간섭이없는 마이크로 / 나노 입자의 세포 공학을위한 미세 유체 버퍼 교환

요약

이 프로토콜은 언 바운드 입자의 효율적인 고갈과 마이크로 / 나노 입자 설계 세포를 정화하는 관성 미세 유체 기반의 버퍼 교환 전략의 사용을 설명합니다.

초록

활성 성분 로딩 마이크로 / 나노 입자 공학 세포 (NPS는) 고유 치료 특성을 향상 바이오 이미징 활성화 및 세포 표현형을 제어하기 점점 더 많이 사용되는 방법이되고있다. 중요한 아직 부적절하게 해결 문제는 쉽게 기존의 원심 분리로 제거 할 수없는 셀 라벨 후 언 바운드 남아있는 입자의 상당수입니다. 이 생체 촬상 배경 잡음의 증가를 초래하고 인접 비 표적 세포 상 변화시키는 효과를 부여 할 수있다. 이 프로토콜에서는, 우리는 효율적으로 높은 처리량 방식으로 무료 NP에에서 표지 세포를 분리 딘 흐름 분획 (DFF) 되나 관성 미세 유체 기반의 버퍼 교환 전략을 제시한다. 결합되지 않은 형광 염료 또는 염료 로딩 된 NP (SIL의> 95 % 고갈을 달성하면서 개발 된 나선형 마이크​​로 디바이스는, 새로운 완충액에 현탁 정제 세포 (THP-1 및 중간 엽 줄기 세포)의 연속 컬렉션 (> 90 %의 세포 복구)을 용이ICA 또는 PLGA). 이 단일 단계 크기 기반 셀 정제 전략은 높은 셀 처리량 ⁽¹⁰⁶ 세포 / 분)을 가능하게하며, 무 간섭 임상 적용을 달성하기 위해, 마이크로 / 나노 공학 세포의 대용량 전지의 정제에 매우 유용하다.

서문

에이전트로드 마이크로 / 나노 입자 NPS ()에 의해 세포를 엔지니어링하는 bioimaging 기능을 강화하고 재생 의학에 네이티브 치료 특성을 보충 / 보강하는 간단한, 게놈 통합이없는, 그리고 다양한 방법입니다. ^1-3 세포 변형이 라벨에 의해 달성된다 에이전트로드 NP에 과량의 농도와 세포막이나 세포질은 결합 부위를 포화합니다. 그러나,이 방법의 주요 단점은 변형이 포함 된 NP에 상당한 잠재적으로 입자 조작 된 세포의 정확한 식별을 혼동 또는 치료 결과를 복잡하게. ^4,5 또한 수 셀 라벨 처리 후 용액에 남아있는 언 바운드 입자의 양, 노출입니다 과도하게 높은 농도의 제 (성장 인자, 스테로이드 등) 비 표적 세포에 대한 의도하지 않은 결과를 유발할 수 잘못 전달 독성 및 노출을 야기 할 수있다. O를 포함하더라도 입자 캐리어f를 "생체 적합성"재료 [예를 들어, 폴리 (유산 공동 글리콜 산), PLGA]는 강력한 면역 세포의 특정 조건에서 반응뿐만 아니라 선동 할 수 있습니다. ^(6)이 손상된 면역 (예를 들어, 류마티스 관절염) 잠재적으로 지연을 가진 개인에서 특히 위험하다 전신 나노 틈새. ⁽⁷⁾ 따라서, 종래의 입자 공학 세포 도입 자유 입자의 효율적인 제거는 독성 프로파일을 최소화하고 생체 내에서 에이전트로드 입자 잘못 전달 노출을 줄이기 위해 매우 중요하다.

종래 구배 원심 분리는 종종 자유 입자로부터 설계된 세포를 분리하는 데 사용하지만 수고하고 배치 모드에서 작동된다. 또한, 고속 원심 동안 세포와 세포의 무결성 및 / 또는 영향 셀의 동작을 손상시킬 수있는 밀도 구배 매질의 성분에 의해 경험되는 전단 응력. ^8은 미세 유체 SEV 매력적인 대안결정 론적 측면 변위 (DLD) ^{9, 10, 11을} dieletrophoresis 작은 입자의 분리 및 버퍼 교환 응용 프로그램 개발 ⁽¹²⁾ acoustophoresis 포함 대한 일반적인 분리 기술. 그러나 이러한 방법은 낮은 처리량 고통 (1-10 μL · 분 ^{- 1)} 문제를 막힘하는 경향이 있습니다. 이러한 유전 기반의 방법으로 활성 분리는 또한 고유의 유전 세포 표현형 또는 분리를 달성하기 위해 추가 셀 라벨 단계의 차이를 필요로한다. 에서 입자 또는 세포의 측면 이동을 때문에 높은 유동 조건과 우수한 크기의 해상도로 인해 높은 레이놀즈 수 (재) ^13에서 지배적 인 리프트 힘 (F의 _L)에 별개의 위치에 초점을 간소화 - 더 유망한 접근 방식은 관성 미세 유체를 포함한다. , 그것은 종종 크기 기반의 세포 분리 ^{14, 15} 및 버퍼 교환 애플리케이션에 이용되고있다. ^{16 ~ 18} Howeve분리 된 세포는 일반적으로 원본과 새로운 버퍼 용액과의 경계 부근에 남아있는 (R), 버퍼 교환 성능은 ~10-30 % 오염물 용액 여전히 좋지. ^16-18 더 중요한 표적 세포의 크기 분포를 달성하기 위해 유사하게 보유 특히 중간 엽 줄기 세포와 같은 이종 크기의 세포 유형 (MSCS)의 처리에 문제를 제기 원래 완충 용액에서 정확한 초점을 맞추고 관성 및 분리. ⁽¹⁹⁾

우리는 이전에 새로운 관성 미세 유체 세포 분류 기법은 2 유입구,이 출구 나선형 마이크로 채널 장치를 사용하여 순환 성 종양 세포 (CTCS) 전혈 ²⁰ 세균 ²¹ 단리 딘 흐름 분획 (DFF)을 지칭 개발 하였다. 이 비디오 프로토콜에서는 라벨 THP-1 (인간 급성 단핵구 백혈병 세포주) 현탁 단핵 세포 (~ 15 μm의) 및 칼 세인 -1-와 중간 엽 줄기 세포 (10 ~ 30 μm의) 프로세스를 설명한다oaded NP에 표시된 세포와 결합되지 않은 NP에 제거의 효율적인 복구를위한 DFF 나선형 마이크로 디바이스의 제조 및 작동 하였다. ^(22)이 한 단계 정화 전략 레이블 서스펜션과 원심 분리하지 않고 신선한 완충 용액에 현탁 부착 세포의 연속 재생을 할 수 있습니다. 또한, 천만 세포 · 용액 ^-1, 셀 밀도 재생 의학의 응용에 대한 의무까지 처리 할 수있다.

프로토콜

중간 엽 줄기 세포와 단핵구 1. 나노 입자 (NP에) 라벨링

1. 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM)에서 배양 된 중간 엽 줄기 세포 (MSC들)은 종래 라벨링 ≥80 %의 컨 플루 언시에 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 항생제가 보충. 마찬가지로, 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI)에서 배양 THP-1 세포 (ATCC)는 1640 배지는 10 ~ ¹⁰⁶ 세포 / ml의 농도로 10 % FBS가 보충.
2. 로드 실리카 NP는 (~ 500 μm의) 밤새 교반 칼 세인을 사용하여 염료 용액 (200 μM)과. 앞에서 설명한 프로토콜 사용 PLGA-칼 세인의 AM (CAM)을 제작한다. ⁽²²⁾
   1. 250 μg의의 CAM과 4 ° C에서 클로로포름 100 mg의 PLGA (50:50)을 녹인다.
   2. 실온에서 고속 균질화 (13,600 × g으로 60 초)를 사용하여 단일 에멀젼 NPS를 생성한다. (더블 disti을 (3,400 XG 5 분) 원심 분리를 이용하여 세척 수집하기 전에 화학 후드 (≥3 시간)에 클로로포름을 증발채워진 물), 동결 건조 및 저장을 -20 ° C에서.
3. 20 분 - CAM-PLGA NP에 (1 mg)을 15 시간 동안 실온에서 0.01 % 폴리 -L- 라이신 (PLL) 용액에 칼 세인 실리카 NP는 (150 μg의)을 인큐베이션.
4. 5 분 3,400 XG에 원심 분리기는 각각의 배지 1 ㎖에 NP에 재 부유하기 전에 초과 PLL 상층 액을 제거합니다.
5. 약 24 시간 (0.1 mg을 · ml의 ^-1 라벨 농도)에 대한 - 세포 (총 2 × 10 ⁶ 세포 중간 엽 줄기 세포 또는 THP-1 ~ 1)로 NPS를 품어.
6. 해리 0.25 % 트립신 (5 분, 37 ° C) 2 ㎖를 사용하여 표지 부착 엽 줄기 세포를 수확 DMEM 6 ㎖로 급냉. 미세 가공 ¹⁰⁶ 세포 / ㎖ - ^105의 농도로 상기 세포 (1,000 × g으로 4 분)을 재현 탁 스핀. 직접 마이크로 유체 정제 - (10 ⁶ 세포 / ml 10 ⁵⁾ 표시 THP-1 세포를 사용합니다.

2. 미세 유체 장치 준비

1. 디바이스 제조
   1. 나선 마이크로 유체 소자를 제작 (500 μm의 115 ㎛의 (H) × (w)) 표준 소프트 리소그래피 공정을 사용하는 상업적 키트 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)과. ²³
   2. 기본 예비 중합체 30 g 및 무게 보트에 철저 경화제 3g을 섞는다. 탈 가스를 60 분 동안 데시 케이 터의 혼합물을 임의의 기포를 제거한다.
   3. 10mm - 신중 ~ (5)의 높이로 나선형 채널 디자인 패터닝 실리콘 웨이퍼 매스터 주형 상에 PDMS 액을 붓는다.
   4. 탈 가스를 60 분 동안 데시 케이 진공에서 혼합물을 다시 공기 방울을 제거한다. 모든 거품이 제거 될 때까지이 과정을 반복합니다.
   5. PDMS의이 설정 될 때까지 2 시간 동안 80 ° C의 오븐에서 PDMS 혼합물을 경화. 웨이퍼가 일정한 장치 높이로 경화시 틸팅되지 않도록.
   6. 메스를 사용하여 PDMS 나선형 장치를 잘라 조심스럽게 마스터 몰드에서 PDMS의 슬래브를 껍질.
   7. TR본딩 매끄러운 표면을 보장하기 위해 메스 장치의 에지 임.
   8. 입구에 대한 두 개의 구멍 (1.5 mm) 및 1.5 mm 생검 펀치를 사용하여 PDMS 장치의 출구에 대한 두 개의 구멍 (1.5 mm)를 펀치.
   9. 5 분 동안 80 ℃ 오븐에서 장치 이물질을 제거하고 건조 이소프로판올 (IPA)로 장치를 세척한다.
   10. 마스킹 테이프 사용 (채널 기능)이 PDMS 장치의 바닥면을 청소합니다.
   11. 마스킹 테이프를 사용하여 ( "3로"2) 유리 슬라이드를 청소 한면.
   12. 조심스럽게 놓고 플라즈마 클리너 챔버 내의 PDMS 장치와 슬라이드 글라스의 세정 표면을 노출 60 초 동안 진공을 가하지. 다음으로, 최대 플라즈마 전원 스위치 챔버 컬러로 핑크 될 때까지 챔버 압력을 낮 춥니 다.
       1. 60 초 동안 공기 플라즈마 표면을 노출. 령하게되면 플라즈마가 단단한 결합을 가능하게 PDMS와 유리의 노출 된 표면에 반응 종을 생성알 접촉. 플라즈마 전원을 끄고 장치 및 유리 슬라이드를 검색 할 수있는 플라즈마 청소기의 압력을 놓습니다.
   13. 단단히 플라즈마에 노출 된 표면을 가압하고 기포는 두 표면 사이에 포집되지 않도록하여 함께 PDMS 장치 및 유리 슬라이드 접합.
   14. 본딩을 강화하기 위해 2 시간 동안 80 ℃로 설정된 핫 플레이트를 이용하여 접합 장치를 가열한다.
2. 장치 작동
   1. 입구 주사기 20cm 각 튜브의 일단에 주사기 팁 (23 게이지)을 부착 - ~ (15)의 튜브의 두 개 (1.52 mm의 OD)를 잘라.
   2. 출구 10 cm이고 PDMS 장치의 상기 출구 구멍에 부착 - ~ 5의 튜브의 두 개 (1.52 mm의 OD)를 잘라.
   3. 그 출구 관 밖으로 흘러 나올 때까지 수동 프라임, 70 % 에탄올을 함유하는 주사기를 사용하는 장치를 실행을 샘플링 이전. 장치를 소독하는 1 분 30 초 동안 에탄올 앉아 할 수 있습니다.
   4. 필터링 된 30 ml의로드(0.2 ㎛의 세공) 시스 완충액 60 ml의 시린지에 (0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA)으로 인산 완충 용액 (PBS)) 및 주사기 펌프의 주사기를 고정. 올바른 설정으로 펌프 (60 ml의 볼륨 : 60,000 μL 주사기 크기)를 설정합니다.
      주 : PBS에 BSA의 첨가는 세포 - 세포 결합 및 세포와 PDMS 장치 간의 비특이적 결합을 최소화하는 것이다.
   5. 로드 3 ML의 주사기로 표지 된 세포의 3 ㎖ 별도의 주사기 펌프에 주사기를 고정합니다. 올바른 설정으로 펌프 (: 3 ㎖, 볼륨 : 3,000 μL 주사기 크기)를 설정합니다.
   6. 기포가 안정적인 흐름을 보장하기 위해 주사기에 갇혀 있지 않은지 확인합니다. 부드럽게 노즐에서 액체 몇 방울을 분사하여 공기 방울을 제거합니다.
   7. 주사기로 주입 주사기 팁과 튜브를 연결하고 장치 (외장 및 샘플 입구)의 각각의 입구에 삽입. 튜브를 따라 기포가 없는지 확인합니다.
   8. 반전에 장치를 장착셀 정렬 과정에서 실시간 이미징을위한 에드 위상차 현미경.
   9. 접착제를 사용하여 현미경 무대 장치에 가까운 작은 폐기물 비커와 두 개의 15 ml의 튜브를 고정합니다.
   10. 폐기물 비커에 출구 호스를 놓습니다.
   11. 1:10 시스 버퍼 샘플의 유동 비율을 설정하고, 선별 과정이 시작 두 시린지 펌프를 시동 (예 : 120 μL / 분 샘플 주사기 1200 μL위한 / 분 쉬스 주사기, 채널 유속 ~ 0.38 m / 초 ).
   12. 유량이 안정화 1.5 분간 실행 장치. 이것은 고속 카메라를 사용하여 위상차와 시야 아래 채널 내벽 근처 관성 포커싱 세포의 존재에 의해 확인 될 수있다 (~ 5000 - 초당 10,000 프레임 (fps), 노광 시간 : 10 내지 50 마이크로 초).
   13. 셀 콘센트 및 폐기물 콘센트에서 용리액를 수집하기 위해 다른 튜브로 배출 호스를 놓습니다.

결과

밤새 바이오 영상 화제 장착 된 NP와 세포를 라벨링 한 후, 표지 된 세포 (유리 입자를 포함) 수확 단일 단계 공정 (도 1a)에 자유 NPS를 제거 DFF 나선형 마이크로 디바이스에 의해 정제 하였다. 2 입구, 2 콘센트에 나선 마이크로은 SU-8 포토 레지스트를 사용하여 엔지니어링 소프트웨어에 의해 설계 및 마이크로 제조된다. 패턴 화 된 실리콘 웨이퍼를 다음 소프트 ?...

토론

여기에 기술 된 셀 DFF 정화 기술은 높은 처리량의 방식으로 표지 된 세포의 신속한 연속 분리 할 수​​있다. 이 분리 방법은 많은 샘플 량 또는 높은 세포 농도 시료 처리에 적합하고, 장시간 사용 후에 막히는 경향이 종래의 막 여과 계보다 낫다. 마찬가지로, 선호도 기반의 자기 분리가 힘들고 비용이 추가 셀 라벨 단계가 필요합니다. 정제 된 세포 (채널 내에 때문에 짧은 체류 시간에 자신의 레...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell lines & Media
Mesenchymal Stem Cells (MSCs)	Lonza	PT-2501
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Lonza	12-614F
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-106
THP-1 monocyte cells (THP-1)	ATCC	TIB-202
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media	Lonza	12-702F
Reagents & Materials
0.01% poly-L-lysine (PLL)	Sigma-Aldrich	P8920
3 ml Syringe	BD	302113	Syringe 3 ml Luer-Lock
60 ml Syringe	BD	309653	Syringe 60 ml Luer-Lock
Bovine Serum Albumin (BSA)	Biowest	P6154-100GR
Calcein, AM (CAM)	Life Technologies	C1430
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875
Isopropanol	Fisher Chemical	#P/7507/17	HPLC Grade 2.5 L
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Lonza	17-516Q/12
Plain Microscope Slides	Fisher Scientific	FIS#12-550D	75 x 25 x 1 mm3
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	SYLGARD® 184
Scotch tape	3M	21200702044	18 mm x 25 m
Silica NPs (∼200 μm)	Sigma-Aldrich	748161	Pore size 4 nm
Syringe Tip	JEC Technology	7018302	23 G 0.013 x 0.25
Trypsin-EDTA (0.25%)	Life Technologies	25200-056
Tygon Tubing	Spectra-Teknik	06419-01	0.02 x 0.06" 100
Poly (D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA; 50:50)	Sigma-Aldrich	P2191
Equipment
Biopsy punch	Harris Uni-Core	69036-15	1.50 mm
Dessicator	Scienceware	111/4 IN OD
High-speed Camera	Phantom	V9.1
Inverted phase-contrast microscope	Nikon	Eclipse Ti
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-002
Syringe Pump	Chemyx	CX Fusion 200