per garantire un flusso stabile. Rimuovere eventuali bolle d'aria estraendo delicatamente alcune gocce di liquido dall'ugello.
   7. Collegare le punte ingresso siringa e tubo per le siringhe, e inserirli nei rispettivi ingressi del dispositivo (guaina e ingresso campione). Assicurarsi che non vi siano bolle lungo il tubo.
   8. Montare i dispositivi su un invertitoEd microscopio a contrasto di fase per l'imaging in tempo reale durante il processo di selezione delle cellule.
   9. Fissare un piccolo bicchiere di rifiuti e due provette da 15 ml in prossimità del dispositivo sul palco microscopio con adesivi.
   10. Posizionare i tubi di scarico nel bicchiere rifiuti.
   11. Impostare il rapporto di flusso per il campione di tampone guaina a 1:10 e iniziare a entrambe le pompe siringa per avviare il processo di smistamento Esempio (: per siringa campione e 1200 microlitri per guaina siringa 120 microlitri / min / min; velocità di flusso del canale ~ 0,38 m / sec ).
   12. Eseguire il dispositivo per 1,5 min per il flusso si stabilizzi. Questo può essere confermato dalla presenza di cellule inerziale focalizzate vicino alla parete interna del canale in campo chiaro con contrasto di fase usando una macchina fotografica ad alta velocità (~ 5.000 - 10.000 fotogrammi al secondo (fps), il tempo di esposizione: 10-50 msec).
   13. Posizionare i tubi di uscita in diverse provette per raccogliere gli eluenti dalla presa cellulare e uscita dei rifiuti.

Risultati

Dopo l'etichettatura delle cellule con bio di imaging NP agente-caricato durante la notte, le cellule marcate (contenente particelle libere) vengono raccolte e purificate dal DFF spirale Microdevice per rimuovere NP liberi in un unico processo passo (Figura 1A). Il 2-ingresso, microchannel spirale 2-presa è stato progettato da un software di ingegneria e microfabbricazione usando SU-8 fotosensibile. Il wafer di silicio modellato viene quindi utilizzato come modello ...

Discussione

La tecnologia di purificazione delle cellule DFF qui descritta consente la separazione rapida e continua di cellule marcate in maniera elevata produttività. Questo approccio separazione è ideale per grandi volumi campione o campione di trasformazione alta concentrazione cellulare, ed è meglio di filtrazione su membrana a base convenzionale che è soggetta a intasamento dopo un uso prolungato. Analogamente, separazione magnetica affinità basata richiede ulteriori operazioni di etichettatura cellule che sono laboriosi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell lines & Media
Mesenchymal Stem Cells (MSCs)	Lonza	PT-2501
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Lonza	12-614F
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-106
THP-1 monocyte cells (THP-1)	ATCC	TIB-202
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media	Lonza	12-702F
Reagents & Materials
0.01% poly-L-lysine (PLL)	Sigma-Aldrich	P8920
3 ml Syringe	BD	302113	Syringe 3 ml Luer-Lock
60 ml Syringe	BD	309653	Syringe 60 ml Luer-Lock
Bovine Serum Albumin (BSA)	Biowest	P6154-100GR
Calcein, AM (CAM)	Life Technologies	C1430
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875
Isopropanol	Fisher Chemical	#P/7507/17	HPLC Grade 2.5 L
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Lonza	17-516Q/12
Plain Microscope Slides	Fisher Scientific	FIS#12-550D	75 x 25 x 1 mm3
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	SYLGARD® 184
Scotch tape	3M	21200702044	18 mm x 25 m
Silica NPs (∼200 μm)	Sigma-Aldrich	748161	Pore size 4 nm
Syringe Tip	JEC Technology	7018302	23 G 0.013 x 0.25
Trypsin-EDTA (0.25%)	Life Technologies	25200-056
Tygon Tubing	Spectra-Teknik	06419-01	0.02 x 0.06" 100
Poly (D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA; 50:50)	Sigma-Aldrich	P2191
Equipment
Biopsy punch	Harris Uni-Core	69036-15	1.50 mm
Dessicator	Scienceware	111/4 IN OD
High-speed Camera	Phantom	V9.1
Inverted phase-contrast microscope	Nikon	Eclipse Ti
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-002
Syringe Pump	Chemyx	CX Fusion 200