A confirmação da Isquemia Miocárdica e reperfusão em ratos usando Pad Superfície Eletrocardiografia

Resumo

During murine myocardial ischemia/reperfusion surgery, correct placement of the occluding ligature is typically confirmed by visible observation of myocardial pallor. Herein, a method of electrocardiographically confirming ischemia and reperfusion, to supplement observed myocardial pallor, is demonstrated in male C57Bl/6 mice.

Resumo

Many animal models have been established for the study of myocardial remodeling and heart failure due to its status as the number one cause of mortality worldwide. In humans, a pathologic occlusion forms in a coronary artery and reperfusion of that occluded artery is considered essential to maintain viability of the myocardium at risk. Although essential for myocardial recovery, reperfusion of the ischemic myocardium creates its own tissue injury. The physiologic response and healing of an ischemia/reperfusion injury is different from a chronic occlusion injury. Myocardial ischemia/reperfusion injury is gaining recognition as a clinically relevant model for myocardial infarction studies. For this reason, parallel animal models of ischemia/reperfusion are vital in advancing the knowledge base regarding myocardial injury. Typically, ischemia of the mouse heart after left anterior descending (LAD) coronary artery occlusion is confirmed by visible pallor of the myocardium below the occlusion (ligature). However, this offers only a subjective way of confirming correct or consistent ligature placement, as there are multiple major arteries that could cause pallor in different myocardial regions. A method of recording electrocardiographic changes to assess correct ligature placement and resultant ischemia as well as reperfusion, to supplement observed myocardial pallor, would help yield consistent infarct sizes in mouse models. In turn, this would help decrease the number of mice used. Additionally, electrocardiographic changes can continue to be recorded non-invasively in a time-dependent fashion after the surgery. This article will demonstrate a method of electrocardiographically confirming myocardial ischemia and reperfusion in real time.

Introdução

A doença cardíaca continua a ser a principal causa de morte em todo o mundo ^1,2. Não só é o ventrículo esquerdo (VE) da câmara mais muscular, responsável pelo bombeamento de sangue do coração para o corpo inteiro ^3, é um comum local da lesão cardíaca pós-enfarte do miocárdio ^4. morte do tecido ventricular esquerda muitas vezes resulta em insuficiência cardíaca sistólica. modelos animais de doença cardíaca são fundamentais para o avanço da pesquisa cardiovascular biomédica. A estirpe C57BL / 6 de camundongos têm sido uma escolha popular para modelos animais devido ao seu tempo de reprodução rápida, de baixo custo e facilidade de alterações genéticas. A maioria dos modelos cirúrgicos murinos para o estudo de doenças cardíacas envolvem a oclusão da LAD ramo da artéria coronária esquerda. A LAD é chamado às vezes à esquerda obtusa marginal ^5,6. O LAD fornece sangue ao anterior do ventrículo esquerdo e as paredes ântero-lateral. estudos de oclusão LAD visam induzir infartos anteriores, às vezes estendendo-se into das regiões de parede inferior e lateral ^7.

Dois modelos que são usados ​​com freqüência para estudos de infarto do miocárdio incluem infarto do miocárdio oclusão crônica e lesão de isquemia / reperfusão do miocárdio. A oclusão crônica é criado por sutura cirúrgica ao redor e bloquear permanentemente o fluxo de sangue através do LAD. A lesão de isquemia / reperfusão é criado muito da mesma maneira única com um transiente, geralmente 30-60 min, período isquémico. Para alcançar a isquemia transiente, os laços de oclus de sutura em torno do LAD e um tubo de PE-10 pequeno que é colocado paralelamente à ADA na superfície do epicárdio do coração, seguido por um período de reperfusão em que a tubagem e a oclusão de sutura é retirado e o sangue é deixado fluir uma vez mais através da artéria e no miocárdio. A cirurgia de isquemia / reperfusão foi considerado clinicamente relevante devido à natureza da lesão de reperfusão em paralelo com o tratamento de enfartes do humanos, que inclui promangioplastia pt coronariana e implante de stent da artéria, ou cirurgia de revascularização. Tipicamente, durante estas cirurgias, isquemia do VE em um coração de rato é confirmada pela palidez visível da parede miocárdica. No entanto, simplesmente realizando as cirurgias em uma almofada de eletrocardiograma (ECG) em condições de monitoramento constante, mudanças visíveis pode ser observada na forma de onda ECG, confirmando assim isquemia e reperfusão do miocárdio mouse.

Embora o coração de murídeo é semelhante ao coração humano em muitos aspectos, incluindo a sua estrutura de quatro câmaras, os corações também têm diferenças. Uma diferença óbvia é a frequência cardíaca média de repouso de camundongos adultos é de 600 - 700 batidas por minuto (bpm), enquanto que a dos humanos adultos é ~ 60-100 bpm ^8,9. Além disso, em ratinhos, as ondas de repolarização J e t, frequentemente fundir-se com o QRS complexo despolarização fazendo uma clara do segmento ST difícil discernir ^10. Para complicar o processo de electrocardiographicallY confirmando isquemia do miocárdio, é a elevação da onda T e do segmento ST, que são utilizados como marcadores para o diagnóstico de lesão de isquemia e enfarte do miocárdio em seres humanos, clinicamente referido como ST E levation m yocardial i nfarction ou IAM. Uma das principais diferenças entre as formas de onda humana e murina é que o S-onda é imediatamente seguido ser um J-ondas que transfere diretamente para uma onda T negativa. Durante a isquemia miocárdica aguda em ratos diminui a amplitude da onda S e é directamente seguida por uma J-onda anormal e uma onda T invertido ^11. A onda T não parece representar uma parcela significativa da repolarização em ratos ^11. Apesar de nomenclatura e rato vs. diferenças humanas, ECG confirmação da isquemia miocárdica murino e reperfusão é ainda viável e relativamente simples. Por uma questão de simplificação da interpretação da forma de onda, o segmento entre o SJT é referido como ST-SEGMENT aqui.

EAMCEST orientações publicadas em 2013 recomendar um tempo paciente porta-para-balão inferior a 90 min ¹² .Este significa que o período de tempo desde a identificação de oclusão da artéria coronária do paciente até que a artéria é reaberto deve ser inferior a 90 min. O coração batendo está trabalhando constantemente e, portanto, tem um alto metabolismo oxidativo e um alto nível de consumo de oxigênio ^3. Para proporcionar esta, uma rede de capilares é acessível a cada um dos miócitos ^3. Leva apenas um coração alguns batidas de esgotar seu oxigênio e nutrientes. Em uma janela de 90 minutos, uma região isquêmica do coração em um ser humano terá sido impedido de receber entre 5.400 e 9.000 coração bate pena de sangue rico em oxigênio. Nessa mesma janela de 90 minutos, um rato teria 54.000 para 63.000 batimentos cardíacos. Os pontos de tempo experimentais para a lesão de isquemia / reperfusão murino são tipicamente entre 30 e 60 min.

A importância de desenvolvering um método complementar de confirmar isquemia do miocárdio e reperfusão num modelo murino tem profundas implicações sobre a consistência e reprodutibilidade dos dados em estudos de isquemia / reperfusão miocárdica. A prática corrente de se observar visualmente o coração por uma mudança na cor do tecido não é adequada como um stand-alone de diagnóstico. Além disso, a reperfusão após a remoção do tubo de sutura e não é garantida. Embora a artéria não está mais ligada off, a artéria pode ter danos sofridos durante o procedimento e pode tornar-se impossível de reperfusão. Seria benéfico para ter um registro de alterações eletrocardiográficas para confirmar reperfusão em vez de confiar em observações de palidez do miocárdio e rubor (cor vermelha). Corações que não mostram os marcadores de lesão de isquemia / reperfusão pode então ser rapidamente sinalizado e uma decisão sobre como proceder podem ser feitas pelos investigadores.

Por último, o estabelecimento de um registro de ECG muda da linha de base em todo the períodos de isquemia e reperfusão permite aos investigadores continuam a monitorar o coração após a cirurgia inicial. Os investigadores atualmente perder de vista o coração, logo que a cirurgia está concluída. ECG é uma maneira simples para obter insights sobre as mudanças que ocorrem nas horas miocárdio dias após a cirurgia. ECG registrados em pontos de tempo após a cirurgia poderia revelar ondas Q de desenvolvimento tardio indicando continuação ou piora da morte do tecido. No entanto, para calibrar eficazmente novos ou agravamento marcadores eletrocardiográficos, um ECG de base devem estar disponíveis para comparação.

Este protocolo irá demonstrar como preparar, obter e interpretar o ECG para confirmar isquemia e reperfusão do coração mouse usando 8 - do sexo masculino 12 semanas de idade C57BL / 6.

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Protocolo

Todos os procedimentos cirúrgicos realizados em animais devem ser realizadas de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório ¹³ ou outras diretrizes éticas adequadas. Os protocolos devem ser aprovados pelo comitê de bem-estar animal na instituição adequada antes de prosseguir.

1. Preparação para o ECG

NOTA: Antes de começar, don equipamento de protecção individual, incluindo luvas, óculos e um casaco de laboratório limpo ou bata descartável.

1. Limpe a almofada de ECG usando um não-álcool e solução de descontaminação com base não-lixívia. Gentilmente usar uma tarefa delicada wipe para apagar o excesso de solução para garantir que o bloco de eletrodo não se danifique.
2. Se a almofada de ECG tem uma característica de aquecimento, usá-lo. camundongos anestesiados tendem a perder o calor do corpo rapidamente. Aquece-se a almofada para 40-42 ° C para manter a temperatura corporal normotérmica de 37 ° C durante toda a cirurgia ^14. Monitorar temperamento corpoAture usando um termômetro retal. Ajustar a temperatura do rato conforme necessário para manter a temperatura do corpo ~ 37 ° C.
3. Como a maioria das toracotomias são executadas com o mouse deitado de costas (supino), garantir que a alternância é virado para a configuração "supino". Muitas almofadas ECG tem uma função para alternar entre as posições prona e supina. Fracasso para selecionar a orientação correta pode resultar em deturpação de eventos eletrocardiográficos.
4. Anestesiar rato usando 5% de isoflurano inalado e 1 L / min de oxigénio. Uma vez rato é anestesiado, rato transferência para ECG almofada equipado com uma anestesia nariz-cone e reduzir isoflurano a 2% e 1 L / min de oxigénio. Confirmar a anestesia adequada, garantindo mouse não reagir quando o pé do mouse é beliscado com uma pinça.
5. Aplique uma camada fina de pomada lubrificante ocular sobre os olhos do rato para evitar ressecamento e danos à córnea, enquanto anestesiados.
6. Limpar as patas do rato com um lenço umedecido para remover todo o fundamento visívelque pode ser preso às patas ou pode interferir com a transmissão de impulsos eléctricos a partir das patas para a almofada de ECG. patas secos com um pano.
7. Aplique uma pequena quantidade (um pouco menor do que uma moeda de dez centavos USD) de gel de eletrólito altamente condutivo para cada um dos quatro eletrodos metálicos no teclado de ECG.
   Nota: Certifique-se de aplicar apenas uma pequena quantidade de gel como demasiado gel torna difícil para conter as patas para o bloco usando fita. Além disso, as patas são susceptíveis de deslizar para fora do sistema de retenção durante a cirurgia se eles estavam molhados antes de aplicar fita.
8. Com o mouse na posição supina, use fita adesiva médica clara para conter cada pata a seu eletrodo correspondente (Figura 1). Primeiro pressione cada pata ao seu pedaço de fita e, em seguida, aderir a fita para o pad ECG. Certifique-se de que cada pata é contido em contacto com o gel do electrólito e do eléctrodo.

2. Aquisição do ECG

1. Dependendo do equipamento utilizado para a aquisição de ECG, configura a máquina de modo que a forma de onda do ECG podem ser visualizados em tempo real. Para registos de ECG, utilizando as configurações de monitorização fisiológicas em uma máquina de ecocardiografia, uma imagem em modo B vivo terá a forma de onda do ECG correndo ao longo da parte inferior da tela.
   Nota: Consulte guias individuais do usuário de máquina para determinar a melhor forma de configurar o equipamento.
2. Permitir a visualização em tempo real de forma de onda ECG, pressionando a tecla de modo B em uma máquina de ecocardiografia ou o equivalente em outros dispositivos de gravação de ECG.
   1. Ajuste a resolução para explicar as diferenças de amplitude. Se o pico da onda R ou a calha (vale) da onda Q estão fora da moldura visual, ajustar a resolução até que toda a altura da forma de onda pode ser observada.
      Nota: Isto pode ser feito na guia configurações fisiológicas em uma máquina de ecocardiografia. Clique no aumento ou diminuição setas até que toda a forma de onda é visível.
3. Qualquer vez que uma imagem é para ser obtained, limpe a almofada ECG de ferramentas. Tocar o mouse durante a gravação de ECG com uma pinça ou os dedos vai perturbar a forma de onda. Certifique-se de que o mouse ainda intocado e está na plataforma de ECG antes de gravar qualquer ECGs.
4. Use "record" da máquina ou recurso "loja" antes de fazer qualquer incisões cirúrgicas no mouse. Esta imagem será utilizada como uma base para comparação mais tarde.

3. Procedimento cirúrgico e gravação de ECG

1. Injectar rato anestesiado com analgésico (buprenorfina, 1,5 g, intraperitoneal) antes de começar. Os detalhes da isquemia / reperfusão, intervenção cirúrgica pode também ser encontrada em outros lugares ^5.
2. Remover os pêlos ao redor do local da cirurgia quimicamente ou mecanicamente e desinfectar a área com uma solução de betadine. Use um bisturi para fazer uma incisão vertical paralelo ao esôfago e traquéia. Suavemente mover os nódulos linfáticos para cada lado da incisão até que o tecido fino que cobre a traqueia éexposto. Usando fórceps, suavemente separar o tecido até que os anéis de cartilagem branca da traqueia são visíveis.
   Nota: Nós usamos geralmente Nair loção remoção de pêlos. A loção é aplicada sobre o local cirúrgico para ~ 1 min. Nair é, então, cuidadosamente lavado com soro fisiológico ou água. Este método é preferido porque no nosso laboratório de alta resolução ecocardiografia (que pode detectar folículos pilosos) é realizada antes e após a cirurgia. No entanto, deve ser tomado cuidado para evitar áreas sensíveis, como os órgãos genitais, e, em seguida, lavar bem o Nair off para evitar queimaduras potenciais da pele.
3. remover rapidamente o nariz do rato a partir do nariz-cone e inserir tubos de ventilação na boca do rato e para a garganta. Quando a ponta do tubo de ventilação é visível através da área exposta do pescoço, alinhar o tubo com o início da traqueia. Gentilmente mexer lado do tubo para o outro enquanto aplica pressão para cima até os slides tubo na traqueia que podem ser confirmadas visualmente ttravés da traqueia translúcido.
4. Certifique-se de que o rato permanece anestesiado durante o procedimento de intubação. Pausa de intubação e retornar o mouse para o nariz-cone se ele começa a se mexer.
5. Usando um laço de corda, gancho dois dentes da frente do rato através do laço e prenda com fita a string termina à almofada ECG para firmar a cabeça do rato e garantir o tubo de ventilação não se move durante a cirurgia. anexar rapidamente a tubulação de ventilação para ventilação roedores e ajustar as configurações de ventilação de acordo com o peso do mouse. tubo de ventilação de fita no lugar.
6. Cubra traqueia exposta do rato com uma gaze embebida em solução salina quente para manter o tecido de secagem.
7. Adicione uma incisão vertical, utilizando um escalpelo ao longo do lado esquerdo do esterno.
8. Usando fórceps, suavemente separar a camada de fáscia a partir da camada muscular. Corte cuidadosamente as camadas musculares subjacentes sem cortar os vasos sanguíneos visíveis.
9. Utilizando uma pinça, pegue a terceira costela e puxepara cima delicadamente. Manter controle sobre a costela com uma mão e usar uma tesoura cirúrgica para cortar cuidadosamente o tecido intercostal entre a terceira ea quarta costela. Certifique-se de que os pulmões não estão danificados.
   Nota: Os pulmões irá retrair profundamente na cavidade torácica quase imediatamente após a cavidade torácica é perfurada pela incisão cirúrgica devido à perda de gradiente de pressão. Espere até que os pulmões têm retraído antes de continuar.
10. Use uma pinça para agarrar e suavemente separar a camada fina de pericárdio que circunda o coração.
11. Inserir manualmente afastadores ou utilizar uma pinça como afastadores de nervura para mover as nervuras para uma posição onde o coração é visível entre as nervuras.
    Nota: É prática comum para mover pata inferior esquerdo do rato de modo a que esta se sobreponha à pata direita inferior durante a colocação da ligadura. Isto ajuda a posicionar o coração, de modo que o apêndice atrial esquerda ou orelha, é facilmente visível durante a colocação da ligadura. Esteja ciente de que ECG válido waveforms não será obtido enquanto a pata esquerda inferior está desligado do eléctrodo. Por esta razão, é aconselhável para voltar a pata para o seu eléctrodo, após a ligadura de sutura é passado através do tecido do miocárdio, mas antes de um nó é apertada.
12. Localize o LAD visualmente, abaixo da aurícula esquerda. Rapidamente inserir um 7-0 seda afilado agulha de sutura no miocárdio profundamente o suficiente para passar debaixo da LAD, mas não tão profundo como para penetrar a cavidade do VE. Puxar a sutura através da ligadura até que haja cerca de 4 cm de seda de sutura à esquerda na (não-agulha) extremidade livre da sutura ligadura.
13. Começam a amarrar um nó de sutura simples. Uma vez que a extremidade livre da sutura de seda foi puxado através dos laços de modo a formar o nó, pausa.
14. Segurando ambas as extremidades livres e agulha da seda de sutura com uma pinça, insira uma seção cm ~ 1 da PE-10 tubos por baixo do nó formando e sobre a superfície do epicárdio.
15. Se pata esquerda do rato é atravessada, voltar a pata a seu propor eletrodo. Apertar nó de modo a que o tubo de PE-10 é suturado ao coração. Libere todo o contato físico com o mouse para permitir ECG a ser gravado.
16. Permitir onda de ECG para percorrer para ~ 10 seg. Verifique ECG onda visual e forma de onda registro como "Tempo de oclusão". Se a onda T não aumenta em amplitude dentro de 1 min, reavaliar colocação da ligadura.
    1. Se a amplitude da onda T não aumentar, quer descartar o animal do estudo ou tentar corrigir a colocação da ligadura.
17. verificar visualmente a cor do miocárdio para confirmar empalidecendo isquémica do LV.
18. Se alterações no ECG e alterações na cor do miocárdio indicam isquemia, nó duplo a sutura em torno do tubo PE-10.
19. Cubra a cavidade torácica aberta com gaze salina morna.
20. Ficha de ECG a cada 5-10 min durante a duração do período isquémico.

4. Confirmação de reperfusão Usando ECG

1. Remover salina gaze covetocar a cavidade torácica e visualizar o coração.
2. Utilize uma lâmina para cortar a sutura de seda no topo do tubo de PE-10. Uma vez que a ligadura é cortado, remover a seção de tubo PE-10 e retire cuidadosamente a ligadura de sutura do miocárdio.
3. Libere todo o contato físico com o mouse e permitir que a forma de onda ECG ~ 10 segundos para percorrer. onda de registro como "Time de reperfusão." Continuar a registar ondas de ECG a cada 5-10 min até o ponto de tempo experimental desejada seja atingida.
4. Ajustar a resolução para mudanças na amplitude, conforme necessário. Se a onda T não altera após a remoção do tubo de PE-10 e ligadura, reperfusão não foi confirmada.
   1. Se a onda T não muda após a remoção do tubo, ou descartar o animal do estudo ou tentar corrigir a colocação da ligadura.
5. inspecionar visualmente miocárdio para confirmar adicionalmente reperfusão pelo retorno à cor vermelha.
6. Fechar cavidade torácica por sutura do espaço intercostal com um 5-0fio de seda ao aplicar pressão suave para o peito do rato para expelir o excesso de ar que entrou durante uma cirurgia. Então suturar as camadas musculares e, finalmente, a pele. Nota: A aplicação de pressão para a cavidade torácica pode não ser suficiente para evacuar a cavidade de caixa de ar em todos os ratinhos. Portanto, o método da seringa e da agulha de evacuação deve ser empregue para assegurar que todo o ar foi expulso.
7. Grave o último ECG antes de virar a anestesia inalatória fora e remover as patas do rato dos eletrodos. Aumentar o oxigênio a 2 L / min e manter a ventilação até que o mouse recupera a consciência.
8. Permitir mouse para recuperar em um ambiente controlado de temperatura constante, por exemplo, almofada de aquecimento ou incubadora quente, para evitar a variabilidade do enfarte. Tratar com buprenorfina rato 24 horas após a cirurgia e em seguida, se necessário, tal como indicado pela escala de rato careta.
   Nota: Procedimento de reperfusão também é discutida em detalhe por Xu et al ^5.

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Resultados

Um ECG normal de murino é apresentada na Figura 2 com marcadores alfabéticos para eventos eléctricos P, Q, R, S, J e T. P representa a despolarização atrial inicial. QRS é a onda de despolarização ao longo dos ventrículos. J é repolarização precoce e T representa a repolarização heterogêneo também conhecida como recuperação de ^11. Deve notar-se que muitos laboratórios não utilizar a nomenclatura J-ondas e não se referem à SJT do segmento ...

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Discussão

Usando alterações no ECG como um método complementar para confirmar isquemia do miocárdio e reperfusão assegura o posicionamento preciso da ligadura oclusão. Precisão da colocação da ligadura é fundamental para a redução da variabilidade dos dados entre os animais. O LAD em um coração de rato é uma artéria difíceis de visualizar. Portanto, completando palidez visual, com alterações eletrocardiográficas vai ajudar a garantir o correto posicionamento do dano tecidual ligadura e resultante.

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vevo 1100	Fujifilm Visual Sonics		Echocardiography Machine
Mouse Handling Plate	Fujifilm Visual Sonics		Heated ECG plate
Signa-Gel			Highly Conductive Multi-
Electrode Gel	Parker	15-25	Purpose Electrolyte
Transpore Medical Tape	3M	1527-0
PI-Spray II	Pharmaceutical Innovations	NDC 36-2013-25	Cleaning agent for ECG plate
C57Bl6 Mice	The Jackson Laboratory	000664	Male, 8 - 12 wk
IsoThesia-Isoflurane	Henry Schein	NDC 1169-0500-1
Excel	Microsoft
Systane Nighttime Lubricant Eye Ointment	Alcon	65050935
7-0 Perma-Hand Silk Sutures	Ethicon	640.O32
5-0 Perma-Hand Silk Sutures	Ethicon	K809.O32
Surgical Scissors	ROBOZ	RS-5881
Forceps	Fine Science Tools	11052-10
Gauze	Bio Nuclear Diagnostics Inc	DIS-022B
Needle Holder	Fine Science Tools	12565-14
Buprenex CIII	Patterson Veterinary	0-891-9756	Buprenorphine Hydrochloride Analgesic
Betadine	Purdue Products	67618-150-08
Nair	Church and Dwight Co.	NRSL-22339-05