Подтверждение инфарктом ишемией и реперфузии у мышей с использованием поверхности Pad электрокардиографии

Резюме

During murine myocardial ischemia/reperfusion surgery, correct placement of the occluding ligature is typically confirmed by visible observation of myocardial pallor. Herein, a method of electrocardiographically confirming ischemia and reperfusion, to supplement observed myocardial pallor, is demonstrated in male C57Bl/6 mice.

Аннотация

Many animal models have been established for the study of myocardial remodeling and heart failure due to its status as the number one cause of mortality worldwide. In humans, a pathologic occlusion forms in a coronary artery and reperfusion of that occluded artery is considered essential to maintain viability of the myocardium at risk. Although essential for myocardial recovery, reperfusion of the ischemic myocardium creates its own tissue injury. The physiologic response and healing of an ischemia/reperfusion injury is different from a chronic occlusion injury. Myocardial ischemia/reperfusion injury is gaining recognition as a clinically relevant model for myocardial infarction studies. For this reason, parallel animal models of ischemia/reperfusion are vital in advancing the knowledge base regarding myocardial injury. Typically, ischemia of the mouse heart after left anterior descending (LAD) coronary artery occlusion is confirmed by visible pallor of the myocardium below the occlusion (ligature). However, this offers only a subjective way of confirming correct or consistent ligature placement, as there are multiple major arteries that could cause pallor in different myocardial regions. A method of recording electrocardiographic changes to assess correct ligature placement and resultant ischemia as well as reperfusion, to supplement observed myocardial pallor, would help yield consistent infarct sizes in mouse models. In turn, this would help decrease the number of mice used. Additionally, electrocardiographic changes can continue to be recorded non-invasively in a time-dependent fashion after the surgery. This article will demonstrate a method of electrocardiographically confirming myocardial ischemia and reperfusion in real time.

Введение

Сердечно - сосудистые заболевания по- прежнему является ведущей причиной смерти во всем мире ^1,2. Мало того, что левый желудочек (ЛЖ) самой мышечной камеры, отвечает за перекачивает кровь от сердца ко всему телу ^3, это общее место сердечной травмы после инфаркта миокарда ^4. Левого желудочка смерть ткани часто приводит к систолической сердечной недостаточности. Животные модели болезни сердца являются обязательными для улучшения биомедицинских исследований сердечно-сосудистой системы. Штамм C57BL / 6 мышей были популярным выбором для моделей на животных из-за их быстрое время размножения, низкая стоимость и легкость в генетических изменений. Большинство мышиные хирургических моделей для изучения болезни сердца связаны с закупоркой ЛАД ветви левой коронарной артерии. ЛАД иногда называют левым тупым маргинальный ^5,6. ЛАД поставляет кровь к левой передней желудочка и передне-боковой стенки. Исследования окклюзия ЛАД направлены на индукции передних инфаркты, иногда расширение Intо нижних и боковых стенок ⁷ областей.

Две модели, которые часто используются для инфарктов миокарда исследований включают в себя хронический окклюзия инфаркт миокарда и повреждения миокарда при ишемии / реперфузии. Хроническая окклюзия создается хирургическим путем ушивания вокруг и постоянно блокируя поток крови через ЛАД. Ишемическое / реперфузионное создается во многом таким же образом, только с переходным процессом, обычно 30-60 мин, ишемического периода. Для достижения преходящую ишемию, Окклюзионный шовные связи вокруг LAD и небольшой ПЭ-10 трубка, которая расположена параллельно ЛАД на поверхности эпикарда сердца, за которым следует период реперфузии, где трубка и закупоривания шовный материал удаляется и кровь позволили еще раз течь через артерии и в миокард. Операция ишемией / реперфузией было признано клинически значимых из-за характера повреждений после реперфузии параллелометра лечение человека инфарктами, который включает PROMпт коронарная ангиопластика и стентирование артерий или аортокоронарное. Как правило, во время этих операций, ишемия ЛЖ в сердце мыши подтверждается видимой бледности стенки миокарда. Тем не менее, просто выполняя операции на электрокардиограмме (ЭКГ) набивать при постоянных условиях наблюдения, видимые изменения могут наблюдаться в ЭКГ, тем самым подтверждая ишемии и реперфузии миокарда мыши.

Хотя мышиные сердце похоже на сердце человека во многих отношениях, в том числе его четырехкамерного структуру, сердца также имеют различия. Одна очевидная разница средняя ЧСС у взрослых мышей составляет 600 - 700 ударов в минуту (BPM) , тогда как у взрослого человека составляет ~ 60-100 ударов в минуту ^8,9. Кроме того, у мышей переполяризацию волны, J и T, часто сливаются с деполяризации QRS-комплекс с четким ST-сегмента трудно различить ^10. Для того, чтобы усложнить процесс electrocardiographicallу подтверждающие ишемию миокарда, это возвышение волны Т и ST-сегмента , которые используются в качестве маркеров для диагностики ишемии и повреждения миокарда миокарда у людей, клинически упоминается как ST е levation м yocardial я nfarction или НФГ. Одним из основных отличий между человеческими и мышиными формами волны является то, что S-волна сразу же следует быть J-волна, которая передает непосредственно в отрицательный Т-волны. Во время острой ишемии миокарда у мышей амплитуда S-волны уменьшается и непосредственно следуют ненормальным J-волны и перевернутую Т-волны ^11. Т-волна не кажется, представляют значительную часть реполяризации у мышей ^11. Несмотря номенклатуры и мыши против человеческих различий, ЭКГ подтверждение мышиного ишемии миокарда и реперфузии еще возможно и относительно просто. Ради упрощения интерпретации сигнала, отрезок между СДТ называется ST-segmeнт в настоящем документе.

Рекомендации ИМПСТ , опубликованные в 2013 году рекомендовать пациенту время от двери до баллона менее 90 мин ¹² .Это означает , что временные рамки от выявления окклюзии коронарной артерии пациента до артерии возобновлено должно быть не менее 90 мин. Бьющееся сердце постоянно работает , и поэтому, имеет высокую окислительный метаболизм и высокий уровень потребления кислорода ^3. Чтобы обеспечить это, сеть капилляров доступна каждому миоцита ^3. Это займет всего сердечного несколько ударов, чтобы исчерпать свой кислород и питательных веществ. В окне 90 мин, ишемический область сердца у человека будет заблокирован от получения между 5,400 и 9,000 сердце бьется ценность богатой кислородом крови. В том же 90 мин окно, мышь будет иметь 54000 до 63000 бьется сердце. Экспериментальные точки времени для мышиного травмы ишемии / реперфузии, как правило, от 30 до 60 мин.

Важность разработкиING дополнительный метод подтверждения ишемии миокарда и реперфузии в мышиной модели оказывает глубокое воздействие на согласованность и воспроизводимости данных при инфаркте исследований при ишемии / реперфузии. Существующая практика визуального наблюдения сердца для изменения цвета ткани не является адекватным в качестве автономной диагностики. Кроме того, при реперфузии после снятия трубки и шовного материала не гарантируется. Хотя артерии больше не завязывается, артерии может не иметь устойчивого повреждения во время процедуры и может стать невозможным reperfuse. Было бы полезно, чтобы иметь запись электрокардиографические изменения, чтобы подтвердить реперфузии, а не полагаться на наблюдениях миокарда бледность и Rubor (красный цвет). Сердца, которые не показывают маркеров повреждения при ишемии / реперфузии может затем быстро помечаться и решение о том, как действовать могут быть сделаны следователями.

И, наконец, создание записи ЭКГ изменения от исходного уровня на протяжении гое ишемических и реперфузионных периоды позволяет исследователям продолжать контролировать сердце после начальной операции. Исследователи в настоящее время упускать из виду сердце, как только операция будет завершена. ЭКГ представляет собой простой способ получить представление о происходящих изменениях в миокарде часов до нескольких дней после операции. ЭКГ записывается в моменты времени после операции может выявить поздние развивающееся Q-волны, что свидетельствует о продолжающемся ухудшении или отмиранию тканей. Тем не менее, для эффективного ручаться новых или ухудшение маркеров электрокардиографические, базовый ЭКГ должны быть доступны для сравнения.

Этот протокол будет показано, как подготовить, получить и интерпретировать ЭКГ для подтверждения ишемии и реперфузии сердца мыши с использованием 8 - 12 недель самцам мышей C57BL / 6.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все хирургические процедуры , выполняемые на животных должны проводиться в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных ¹³ или других соответствующих этических принципов. Протоколы должны быть одобрены комитетом по защите здоровья животных в соответствующем учреждении, прежде чем продолжить.

1. Подготовка к ЭКГ

Примечание: Перед началом работы надеть средства индивидуальной защиты, включая перчатки, защитные очки и чистой лаборатории пальто или одноразового платье.

1. Очистите ЭКГ площадку с помощью безалкогольными и не на основе хлорной обеззараживающим раствором. Осторожно использовать деликатную задачу стереть, чтобы промокните излишки раствора, чтобы гарантировать, что электрод накладка не повреждаются.
2. Если ЭКГ накладка имеет функцию нагрева, используйте его. Анестезированных мышей имеют тенденцию терять тепло тела быстро. Нагреть площадку до 40-42 ° С , чтобы поддерживать нормотермических температуру тела 37 ° С на протяжении ¹⁴ операции. Монитор нрав теларатура с помощью ректального термометра. Регулировка температуры колодки, необходимой для поддержания температуры тела ~ 37 ° C.
3. Поскольку большинство торакотомии выполняются с помощью мыши, лежа на спине (лежа на спине), убедитесь, что переключатель переворачивается в "лежачем" настройки. Многие подушечки ЭКГ имеют функцию переключения между склонных и лежачее позиций. Неспособность выбрать правильную ориентацию, может привести к искажению событий электрокардиограмме.
4. Обезболить мышь, используя 5% вдыхаемого изофлуран и 1 л / мин кислорода. После того, как мышь под наркозом, передача мыши на площадку ЭКГ оснащена анестезии носового конуса и снизить изофлуран до 2% и 1 л / мин кислорода. Подтверждение надлежащего анестезии путем обеспечения мышь не реагирует, когда нога мыши зажимается пинцетом.
5. Нанесите тонкий слой смазки глаз мазь на глаза мышки, чтобы предотвратить сухость и повреждение роговицы в то время как под наркозом.
6. Очистите лапы мыши с влажная салфетка, чтобы удалить все видимые постельные принадлежностикоторые могут быть прилипла к лапам или может помешать передаче электрических импульсов от лап к ЭКГ площадку. Сухие лапы с вытирания.
7. Нанесите небольшое количество (немного меньше, чем USD центов) в случае высокой электропроводимости электролитом для каждой из четырех металлических электродов на ЭКГ площадку.
   Примечание: Не забудьте применить только небольшое количество геля, как слишком много геля делает его трудно сдержать лапами на стартовую площадку с помощью липкой ленты. Кроме того, лапы, вероятно, выскользнуть из сдержанности во время операции, если они были мокрыми перед нанесением ленты.
8. С помощью мыши в положении лежа на спине, используйте четкую медицинскую ленту , чтобы удержать каждую лапу на соответствующий электрод (рисунок 1). Сначала нажмите каждую лапу к ее части ленты, а затем приклеить ленту на ЭКГ площадку. Убедитесь, что каждый сдержанным лапа находится в контакте с электролитическим гелем и электродом.

2. Получение ЭКГ

1. В зависимости от оборудования, используемого для приобретения ЭКГ, конфigure машину таким образом, чтобы кривая ЭКГ может быть визуализированы в реальном времени. Для регистрации ЭКГ с использованием физиологических параметров проверки на эхокардиографии машине, живой В-режиме, изображение будет иметь форму волны ЭКГ, проходящую по нижней части экрана.
   Примечание: Смотрите отдельные направляющие машины пользователей, чтобы определить, как лучше настроить это оборудование.
2. Включить в реальном времени визуализации сигнала ЭКГ, нажав клавишу B-режима на эхокардиографию машине или эквивалент на других устройствах записи ЭКГ.
   1. Отрегулируйте разрешение, чтобы учесть различия в амплитуде. Если пик R-волны или корыто (долины) от Q-волны находятся вне визуального кадра, настроить разрешение, пока не наблюдается вся высота волны.
      Примечание: Это можно сделать на вкладке физиологических параметров на эхокардиографии машине. Нажмите на увеличение или уменьшение стрелки, пока весь сигнал не виден.
3. Всякий раз, когда изображение должно быть ОБТained, снимите ЭКГ площадку инструментов. Прикосновение мышь во время записи ЭКГ с пинцетом или пальцами нарушит форму волны. Убедитесь в том, что мышь еще и нетронутым на ЭКГ площадку перед записью каких-либо ЭКГ.
4. Используйте "запись" машины или функцию "Store", прежде чем принимать какие-либо хирургические разрезы на мышь. Это изображение будет использоваться в качестве основы для сравнения позже.

3. Хирургическая процедура и запись ЭКГ

1. Вводят наркозом мышь с обезболивающей (бупренорфин, 1,5 мкг, внутрибрюшинно) перед началом. Детали ишемии / реперфузии хирургическая процедура также может быть найден в другом месте ^5.
2. Удалить волосы вокруг хирургического участка химически или механически и дезинфицировать области с бетадин раствором. Используйте скальпель, чтобы сделать вертикальный разрез параллельно пищевода и трахеи. Осторожно переместить лимфатические узлы в каждую сторону от разреза до тонкой ткани, покрывающие трахеиподвергаются. Использование щипцов, осторожно отделить ткань, пока белые хрящевые кольца трахеи не видны.
   Примечание: Как правило, мы используем для удаления волос лосьон Nair. Лосьон наносится на месте операции в течение ~ 1 мин. Наир затем тщательно смывается с помощью физиологического раствора или воды. Этот способ является предпочтительным в нашей лаборатории, так как высокое разрешение эхокардиографию (которая может обнаружить волосяные фолликулы) выполняется до и после операции. Тем не менее, следует соблюдать осторожность, чтобы избежать таких чувствительных областях, как половые органы, а затем тщательно промывая Nair прочь, чтобы избежать возможных ожогов кожи.
3. Быстро удалить нос мыши из носового конуса и вставьте вентиляционную трубку в рот мыши и по направлению к горлу. Когда кончик вентиляционной трубки виден через открытую область шеи, выравнивать трубку с началом трахеи. Аккуратно шевелить сторону трубки в сторону, не применяя давление в сторону повышения до насосно-компрессорных труб горками в трахею, которые могут быть подтверждены визуально тhrough полупрозрачной трахеи.
4. Убедитесь в том, что мышь остается под наркозом во время процедуры интубации. Пауза интубация и вернуть мышь к носового конуса, если он начинает шевелиться.
5. Используя петлю струны, крючок два передних зуба мышки через петлю и лента строка заканчивается на ЭКГ площадку, чтобы стабилизировать голову мыши и обеспечить вентиляцию трубы не двигается во время операции. Быстро прикрепить вентиляционные трубы к грызунами искусственной вентиляции легких и настроить параметры вентиляции в зависимости от веса мыши. Лента вентиляционная труба на месте.
6. Накройте подвергается трахее мыши с марлей, смоченной в теплом физиологическом растворе, чтобы сохранить ткани от высыхания.
7. Сделайте вертикальный разрез скальпелем вдоль левой стороны грудины.
8. Использование щипцов, осторожно отделить фасции слой от мышечного слоя. Аккуратно вырежьте нижележащие слои мышц, не сокращая видимые кровеносные сосуды.
9. Использование щипцов, возьмите третье ребро и тянутьвверх мягко. Поддерживать захват ребра с одной стороны, и использовать хирургические ножницы, чтобы тщательно вырезать межреберной ткани между третьим и четвертым ребром. Убедитесь в том, что легкие не повреждены.
   Примечание: Легких втягивается глубоко в грудной полости почти сразу же после того, как полости грудной клетки были проколоты хирургического разреза в связи с потерей градиента давления. Подождите, пока легкие не убирается, прежде чем продолжить.
10. Используйте пинцет, чтобы захватить и аккуратно отделить тонкий слой перикарда, который окружает сердце.
11. Вставьте втягивающие или вручную с помощью пинцета как ребра преднатяжителями, чтобы переместить ребра в положение, при котором сердце видна между ребрами.
    Примечание: Это обычная практика, чтобы двигаться вниз левую лапу мыши так, что она перекрывает нижнюю правую лапу во время размещения лигатуры. Это помогает расположить сердце так, чтобы ушко левого предсердия, или предсердие, хорошо видна во время размещения лигатуры. Имейте в виду, что действительный ЭКГ шaveforms не будет получен в то время как нижняя левая лапа от электрода. По этой причине желательно, чтобы вернуть лапу к его электрода после того, как ушивание лигатура проходит через ткани миокарда, но до того, как узел затягивается.
12. Найдите ЛАД визуально, под левое предсердие. Стремительно вставить 7-0 шелковую конический сшивающий иглу в миокарде достаточно глубоко, чтобы пройти под ЛАД, но не так глубоко, как проникнуть в полость левого желудочка. Потянуть сшивающий лигатуры через пока не будет около 4 см сшивающего шелка слева на свободном (без иглы) конец сшивающего лигатуры.
13. Начните, чтобы связать простой шовный узел. После того, как свободный конец сшивающего шелк был вытянут через петли, чтобы сформировать узел, пауза.
14. Держа обе свободные и иглы концы сшивающего шелка с пинцета, вставить см секцию PE-10 трубки ~ 1 под формовочного узла и на вершине поверхности эпикарда.
15. Если левая лапа мышки пересечена, вернуть лапу к его прона электроде. Затянуть узел таким образом, что ПЭ-10 трубка пришит к сердцу. Отпустите все физический контакт с мышью, чтобы позволить ЭКГ для записи.
16. Разрешить форму волны ЭКГ, чтобы перебрать в течение ~ 10 сек. Проверьте форму волны ЭКГ визуально и записи сигнала, как "Время Occlusion". Если Т-волна не приводит к увеличению амплитуды в течение 1 мин, переоценивать размещение лигатуры.
    1. Если амплитуда Т-волны не увеличивается, либо выбросить животное из исследования или попытаться исправить лигатуры размещение.
17. Визуально проверьте цвет миокарда, чтобы подтвердить ишемический частокол ЛЖ.
18. Если изменения ЭКГ и миокарда изменения цвета указывают на ишемию, двойной узел шовный вокруг ПЭ-10 трубки.
19. Накройте открытой грудной полости с теплым физиологическим раствором марлю.
20. Запись ЭКГ каждые 5-10 мин в течение продолжительности ишемического периода.

4. Подтверждение реперфузии с помощью ЭКГ

1. Удалить солевой марли бухточкукольцо грудной полости и визуализировать сердце.
2. Используйте лезвие, чтобы разрезать сшивающий шелк на вершине PE-10 трубки. После того, как лигатуру разрезают, удалите секцию PE-10 трубки и осторожно удалите сшивающий лигатуры из миокарда.
3. Отпустите все физический контакт с мышью и позволяют волны ЭКГ ~ 10 сек для цикла. Запись сигнала как "Время реперфузии." Продолжить запись кривых ЭКГ через каждые 5-10 мин до получения желаемого времени экспериментальная точка не будет достигнута.
4. Настройка разрешения для изменения амплитуды по мере необходимости. Если Т-волна не изменяется при удалении ПЭ-10 насосно-компрессорных и лигатуры, реперфузионного не подтверждается.
   1. Если Т-волны не изменяется при удалении трубки, либо выбросить животное из исследования или попытаться исправить лигатуры размещение.
5. Осмотреть миокард дополнительно подтвердить реперфузии путем возвращения в красный цвет.
6. Закрыть грудной полости сшиванием межреберье с 5-0шов шелковой нитью, применяя мягкое давление на грудь мыши высылать избыток воздуха, который вступил во время операции. Затем сшить мышечных слоев и, наконец, кожа. Примечание: приложение давления к грудной полости, не может быть достаточной, чтобы эвакуировать грудной полости воздуха у всех мышей. Таким образом, шприц и игла метод эвакуации следует использовать для обеспечения того, чтобы весь воздух был исключен.
7. Запись последнего ЭКГ перед включением ингаляционной анестезии и удаления от лапы мыши от электродов. Увеличение кислорода до 2 л / мин и поддерживать вентиляцию, пока мышь не приходит в сознание.
8. Разрешить мыши для восстановления в постоянной контролируемой температурой окружающей среды, например , грелку или теплый инкубатор, чтобы избежать изменчивости инфаркта. Treat мышь с бупренорфин через 24 часа после операции, а затем по мере необходимости, как показано в масштабе мыши гримасу.
   Примечание: Процедура реперфузии также подробно обсуждается в Xu и др ^5.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Нормальный мышиный ЭКГ отображается на рисунке 2 , с буквенными маркерами для электрических событий P, Q, R, S, J и T. P является начальным предсердия деполяризации. QRS является волной деполяризации над желудочками. J рано переполяризация и Т представляет собой гете...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

С помощью изменения ЭКГ в качестве дополнительного метода для подтверждения ишемии миокарда и реперфузии обеспечивает точное размещение окклюдируя лигатуры. Точность лигатуры размещения имеет решающее значение для снижения изменчивости данных среди животных. ЛАД в сердце мыши явля...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vevo 1100	Fujifilm Visual Sonics		Echocardiography Machine
Mouse Handling Plate	Fujifilm Visual Sonics		Heated ECG plate
Signa-Gel			Highly Conductive Multi-
Electrode Gel	Parker	15-25	Purpose Electrolyte
Transpore Medical Tape	3M	1527-0
PI-Spray II	Pharmaceutical Innovations	NDC 36-2013-25	Cleaning agent for ECG plate
C57Bl6 Mice	The Jackson Laboratory	000664	Male, 8 - 12 wk
IsoThesia-Isoflurane	Henry Schein	NDC 1169-0500-1
Excel	Microsoft
Systane Nighttime Lubricant Eye Ointment	Alcon	65050935
7-0 Perma-Hand Silk Sutures	Ethicon	640.O32
5-0 Perma-Hand Silk Sutures	Ethicon	K809.O32
Surgical Scissors	ROBOZ	RS-5881
Forceps	Fine Science Tools	11052-10
Gauze	Bio Nuclear Diagnostics Inc	DIS-022B
Needle Holder	Fine Science Tools	12565-14
Buprenex CIII	Patterson Veterinary	0-891-9756	Buprenorphine Hydrochloride Analgesic
Betadine	Purdue Products	67618-150-08
Nair	Church and Dwight Co.	NRSL-22339-05