Confirmation de Ischémie myocardique et reperfusion chez des souris à l'aide Pad Surface électrocardiographie

Résumé

During murine myocardial ischemia/reperfusion surgery, correct placement of the occluding ligature is typically confirmed by visible observation of myocardial pallor. Herein, a method of electrocardiographically confirming ischemia and reperfusion, to supplement observed myocardial pallor, is demonstrated in male C57Bl/6 mice.

Résumé

Many animal models have been established for the study of myocardial remodeling and heart failure due to its status as the number one cause of mortality worldwide. In humans, a pathologic occlusion forms in a coronary artery and reperfusion of that occluded artery is considered essential to maintain viability of the myocardium at risk. Although essential for myocardial recovery, reperfusion of the ischemic myocardium creates its own tissue injury. The physiologic response and healing of an ischemia/reperfusion injury is different from a chronic occlusion injury. Myocardial ischemia/reperfusion injury is gaining recognition as a clinically relevant model for myocardial infarction studies. For this reason, parallel animal models of ischemia/reperfusion are vital in advancing the knowledge base regarding myocardial injury. Typically, ischemia of the mouse heart after left anterior descending (LAD) coronary artery occlusion is confirmed by visible pallor of the myocardium below the occlusion (ligature). However, this offers only a subjective way of confirming correct or consistent ligature placement, as there are multiple major arteries that could cause pallor in different myocardial regions. A method of recording electrocardiographic changes to assess correct ligature placement and resultant ischemia as well as reperfusion, to supplement observed myocardial pallor, would help yield consistent infarct sizes in mouse models. In turn, this would help decrease the number of mice used. Additionally, electrocardiographic changes can continue to be recorded non-invasively in a time-dependent fashion after the surgery. This article will demonstrate a method of electrocardiographically confirming myocardial ischemia and reperfusion in real time.

Introduction

Les maladies du cœur reste la principale cause de décès dans le monde ^1,2. Non seulement le ventricule gauche (VG) de la chambre le plus musclé, responsable de pomper le sang du cœur à l'ensemble du corps ^3, il est un site de lésion cardiaque commune post-infarctus du myocarde ^4. la mort des tissus du ventricule gauche se traduit souvent par une insuffisance cardiaque systolique. Les modèles animaux de maladies cardiaques sont indispensables pour l'avancement de la recherche cardiovasculaire biomédicale. La C57BL / 6 souche de souris ont été un choix populaire pour les modèles animaux en raison de leur temps de reproduction rapide, à faible coût et la facilité des altérations génétiques. La plupart des modèles murins chirurgicaux pour l'étude des maladies du cœur impliquent une occlusion de la branche LAD de l'artère coronaire gauche. La DAL est parfois appelé la gauche obtuse marginal ^5,6. Le LAD fournit le sang au antérieure du ventricule gauche et les murs antéro-latéraux. Les études d'occlusion LAD visent à induire des infarctus antérieurs, parfois l'extension into les régions inférieures et latérales paroi ^7.

Deux modèles qui sont fréquemment utilisés pour les études d'infarctus du myocarde comprennent l'occlusion chronique infarctus du myocarde et l'infarctus lésions d'ischémie / reperfusion. L'occlusion chronique est créé par suturer chirurgicalement autour et bloquer de façon permanente le flux sanguin à travers la LAD. La lésion d'ischémie / reperfusion est créé beaucoup de la même manière qu'avec un transitoire, habituellement 30 à 60 minutes, période ischémique. Pour parvenir à une ischémie transitoire, les liens occlusive de suture autour de l'artère interventriculaire antérieure et un petit tube en PE-10 qui est placé parallèle à l'artère interventriculaire antérieure sur la surface épicardique du coeur, suivie d'une période de reperfusion, où le tube et la suture d'occlusion est retirée et le sang est autorisé à circuler à nouveau à travers l'artère et dans le myocarde. La chirurgie d'ischémie / reperfusion a été considérée comme cliniquement pertinente en raison de la nature de la blessure de reperfusion en parallèle le traitement des infarctus humains qui comprend balangioplastie coronaire et pt stenting de l'artère, ou un pontage aorto-coronarien. En règle générale, au cours de ces interventions chirurgicales, l'ischémie du LV dans un cœur de la souris est confirmée par la pâleur visible de la paroi du myocarde. Toutefois, en effectuant simplement les chirurgies sur un électrocardiogramme (ECG) pad dans des conditions de surveillance constante, les changements visibles peuvent être observées dans la forme d'onde d'ECG, confirmant ainsi l'ischémie et de la reperfusion du myocarde de la souris.

Bien que le coeur murin est similaire au cœur humain à bien des égards, y compris sa structure à quatre compartiments, les cœurs ont aussi des différences. Une différence évidente est la fréquence cardiaque de repos moyen de souris adultes est de 600 - 700 battements par minute (bpm) , alors que celle de l' homme adulte est ~ 60-100 bpm ^8,9. De plus, chez les souris les ondes de repolarisation, J et T, se confondent souvent avec les dépolarisation QRS-complexes faisant un segment ST clairement difficile de discerner ^10. Pour compliquer le processus de electrocardiographically confirmant l' ischémie du myocarde, il est l'élévation de l'onde T et le segment ST , qui sont utilisés en tant que marqueurs pour le diagnostic de l' ischémie et la lésion d'infarctus du myocarde chez l'être humain, cliniquement dénommé ST e lévation m yocardial i nfarction ou STEMI. L'une des principales différences entre les formes d'onde humaines et murines est que S-onde est immédiatement suivi soit un J-ondes qui transfère directement dans une onde T négative. Au cours de l' ischémie myocardique aiguë chez la souris , l'amplitude des diminutions S-ondes et est directement suivie par un J-onde anormale et une onde T inversée ^11. L'onde T ne semble pas représenter une partie importante de la repolarisation chez les souris ^11. Malgré la nomenclature et de la souris contre les différences humaines, la confirmation ECG d'ischémie myocardique murin et la reperfusion est toujours possible et relativement simple. Par souci de simplification de la forme d'onde d'interprétation, le segment entre le SJT est appelé ST-SEGMEnt ici.

Lignes directrices STEMI publiés en 2013 recommandent un temps au patient porte-à-ballon de moins de 90 min ¹² .Cet signifie que le laps de temps de l'identification des coronaires occlusion de l' artère du patient jusqu'à ce que l'artère est rouvert devrait être inférieure à 90 min. Le cœur battant travaille constamment et , par conséquent, a un métabolisme oxydatif élevé et un niveau élevé de consommation d'oxygène ^3. À fournir à cet effet , un réseau de capillaires est disponible pour chacun des myocytes ^3. Il suffit d'un cœur quelques battements d'épuiser son oxygène et de l'approvisionnement en éléments nutritifs. Dans une fenêtre de 90 minutes, une région d'une cardiopathie ischémique chez un être humain aura été bloqué de recevoir entre 5.400 et 9.000 cœur bat la valeur du sang riche en oxygène. Dans cette même période de 90 min, une souris aurait 54.000 à 63.000 battements cardiaques. des points temporels expérimentaux pour murine une lésion d'ischémie / reperfusion se situent généralement entre 30 et 60 min.

L'importance de développerment un procédé supplémentaire de confirmation de l'ischémie myocardique et la reperfusion dans un modèle murin a des implications profondes sur la constance et la reproductibilité des résultats dans les études d'ischémie / reperfusion du myocarde. La pratique actuelle d'observer visuellement le coeur pour un changement de couleur des tissus ne suffit pas en tant que stand-alone de diagnostic. En outre, la reperfusion après le retrait du tube et de suture ne sont pas garanties. Bien que l'artère est plus liée au large, l'artère peut avoir subi des dommages au cours de la procédure et peut devenir impossible de reperfusion. Il serait avantageux d'avoir un enregistrement des modifications électrocardiographiques pour confirmer reperfusion plutôt que de compter sur des observations de la pâleur du myocarde et rubor (couleur rouge). Coeurs qui ne montrent pas les marqueurs de lésions d'ischémie / reperfusion peuvent alors être rapidement signalées et une décision sur la façon de procéder peut être faite par les enquêteurs.

Enfin, l'établissement d'un registre des modifications ECG de référence tout au long de the Les périodes ischémiques et de reperfusion permet aux enquêteurs de continuer à surveiller le cœur après la chirurgie initiale. Les enquêteurs actuellement perdent de vue le cœur dès que l'opération est terminée. ECG est un moyen simple pour mieux comprendre les changements qui se produisent dans les heures myocardiques à jours après la chirurgie. ECG enregistré aux points de temps après la chirurgie pourrait révéler ondes Q développement tardif indiquant continué ou l'aggravation de la mort des tissus. Cependant, pour jauger efficacement de nouveaux ou d'aggravation des marqueurs électrocardiographiques, un ECG de base doit être disponible pour la comparaison.

Ce protocole démontrera comment préparer, obtenir, et interpréter l'ECG pour confirmer l'ischémie et la reperfusion du coeur de la souris en utilisant 8 - 12 semaines vieux mâles C57BL / 6 souris.

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Protocole

Toutes les interventions chirurgicales réalisées sur des animaux doivent être effectués conformément au Guide pour le soin et l' utilisation des animaux de laboratoire ¹³ ou d' autres directives éthiques appropriées. Les protocoles doivent être approuvés par le comité de protection des animaux à l'institution appropriée avant de procéder.

1. Préparation de l'ECG

NOTE: Avant de commencer, enfiler l'équipement de protection individuelle, y compris des gants, des lunettes et une blouse de laboratoire propre ou robe jetable.

1. Nettoyez le tampon ECG en utilisant un non-alcool et la solution de décontamination à base non-blanchiment. utiliser doucement une tâche délicate essuyez pour éponger l'excès de solution pour assurer que le plot d'électrode ne soit pas endommagé.
2. Si le tampon ECG a une fonction de chauffage, de l'utiliser. souris anesthésiés ont tendance à perdre rapidement la chaleur du corps. Chauffer le tampon à 40-42 ° C pour maintenir normothermique température corporelle de 37 ° C tout au long de l'opération ^14. Surveiller l'humeur du corpsature en utilisant un thermomètre rectal. Réglez la température nécessaire de tampon pour maintenir la température du corps ~ 37 ° C.
3. Comme la plupart des thoracotomies sont effectuées avec la souris couché sur le dos (décubitus dorsal), veiller à ce que la bascule est retourné sur le réglage "supination". De nombreux pads ECG ont une fonction pour basculer entre les positions couchée et supination. Défaut de choisir la bonne orientation peut entraîner des fausses déclarations d'événements électrocardiographiques.
4. Anesthésier souris en utilisant 5% d'isoflurane inhalé et 1 L / min d'oxygène. Une fois que la souris est anesthésiée, le transfert souris pour ECG pad équipé d'une anesthésie nez-cône et réduire isoflurane à 2% et 1 L / min d'oxygène. Confirmer l'anesthésie appropriée en assurant la souris ne réagit pas lorsque le pied de la souris est pincé avec une pince.
5. Appliquer une fine couche de lubrification de l'oeil pommade sur les yeux de la souris pour prévenir la sécheresse et des lésions cornéennes alors anesthésié.
6. Nettoyer les pattes de la souris avec une lingette humide pour enlever toute la literie visiblequi peut être collé à pattes ou peut interférer avec la transmission des impulsions électriques à partir des pattes au pad ECG. pattes sèches avec une lingette.
7. Appliquez une petite quantité (légèrement plus petite qu'une USD dime) de gel d'électrolyte hautement conducteur à chacune des quatre électrodes métalliques sur le pad ECG.
   Remarque: Assurez-vous d'appliquer seulement une petite quantité de gel que trop de gel, il est difficile de retenir les pattes sur le tampon en utilisant du ruban adhésif. En outre, les pattes sont susceptibles de se glisser hors de la retenue lors de la chirurgie si elles étaient mouillées avant d'appliquer du ruban adhésif.
8. Avec la souris en position couchée, utilisez du ruban adhésif médical clair pour retenir chaque patte à son électrode (figure 1) correspondant. Appuyez d'abord sur chaque patte à son morceau de ruban adhésif, puis la bande adhèrent au pad ECG. Faire en sorte que chaque patte de retenue est en contact avec le gel d'électrolyte et l'électrode.

2. L'acquisition de l'ECG

1. En fonction de l'équipement utilisé pour l'acquisition ECG, confIGURE la machine de telle sorte que la forme d'onde d'ECG peut être visualisée en temps réel. Pour les enregistrements d'ECG en utilisant les paramètres de surveillance physiologique sur une machine d'échocardiographie, une image en temps réel en mode B aura la forme d'onde d'ECG courant le long de la partie inférieure de l'écran.
   Note: Voir les guides individuels de l'utilisateur de la machine afin de déterminer la meilleure façon de configurer cet équipement.
2. Activer visualisation en temps réel du signal ECG en appuyant sur la touche en mode B sur une machine d'échocardiographie ou l'équivalent sur d'autres appareils d'enregistrement d'ECG.
   1. Ajustez la résolution pour tenir compte des différences d'amplitude. Si le pic de l'onde R ou l'auge (vallée) de l'onde Q sont hors du cadre visuel, ajuster la résolution jusqu'à ce que toute la hauteur de la forme d'onde peut être observée.
      Remarque: Cela peut se faire sous l'onglet paramètres physiologiques sur une machine d'échocardiographie. Cliquez sur l'augmentation ou la diminution des flèches jusqu'à ce que toute forme d'onde est visible.
3. Chaque fois qu'une image est d'être obtained, effacer le tampon de l'ECG d'outils. Toucher la souris pendant l'enregistrement ECG avec des pinces ou des doigts va perturber la forme d'onde. Assurez-vous que la souris est toujours intacte et sur le pavé ECG avant d'enregistrer des électrocardiogrammes.
4. Utilisez "record" de la machine ou de fonction "magasin" avant de faire des incisions chirurgicales sur la souris. Cette image sera utilisée comme une base de comparaison plus tard.

3. Procédure chirurgicale et enregistrement ECG

1. Injecter souris anesthésiée analgésique (buprénorphine, 1,5 pg, intrapéritonéale) avant de commencer. Les détails de l'ischémie / reperfusion d'intervention chirurgicale peuvent aussi être trouvées ailleurs ^5.
2. Enlever les poils autour du site chirurgical chimiquement ou mécaniquement et désinfecter la zone avec une solution de bétadine. Utiliser un scalpel pour faire une incision verticale parallèle à l'œsophage et la trachée. Déplacez doucement les ganglions lymphatiques de chaque côté de l'incision jusqu'à ce que le tissu mince recouvrant la trachée estexposé. En utilisant des pinces, séparer en douceur le tissu jusqu'à ce que les anneaux de cartilage de la trachée blancs sont visibles.
   Note: Nous utilisons généralement Nair épilation lotion. La lotion est appliquée sur le site chirurgical pendant environ 1 min. Nair est ensuite soigneusement lavé en utilisant une solution saline ou de l'eau. Ce procédé est préféré parce que dans notre laboratoire à haute résolution échocardiographie (qui peut détecter les follicules pileux) est effectuée avant et après l'intervention chirurgicale. Cependant, des précautions doivent être prises pour éviter les zones sensibles telles que les organes génitaux, puis laver soigneusement la Nair off pour éviter les brûlures potentielles de la peau.
3. Retirez rapidement le nez de la souris de l'embout conique et insérer un tube de ventilation dans la bouche de la souris et vers la gorge. Lorsque le bout du tube de ventilation est visible à travers la zone du cou exposée, aligner le tube avec le début de la trachée. tortiller doucement le côté du tube à l'autre tout en appliquant une pression vers le haut jusqu'à ce que les lames de tube dans la trachée qui peut être confirmé visuellement through la trachée translucide.
4. Assurez-vous que la souris reste anesthésié pendant la procédure d'intubation. Pause de l'intubation et retourner la souris au nez cône si elle commence à remuer.
5. En utilisant une boucle de ficelle, accrocher deux dents de devant de la souris dans la boucle et du ruban adhésif de la chaîne se termine au pad ECG pour stabiliser la tête de la souris et d'assurer la tubulure de ventilation ne se déplace pas lors de la chirurgie. attacher rapidement un tube de ventilation pour rongeur ventilateur et régler les paramètres de ventilation en fonction du poids de la souris. Ruban tube de ventilation en place.
6. Couvrir la trachée exposée de la souris avec une gaze imbibée dans une solution saline chaude pour maintenir le tissu de sécher.
7. Faire une incision verticale à l'aide d'un scalpel le long du côté gauche du sternum.
8. En utilisant des pinces, séparer légèrement la couche de bord de la couche musculaire. Découpez soigneusement les couches musculaires sous-jacentes sans couper les vaisseaux sanguins visibles.
9. En utilisant des pinces, prenez la troisième côte et tirezvers le haut en douceur. Maintenir l'adhérence sur la nervure d'une main et utiliser des ciseaux chirurgicaux pour couper soigneusement le tissu intercostal entre la troisième et la quatrième côte. Veiller à ce que les poumons ne sont pas endommagés.
   Nota: Les poumons se rétracter profondément dans la cavité thoracique presque immédiatement après la cavité thoracique est percé par l'incision chirurgicale en raison de la perte du gradient de pression. Attendez jusqu'à ce que les poumons ont rétracté avant de poursuivre.
10. Utilisez une pince pour saisir et doucement séparer la couche mince de péricarde qui entoure le cœur.
11. Insérez écarteurs ou utiliser manuellement pince comme écarteurs de côtes pour déplacer les nervures dans une position où le coeur est visible entre les nervures.
    Note: Il est pratique courante pour déplacer la patte inférieure gauche de la souris pour qu'il chevauche la patte en bas à droite lors de la mise en place de la ligature. Cela aide à positionner le coeur afin que l'auricule cardiaque gauche ou oreillette, est facilement visible lors de la pose de la ligature. Soyez conscient que l'ECG valide waveforms ne seront pas obtenus tandis que la patte inférieure gauche est hors de l'électrode. Pour cette raison, il est recommandé de retourner la patte à son électrode après la ligature de suture est passé à travers le tissu du myocarde, mais avant un nœud est serré.
12. Localisez le LAD visuellement, sous l'oreillette gauche. insérer Swiftly une conique aiguille de suture 7-0 en soie dans le myocarde assez profondément pour passer sous la LAD, mais pas si profond que de pénétrer dans la cavité LV. Tirez la ligature de suture à travers jusqu'à ce qu'il y est d'environ 4 cm de suturer la soie gauche sur la (non-aiguille) extrémité libre de la ligature de suture.
13. Commencer à faire un noeud de suture simple. Une fois que l'extrémité libre de la soie à suturer a été tiré à travers les boucles pour former le noeud, mettre en pause.
14. En tenant les deux extrémités libres et aiguilles de la soie de suture avec une pince, insérer une section ~ 1 cm de PE-10 tube sous le noeud formant et au sommet de la surface épicardique.
15. Si la patte gauche de la souris est traversé, retourner la patte à son propar électrode. Serrer noeud de telle sorte que le tuyau en PE-10 est suturée au coeur. Relâchez tout contact physique avec la souris pour permettre ECG à enregistrer.
16. Autoriser la courbe ECG pour faire défiler pour ~ 10 sec. Vérifiez la courbe ECG visuellement et enregistrer la forme d'onde comme "Time of Occlusion". Si l'onde T ne pas augmenter en amplitude à 1 min, réévaluer le placement des ligatures.
    1. Si l'amplitude de l'onde T n'augmente pas, soit jeter l'animal de l'étude ou de tenter de corriger le placement ligatures.
17. Contrôler visuellement la couleur du myocarde pour confirmer paling ischémique du LV.
18. Si des changements ECG et les changements de couleur du myocarde indiquent une ischémie, double nœud de la suture autour de la PE-10 tubes.
19. Couvrir la cavité thoracique ouverte avec de la gaze saline chaude.
20. Chaque enregistrement ECG 5-10 min pendant toute la durée de la période ischémique.

4. Confirmation de reperfusion Utilisation ECG

1. Retirer saline gaze covel'anneau de la cavité thoracique et de visualiser le coeur.
2. Utilisez une lame pour couper la soie de suture au-dessus du tube PE-10. Une fois que la ligature est coupé, retirez la section de tube PE-10 et retirez délicatement la ligature de suture du myocarde.
3. Libérer tout contact physique avec la souris et permettre à la forme d'onde d'ECG ~ 10 s à cycle. forme d'onde d'enregistrement comme "Time of reperfusion." Continuer à enregistrer des formes d'ondes ECG tous les 5-10 minutes jusqu'à ce que le point expérimental désiré de temps est atteinte.
4. Ajuster la résolution des changements d'amplitude selon les besoins. Si l'onde T ne change pas lors du retrait du tube PE-10 et la ligature, la reperfusion n'a pas été confirmée.
   1. Si l'onde T ne change pas lors du retrait du tube, soit jeter l'animal de l'étude ou de tenter de corriger le placement ligatures.
5. Inspecter visuellement myocardique pour confirmer en outre reperfusion par retour à la couleur rouge.
6. Fermer la cavité thoracique en suturant l'espace intercostal avec un 5-0suture de soie tout en appliquant une légère pression sur la poitrine de la souris pour expulser l'excès d'air qui est entré pendant la chirurgie. Ensuite, suturer les couches musculaires et enfin, la peau. Remarque: En appliquant une pression à la cavité thoracique peut ne pas être suffisante pour évacuer la cavité thoracique d'air dans toutes les souris. Par conséquent, le procédé d'évacuation seringue et l'aiguille doit être utilisée pour faire en sorte que tout l'air ait été expulsé.
7. Enregistrez le dernier ECG avant de l'anesthésie par inhalation hors tension et enlever les pattes de la souris à partir des électrodes. Augmenter l'oxygène à 2 L / min et maintenir la ventilation jusqu'à ce que la souris reprend conscience.
8. Laisser la souris pour récupérer dans un environnement constant à température contrôlée, par exemple un coussin chauffant ou un incubateur chaud, pour éviter l' infarctus variabilité. Traiter la souris avec la buprénorphine 24 heures après la chirurgie, puis, au besoin, comme indiqué par l'échelle de la grimace de la souris.
   Note: Procédure de reperfusion est également discuté en détail par Xu et al ^5.

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Résultats

Un ECG murin normal est affiché dans la figure 2 avec des marqueurs d'événements électriques alphabétiques P, Q, R, S, T. J et P est la dépolarisation auriculaire initiale. QRS est la vague de dépolarisation sur les ventricules. J est repolarisation précoce et T représente la repolarisation hétérogène également connu sous le nom de récupération ^11. Il convient de noter que de nombreux laboratoires ne pas utiliser la nomenclature J-ondes et a...

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Discussion

Utilisation des changements ECG comme une méthode supplémentaire pour confirmer l'ischémie myocardique et la reperfusion assure le positionnement précis de la ligature d'occlusion. La précision de placement ligatures est essentielle pour réduire la variabilité des données chez les animaux. Le LAD dans un cœur de la souris est une artère difficile à visualiser. Par conséquent, complétant la pâleur visuelle avec des changements électrocardiographiques contribuera à assurer le placement correct des ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vevo 1100	Fujifilm Visual Sonics		Echocardiography Machine
Mouse Handling Plate	Fujifilm Visual Sonics		Heated ECG plate
Signa-Gel			Highly Conductive Multi-
Electrode Gel	Parker	15-25	Purpose Electrolyte
Transpore Medical Tape	3M	1527-0
PI-Spray II	Pharmaceutical Innovations	NDC 36-2013-25	Cleaning agent for ECG plate
C57Bl6 Mice	The Jackson Laboratory	000664	Male, 8 - 12 wk
IsoThesia-Isoflurane	Henry Schein	NDC 1169-0500-1
Excel	Microsoft
Systane Nighttime Lubricant Eye Ointment	Alcon	65050935
7-0 Perma-Hand Silk Sutures	Ethicon	640.O32
5-0 Perma-Hand Silk Sutures	Ethicon	K809.O32
Surgical Scissors	ROBOZ	RS-5881
Forceps	Fine Science Tools	11052-10
Gauze	Bio Nuclear Diagnostics Inc	DIS-022B
Needle Holder	Fine Science Tools	12565-14
Buprenex CIII	Patterson Veterinary	0-891-9756	Buprenorphine Hydrochloride Analgesic
Betadine	Purdue Products	67618-150-08
Nair	Church and Dwight Co.	NRSL-22339-05