Cartographie des interactions ARN-ARN à l'échelle mondiale à l'aide de psoralène biotinylé

Résumé

Ici, nous détaillons la méthode de l'équation de S de P soralen réticulé, L igated et S élués (SPLASH), ce qui permet une cartographie génomique des interactions intra-moléculaires et intermoleculaires d'ARN-ARN in vivo . SPLASH peut être appliqué pour étudier les interactions de l'ARN des organismes, y compris la levure, les bactéries et les humains.

Résumé

Savoir comment les ARN interagissent avec eux-mêmes et avec d'autres sont essentiels à la compréhension de la régulation des gènes basée sur l'ARN dans la cellule. Bien que des exemples d'interactions ARN-ARN telles que les interactions entre ARNm et ARNm aient montré qu'ils régulent l'expression des gènes, la mesure dans laquelle les interactions ARN se produisent dans la cellule est encore inconnue. Les méthodes antérieures pour étudier les interactions de l'ARN ont principalement porté sur des sous-groupes d'ARN qui interagissent avec une protéine particulière ou des espèces d'ARN. Ici, nous détaillons une méthode appelée S équation de P soralen réticulé, L igated et S élués (SPLASH) qui permettent une capture intégrale des interactions de l'ARN dans le génome in vivo de manière impartiale. SPLASH utilise une réticulation in vivo , une ligature de proximité et un séquençage à haut débit pour identifier globalement les partenaires intramoléculaires et intermoleculaires de base d'ARN. SPLASH peut être appliqué à différents organismes, y compris des bactéries, des levures et des cellules humaines, ainsi qu'uneDes conditions cellulaires diverses pour faciliter la compréhension de la dynamique de l'organisation de l'ARN dans divers contextes cellulaires. L'ensemble du protocole SPLASH expérimental prend environ 5 jours pour être complété et le flux de travail informatique prend environ 7 jours pour être complété.

Introduction

Étudier comment les macromolécules se plient et interagissent entre elles est la clé pour comprendre la régulation des gènes dans la cellule. Bien que de nombreux efforts aient été concentrés au cours de la dernière décennie pour comprendre comment l'ADN et les protéines contribuent à la régulation des gènes, on connaît relativement moins de la régulation post-transcriptionnelle de l'expression des gènes. L'ARN porte des informations à la fois dans sa séquence linéaire et dans sa structure secondaire et tertiaire ¹ . Sa capacité à baser la paire avec elle-même et avec d'autres est importante pour sa fonction in vivo . Les progrès récents dans la sondage de la structure secondaire de l'ARN à haut débit ont fourni des informations précieuses sur les emplacements des régions à double et simple brin dans le transcriptome ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8} , HoweLes informations sur les partenaires d'interaction d'appariement manquent encore. Pour déterminer quelle séquence d'ARN interagit avec une autre région d'ARN dans le transcriptome, nous avons besoin d'informations globales en paire.

La cartographie par paire d'interactions ARN d'une manière globale et impartiale a traditionnellement été un défi majeur. Alors que les approches antérieures, telles que CLASH ⁹ , hiCLIP ¹⁰ et RAP ¹¹ , sont utilisées pour identifier les interactions de l'ARN à grande échelle, ces techniques classent généralement l'association de base d'ARN pour un sous-ensemble d'ARN qui interagissent avec une protéine particulière ou des espèces d'ARN. Les développements récents dans l'étude des interactions globales de l'ARN comprennent la méthode RPL ¹² , qui ne stabilise pas les interactions de l'ARN in vivo et ne peut donc capturer qu'un sous-ensemble d'interactions in vivo . Pour surmonter ces défis, nous et d'autres avons développé des stratégies à l'échelle du génome et impartiales à maP ARNA interagère in vivo , en utilisant des versions modifiées du réticulant psoralen ^{13 , 14 , 15} . Dans ce protocole, nous décrivons les détails pour effectuer l'équation de S de P soralen réticulé, L igated et S élués (SPLASH), qui utilise du psoralène biotinylé pour reticuler l'association des ARN in vivo , suivie d'une ligature de proximité et d'un séquençage à haut débit pour Identifiez les partenaires de base de l'ARN au niveau du génome ( Figure 1 ) ¹⁵ .

Dans ce manuscrit, nous décrivons les étapes pour effectuer SPLASH à l'aide de cellules adhérentes cultivées, dans ce cas, des cellules HeLa. Le même protocole peut être facilement adapté aux cellules de mammifères en suspension et aux cellules de levure et de bactéries. En bref, les cellules HeLa sont traitées avec du psoralène biotinylé et irradiées à 365 nm pour paires de bases d'ARN interactives par liaison croisée in vivo. Les ARN sont ensuite extraits des cellules, fragmentés et enrichis pour les régions de réticulation en utilisant des billes de streptavidine. Les fragments d'ARN interagissant sont ensuite ligaturés ensemble en utilisant une ligature de proximité et transformés en une banque d'ADNc pour un séquençage profond. Lors du séquençage, les ARN chimériques sont mappés sur le transcriptome / génome pour identifier les régions qui interagissent avec l'ARN qui sont couplées l'une à l'autre. Nous avons utilisé SPLASH avec succès pour identifier des milliers d'interactions d'ARN in vivo dans la levure et différentes cellules humaines, y compris le couplage intramoléculaire et intermoleculaire de base d'ARN dans diverses classes d'ARN, tels que snoRNAs, lncRNAs et mRNAs, pour apercevoir l'organisation structurelle et les modèles d'interaction Des ARN dans la cellule.

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Protocole

1. Traitement des cellules HeLa avec extraction du psoralène biotinylé et de l'ARN

1. Culture Les cellules HeLa dans le milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) complétées par 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de streptomycine pénicilline (PS) dans une plaque de 10 cm.
2. Lavez les cellules HeLa deux fois avec 5 mL de 1x PBS. Égoutter l'excès de PBS complètement du plat en plaçant le plat verticalement pendant 1 min.
3. Ajouter 1 ml de PBS contenant 200 uM de psoralène biotinylé et digitonine à 0,01% p / v, uniformément aux cellules et incuber à 37 ° C pendant 5 min. Bien que le psoralène biotinylé puisse pénétrer dans la cellule, sa perméabilité est beaucoup plus élevée lorsque les cellules sont exposées à de faibles quantités de digitonine (0,01%) pendant 5 min
4. Retirez le couvercle de la plaque de 10 cm contenant les cellules HeLa traitées et placez le plat à plat sur de la glace. Irradiate le plat contenant les cellules avec 365 nm UV pendant 20 min sur glace, à une distance de 3 cm des ampoules UV, en utilisant l'agent de réticulation UV.
5. Isoler tARN d'Otal provenant de cellules HeLa par extraction au thiocyanate de guanidinium-phénol-chloroforme selon le protocole du fabricant. Ajouter un volume 1: 1 d'isopropanol pour précipiter l'ARN à température ambiante pendant 30 min.
   Point de pause: l'ARN peut être conservé à -20 ° C dans l'isopropanol indéfiniment. Un point blot peut être effectué à cette étape pour vérifier que le psoralène biotinylé est entré avec succès dans les cellules et a réticulé des ARN in vivo ( figure 2 ).
6. Centrifuger l'ARN précipité à 20 000 xg pendant 30 min à 4 ° C pour récupérer l'ARN. Retirer le surnageant et ajouter 1 ml d'éthanol à froid à 70% à la pastille d'ARN pour laver l'ARN.
7. Centrifuger les échantillons à 20 000 xg pendant 15 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et sécher à l'air le pastillolet pendant 5 minutes à température ambiante.
8. Ajouter de l'eau libre de nuclease à la pastille d'ARN et quantifier la concentration d'ARN en utilisant un spectromètre UV.
   Point de pause: l'ARN peut être stocké à -80 ° C après fCoup de fouet dans l'azote liquide.

2. Fragmentation de l'ARN

1. Préchauffer 15 μL de tampon de fragmentation d'ARN 2x et 10 μL d'échantillon d'ARN (1 μg / μL) individuellement dans des tubes de PCR de 0,2 ml, à 95 ° C pendant 1 min. Mélanger 10 μl du tampon de fragmentation d'ARN 2x chauffé avec 10 μL d'échantillon d'ARN en pipetant vers le haut et vers le bas. Incuber l'échantillon à 95 ° C pendant 5 min. Arrêtez la réaction en refroidissant instantanément la réaction sur de la glace.
2. Transférer et regrouper les 2 réactions de fragmentation à un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL. Ajouter 40 μL d'eau libre de nuclease à la réaction, 10 μl d'acétate de sodium 3 M, 1 μL de glycogène et 300 μL d'éthanol à 100% à la réaction de fragmentation. Incuber l'ARN à -20 ° C pendant au moins 1 h pour précipiter l'ARN.
3. Centrifuger l'ARN précipité à 20 000 xg pendant 30 min, enlever le surnageant et laver l'ARN en utilisant 1 ml d'éthanol à 70%.
4. Centrifuger l'ARN à 20 000 xg pendant 15 min, remOve le surnageant et dissolvez l'ARN dans 20 μL d'eau libre de nuclease.

3. Sélection et élution de la taille de l'ARN

1. Ajouter 20 μL de colorant de chargement d'ARN à l'ARN récupéré dans le tube de microcentrifugeuse. Chauffer l'ARN avec le colorant de chargement de l'ARN à 95 ° C pendant 3 min et le placer sur de la glace pendant 2 min.
2. Ajouter 3 μL de colorant de chargement d'ARN à 0,25 μL d'échelle d'ADN de 10 nt dans un tube à microcentre. Chauffer l'échelle à 95 ° C pendant 3 min et la placer sur de la glace pendant 2 min.
3. Charger l'échelle dénaturée et les échantillons sur un gel d'urée TBE de 6,6 cm x 6,8 cm et un fractionnement de la taille par électrophorèse pendant 40 minutes à 180 V. Tacher le gel dans 10 ml de tampon TBE contenant 1: 10 000 de taches de gel d'acide nucléique pour 5 Min. Dans l'obscurité.
4. Percez un tube de microcentrifugeuse propre de 0,6 mL au fond en utilisant une aiguille de 24 G et placez-le dans un tube de microcentrifugeuse de 2 mL.
5. Visualiser les bandes sur le gel post-teint en utilisant un transilluminateur et couper une tranche de gel correspondant à 90-110 nt. Transférer la tranche de gel dans le tube de microcentrifugeuse 0,6 mL perforé dans le tube de microcentrifugeuse de 2 mL. Cette sélection de taille est effectuée pour permettre aux fragments chimériques d'avoir une longueur minimale à mapper au transcriptome et à distinguer entre les produits ligaturés de proximité contre les produits non liés dans les étapes de sélection de taille en aval.
6. Centrifuger les tranches de gel à 12 000 xg à température ambiante pendant 2 minutes pour déchiqueter la tranche de gel et la recueillir dans le tube de microcentrifugeuse de 2 mL. Jeter le tube de microcentrifugation vide de 0,6 mL. Ajouter 700 μL de tampon d'élution à la tranche de gel déchiquetée dans le tube de microcentrifugeuse de 2 mL et incuber à 4 ° C pendant la nuit avec une rotation constante, pour permettre la diffusion des échantillons dans le tampon.
7. Transférer les tranches de gel et le tampon d'élution dans un filtre à centrifuger et centrifuger à 20 000 xg pendant 2 min. Les tranches de gel seront piégées dans le compartiment supérieur du filtre. Jeter les tranches de gel et le compartiment supérieur.
8. Ajouter 1 μl de glycogène et 700 μL d'isopropanol à 100% dans le filtrat dans le tube de microcentrifugeuse et précipiter l'ARN à -20 ° C pendant au moins 1 h ou pendant une nuit.
   Point de pause: l'ARN peut être précipité dans l'isopropanol indéfiniment à -20 ° C.
9. Centrifuger l'ARN précipité à 20 000 xg pendant 30 min à 4 ° C pour récupérer l'ARN. Retirez le surnageant et ajoutez 1 ml d'éthanol à froid à 70% pour laver la pastille d'ARN. Centrifuger la pastille lavée à 20 000 xg pendant 15 min à 4 ° C.
10. Retirez le tampon de lavage et ajoutez 20 μL d'eau libre de nuclease pour ré-endiguer l'ARN. Quantifier la concentration d'ARN à l'aide d'un spectromètre UV.
    Point de pause: l'ARN peut être conservé à -80 ° C après la congélation instantanée dans l'azote liquide.

4. Enrichissement des régions de réticulation de l'ARN

1. Vortex streptavidine a revêtu des billes magnétiques vigoureusement pour remettre en suspension les billes de manière homogène dans le tube. Transférer 100 μL de perles à un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL et le placer sur un aimantIc repose pendant 1 min pour permettre aux perles de s'en tenir au côté magnétique du tube. Retirez le tampon de stockage des perles et retirez le tube du support d'aimant.
2. Ajouter 1 ml de tampon de lyse sur les perles dans le tube de microcentre et la pipette de haut en bas. Placez la microcentruche contenant des perles sur le support magnétique pendant 1 minute pour séparer les billes du tampon de lavage. Répétez ceci pour un total de 3 lavages.
3. Retirez le tampon de lavage des perles en plaçant la microcentre contenant des perles sur le support magnétique pendant 1 min. Ajouter un inhibiteur de RNase (1: 200) dans le tampon de lyse et ajouter 100 μL de tampon de lyse aux billes lavées dans le tube de microcentrifugeuse.
4. Ajouter 2 mL de tampon d'hybridation fraîchement préparé, 1 mL de tampon de lyse supplémenté, 1,5 μg d'ARN fractionné en taille et 100 μL de billes resuspendues à un tube à centrifuger conique de 15 mL. Vortez le tube doucement.
5. Incuber le tube de centrifugation conique de 15 mL à 37 ° C pendant 30 minutes avec une rotation de bout en bout.Préchauffer le tampon de lavage à 37 ° C.
6. Placer les tubes centrifuges coniques de 15 mL sur un support magnétique pour 15 mL de tubes pendant 2 minutes pour séparer les grains du tampon. Pipettez le tampon prudemment hors du tube et jetez-le.
7. Ajouter 1 ml de tampon de lavage pré-réchauffé sur les perles, pipeter vers le haut et vers le bas et transférer les perles dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL. Incuber aux perles à 37 ° C pendant 5 min, avec une rotation de bout en bout.
8. Centrifuger brièvement le contenu du tube à microcentrifugeuse. Placez les perles lavées de 1,5 ml dans des tubes à microcentrifugeuse sur un support magnétique pour des tubes de 2 ml pendant 1 min, afin de séparer les billes du tampon de lavage. Retirez le tampon des billes en faisant pipeter doucement le tampon hors du tube de microcentre.
9. Ajouter 1 ml de tampon de lavage préchauffé sur les perles et la pipette vers le haut et vers le bas pour répéter le lavage. Effectuez un total de 5 lavages. À la fin du ^5ème lavage, retirer le tampon de lavage en plaçant le microfuge contenant des billes sur le support d'aimants pour1 minute.

5. Ligature de proximité

1. Ajouter 1 ml de tampon de polynucléotide kinase T4 froid (PNK) aux perles lavées et incuber les perles pendant 5 min à 4 ° C, avec une rotation de bout en bout. Placez le tube de microcentre contenant les perles sur la bande magnétique pendant 1 min et retirez doucement le tampon T4 PNK. Répétez cette étape pour un total de 2 lavages et retirez le tampon T4 PNK après le dernier lavage.
2. Ajouter les tampons aux perles, selon le tableau 1 . Pour permettre aux extrémités 3 'du fragment d'ARN d'être ligaturées à des adaptateurs 3' ci-dessous, incuber les perles dans le tampon à 37 ° C pendant 4 h avec agitation constante pour convertir le groupe phosphate cyclique 3 'à la fin de l'ARN en 3 'OH.
3. Ajouter les tampons à la réaction précédente, selon le tableau 2 . Pour permettre à la fin 5 'des fragments d'ARN d'être compétente pour la ligature, incuber la réaction à 37 ° C pendant 1 h avec une agitation constante en présence d'ATP, Pour convertir 5 'OH sur l'ARN en 5' phosphate.
4. Ajouter un tampon à la réaction précédente pour effectuer une ligature de proximité, selon le tableau 3 . Incuber la réaction à 16 ° C pendant 16 h, avec une agitation constante,
5. Placez la microcentruche contenant l'ARN ligaturé sur un support d'aimant pendant 1 min. Retirez soigneusement le surnageant et ajoutez 1 ml de tampon de lavage à température ambiante sur les perles. Resuspendre en pipetant vers le haut et vers le bas.
6. Placez le tube de microcentre sur le support d'aimant pendant 1 min et retirez le tampon de lavage avec précaution. Effectuez un total de 2 lavages et retirez le tampon de lavage des billes à la fin du deuxième lavage.
7. Ajouter 100 μL de tampon RNA PK sur les billes et resuspendre par pipettage vers le haut et vers le bas. Chauffer les échantillons à 95 ° C pendant 10 minutes sur un bloc de chaleur.
8. Refroidir l'échantillon sur de la glace pendant 1 min et ajouter 500 μl de thiocyanate de guanidinium-phénol-chloroforme à l'échantillon. Mélanger en vortexant vigoureusement pendant 10 s. Incuber le mixtuÀ température ambiante pendant 10 min.
   Point de pause: l'ARN peut être stocké dans du thiocyanate de guanidinium-phénol-chloroforme à -80 ° C pendant quelques mois.
9. Ajouter 100 μL de chloroforme aux échantillons de guanidinium thiocyanate-phénol-chloroforme extraits. Vortex vigoureusement pendant 10 s. Centrifuger les échantillons à 20 000 xg pendant 15 min à 4 ° C.
10. Transférer 400 μL de la couche aqueuse à un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL. Ajouter 800 μL (2 volumes) d'éthanol à 100% et mélanger en pipetant vers le haut et vers le bas.
11. Transférer la solution d'ARN aux colonnes de nettoyage d'ARN et récupérer l'ARN suivant les instructions du fabricant, en veillant à ce que même les petits ARN soient retenus. Eluisez l'ARN dans 100 μL d'eau exempte de nuclease.
    Point de pause: l'ARN peut être conservé à -80 ° C après la congélation instantanée dans l'azote liquide.

6. Réticulation inverse du psoralène biotinylé

1. Transférer les 100 μL des échantillons élués dans un puits de 24 puits pla mangé. Retirer le couvercle et irradier l'échantillon sous UV 254 nm, pendant 5 minutes sur de la glace.
2. Transférer l'échantillon réticulé inversé à un tube de microcentrifugeuse propre. Ajouter 10 μl d'acétate de sodium, 1 μl de glycogène et 300 μL d'éthanol à 100% et précipiter l'ARN à -20 ° C pendant au moins 1 h ou toute une nuit.
   Point de pause: l'ARN peut être précipité dans l'éthanol indéfiniment à -20 ° C.
3. Centrifuger l'ARN précipité à 20 000 xg pendant 30 min à 4 ° C pour récupérer l'ARN. Retirez le surnageant et ajoutez 1 ml d'éthanol à froid à 70% pour laver la pastille d'ARN.
4. Centrifuger la pastille lavée à 20 000 xg pendant 15 min à 4 ° C. Retirez le tampon de lavage et ajoutez 4,25 μL d'eau libre de nucléase pour ré-endiguer l'ARN. Transférer l'ARN à un tube PCR de 0,2 ml.
   Point de pause: l'ARN peut être conservé à -80 ° C après la congélation instantanée dans l'azote liquide.

7. Transcription inverse et circulatoire d'ADNc

1. Ajouter 0,75 μLDe liaison à l'ARN (0,5 μg / μL) à l'échantillon ressuscité dans le tube PCR et à la chaleur à 80 ° C pendant 90 s. Placez l'échantillon sur de la glace pendant 2 min.
2. Ajouter les tampons à l'échantillon dénaturé pour la ligature d'adaptateur 3 ', selon le tableau 4 . Incuber la réaction à 25 ° C pendant 2,5 h.
3. Transférer la réaction à un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL. Ajouter 90 μL d'eau libre de nuclease à la réaction, suivie de 10 μl d'acétate de sodium, 1 μL de glycogène et 300 μL d'éthanol à 100%. Précipiter l'ARN à -20 ° C pendant au moins 1 h ou pendant une nuit.
   Point de pause: l'ARN peut être précipité dans l'éthanol indéfiniment à -20 ° C.
4. Centrifuger l'ARN précipité à 20 000 xg pendant 30 min à 4 ° C pour récupérer l'ARN. Retirez le surnageant et ajoutez 1 ml d'éthanol à froid à 70% pour laver la pastille d'ARN.
5. Centrifuger la pastille lavée à 20 000 g pendant 15 minutes à 4 ° C. Retirer le tampon de lavage remettre à nouveau le culot dans 5 μL de w libres de nucleaseAter.
6. Ajouter 5 μL de colorant de chargement d'ARN à l'ARN récupéré dans le tube de microcentrifugeuse. Chauffer l'ARN avec le colorant de chargement de l'ARN à 95 ° C pendant 3 min et le placer sur de la glace pendant 2 min.
7. Ajouter 3 μL de colorant de chargement d'ARN à 0,25 μL d'échelle d'ADN de 10 nt dans un tube à microcentre. Chauffer l'échelle à 95 ° C pendant 3 min et la placer sur de la glace pendant 2 min.
8. Effectuer le fractionnement de la taille en utilisant un gel d'urée TBE de 8,6 cm x 6,8 cm, comme dans les étapes 3.3 et 3.4.
9. Visualiser le gel coloré avec une tache d'acide nucléique en utilisant le transilluminateur et couper une tranche de gel correspondant à 110-140 nt sur l'échelle. Transférer la tranche de gel dans le tube de microcentrifugation 0,6 mL perforé dans le tube de microcentrifugeuse de 2 ml et suivre le protocole à partir des étapes 3,6 à 3,9.
10. Ajouter 5 μl d'eau libre de nuclease pour ré-endiguer la pastille d'ARN. Transférer l'ARN à un tube PCR de 0,2 ml.
    Point de pause: l'ARN peut être conservé à -80 ° C après la congélation instantanée dans l'azote liquide.
11. Ajouter 1 μL d'amorce RT à 1,2581; M à l'ARN dans le tube PCR et la chaleur à 80 ° C pendant 2 min. Placez l'échantillon sur de la glace pendant 2 min.
12. Ajouter les tampons pour la transcription inverse selon le tableau 5 . Incuber la réaction à 50 ° C pendant 30 min.
13. Ajouter 1,1 μl de NaOH 1 N à la réaction et chauffer à 98 ° C pendant 20 min. Placez la réaction sur la glace.
14. Transférer la réaction à un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL. Ajouter 90 μL d'eau libre de nuclease à la réaction, suivie de 10 μl d'acétate de sodium, 1 μL de glycogène et 300 μL d'éthanol à 100%. Précipiter l'ADN à -20 ° C pendant au moins 1 h ou pendant une nuit.
    Point de pause: l'ADN peut être précipité dans l'éthanol indéfiniment à -20 ° C.
15. Centrifuger l'ADN précipité à 20 000 g pendant 30 min à 4 ° C pour récupérer l'ADN. Retirer le surnageant et ajouter 1 mL d'éthanol à froid à 70% pour laver le culot d'ADN. Centrifuger la pastille lavée à 20 000 xg pendant 15 min à 4 ° C. Retirer le tampon de lavage remettre en suspension le pelLaisser entrer 5 μL d'eau libre de nuclease.
16. Effectuer le fractionnement de la taille en utilisant un gel d'urée TBE de 8,6 cm x 6,8 cm, comme dans les étapes 3.3 et 3.4.
17. Visualisez le gel post-teint en utilisant le transilluminateur et coupez une tranche de gel correspondant à 200-240 nt sur l'échelle. L'ADNc transcrit inverse est maintenant de 96 bases plus long que le fragment d'ARN en raison de l'addition de l'amorce RT à 96 bases. Transférer la tranche de gel dans le tube de microcentrifugeuse 0,6 mL perforé dans le tube de microcentrifugeuse de 2 mL.
18. Centrifuger les tranches de gel à 12 000 xg à température ambiante pendant 2 minutes pour déchiqueter la tranche de gel et la recueillir dans le tube de microcentrifugeuse de 2 mL. Jeter le tube de microcentrifugation vide de 0,6 mL.
19. Ajouter 700 μl de tampon d'élution à la tranche de gel déchiquetée dans le tube de microcentrifugeuse de 2 mL et incuber à 37 ° C pendant 2 h avec une rotation constante. Suivez le protocole comme décrit aux étapes 3.7 à 3.8.
20. Ajouter 6 μl d'eau libre de nuclease pour ré-endiguer la pastille d'ADN. Transférer l'ADN à un tube PCR de 0,2 ml.
    Point de pause: l'ADN peut être stocké à -80 ° C après la congélation instantanée dans l'azote liquide.
21. Ajouter les tampons à la réaction pour la circularisation d'ADNc, selon le tableau 6 . Incuber la réaction à 60 ° C pendant 1 h et chauffer à 80 ° C pendant 10 minutes pour inactiver la réaction.
22. Transférer la réaction à un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL. Purifier l'ADNc circulant à l'aide d'une colonne de nettoyage d'ADN suivant les instructions du fabricant. Ajouter 20 μL d'eau libre de nuclease à la colonne pour éluer l'ADNc purifié.
    Point de pause: l'ADN peut être stocké à -20 ° C pendant quelques mois.

8. Amplification par PCR (PCR à petite échelle)

1. Ajouter les tampons à la réaction selon le Tableau 7 pour l'amplification PCR pour tester le nombre minimal de cycles nécessaires pour l'amplification de la bibliothèque.
2. Mettre en place les conditions de cyclage PCR selon le tableau 8 . Pause la réaction et transfert 5 μL deLa réaction de PCR à 10, 15 et 20 cycles, dans des tubes séparés de microcentrifugation de 1,5 mL.
3. Ajouter 1 μL de colorant de chargement de gel d'ADN 6x à chacune des 5 μL de réaction de PCR aux différents cycles. Effectuer une électrophorèse sur gel sur un gel d'agarose à 3%, à 120 V, pendant 1 h pour visualiser les produits de PCR.
   1. Utilisez le plus petit nombre de cycles de PCR (Y) qui montrent une amplification à environ 250 bases (à la Figure 3 , il existe une bande forte à 15 cycles d'amplification et une bande faible à 10 cycles. 12 cycles d'amplification PCR à grande échelle sont susceptibles de Génère suffisamment de matériel pour le séquençage profond car la quantité d'ADNc utilisée est 10 fois supérieure à celle de l'amplification PCR à petite échelle.

9. Amplification par PCR (PCR à grande échelle) et purification

1. Ajouter les tampons à la réaction selon le tableau 9 pour l'amplification par PCR pour la PCR à grande échelle.
2. Mettre en place les conditions de cyclage PCR selonTableau 10 .
3. Ajouter 5 μL de colorant de chargement de gel d'ADN 6x aux 25 μL de réaction de PCR et charger dans un puits d'un gel d'agarose à 3%. Chargez 1 kb plus l'échelle d'ADN dans un puits séparé. Effectuer une électrophorèse sur gel à 100 V pendant 1,5 h.
4. Visualisez le gel complet en utilisant un transilluminateur UV.
5. Taille extrait une tranche de gel contenant des produits de PCR de 200 à 300 bases et transférez le gel à un tube de microcentrifugeuse propre de 2 mL.
6. Ajouter 1 ml de tampon de solubilité dans le gel, d'un kit d'extraction au gel d'ADN, jusqu'à la tranche de gel et incuber à température ambiante pendant 30 min, ou jusqu'à dissolution du gel, avec une agitation constante.
7. Ajouter 200 μL d'isopropanol au gel dissous et bien mélanger en pipettant. Transférer 700 μL de l'échantillon dans une colonne de nettoyage d'extraction de gel d'ADN et centrifuger à 13 000 xg pendant 30 s. Continuez à transférer l'échantillon dissous sur la colonne jusqu'à ce que tout l'échantillon ait été chargé sur la colonne.
8. Ajouter 500 μL de tampon de solubilité dans le gel,Suivi de 700 μL de tampon de lavage de colonne, à la colonne, selon le protocole du fabricant. Ajouter 12 μl d'eau libre de nuclease au centre de la colonne pour échapper à l'ADN. Point de pause: l'ADN peut être stocké à -20 ° C.
9. Quantifier la concentration de l'ADN en utilisant la quantification fluorométrique. Si plusieurs bibliothèques sont construites et regroupées pour le séquençage, ajoutez une quantité égale de chaque échantillon au pool, pour un séquençage à haut débit.

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Résultats

La figure 1 représente le schéma du flux de travail SPLASH. Lors de l'addition de psoralène biotinylé en présence de 0,01% de digitonine et de réticulation UV, l'ARN total est extrait des cellules et un point-tache est réalisé pour s'assurer que la réticulation du biotinylé à l'ARN s'est produite efficacement ( figure 2 ). Nous utilisons des oligos biotinylés de 20 bases comme témoins positifs po...

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Discussion

Ici, nous décrivons en détail le flux de travail expérimental et informatique pour SPLASH, une méthode qui nous permet d'identifier les interactions ARN en paire d'une manière généreuse. Nous avons utilisé avec succès SPLASH dans les cultures bactériennes, de levure et humaines et prévoyons que la stratégie peut être largement appliquée à divers organismes sous différents états cellulaires. L'une des étapes critiques du protocole consiste à commencer par au moins 20 μg d'ARN réticul?...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb Plus DNA Ladder	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10787026	DNA ladder
10 bp DNA ladder	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10821-015	DNA ladder
20% SDS solution	First BASE	BUF-2052-1L
20x SSC	First BASE	BUF-3050-20X1L
3.0 M Sodium Acetate Solution	First BASE	BUF-1151-1L-pH5.2	Required for nucleic acid precipitation
40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1	Bio-Rad	1610145	TBE Urea gel component
Ambion Buffer Kit	Life Technologies Holdings Pte Ltd	AM9010
Ammonium Persulfate, Molecular Grade	Promega	V3131	TBE Urea gel component
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	B0126-25G
Chloroform	Merck	1.02445.1000	RNA extraction
Single strand DNA ligase	Epicentre	CL9025K	CircLigase II ssDNA Ligase
Centrifuge tube filters	Sigma-Aldrich	CLS8160-96EA	Costar Spin-X centrifuge tube filters
D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE	Sigma-Aldrich	D5628-1G	For cell treatment
Dark Reader Transilluminator	Clare Chemical Research	Dark Reader DR89X Transilluminator	Blue light transilluminator
DNA Gel Loading Dye (6x)	Life Technologies Holdings Pte Ltd	R0611	Required for agarose gel electroporation
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Pan BioTech	P04-03500	For Hela cell culture
Streptavidin magnetic beads	Life Technologies Holdings Pte Ltd	65002	Dynabeads MyOne Streptavidin C1
Magnetic stand for 15 mL tubes	Life Technologies Holdings Pte Ltd	12301D	DynaMag-15
Magnetic stand for 15 mL tubes	Life Technologies Holdings Pte Ltd	12321D	DynaMag-2
ThermoMixer	Eppendorf	5382 000.015	Eppendorf ThermoMixer C
Biotinylated psoralen	Life Technologies Holdings Pte Ltd	29986	EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin
F8T5/BL	Hitachi	F8T5/BL	365 nm UV bulb
Fetal Bovine Serum	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10270106	Components of Hela medium
Formamide	Promega	H5052	Component in hybridization buffer
G8T5	Sankyo-Denki	G8T5	254 nm UV bulb
Glycogen	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10814010	Required for nucleic acid precipitation
Nanodrop	Life Technologies Holdings Pte Ltd	Nanodrop 2000	Spectrophotometer for nucleic acidquantification
Nuclease free water	First BASE	BUF-1180-500ml
Penicillin Streptomycin	Life Technologies Holdings Pte Ltd	15140122	Components of Hela medium
High-Fidelity DNA polymerase (2x)	Life Technologies Holdings Pte Ltd	F531L	Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (2x)
Primers Set 1	New England Biolabs	E7335L	PCR primers
DNA Gel Extraction Kit	QIAgen	28106	QIAquick Gel Extraction Kit
Fluorometric Quantification kit	Life Technologies Holdings Pte Ltd	Q32854	Qubit dsDNA HS Assay Kit
RNA clean up kit	Qiagen	74106	RNeasy Mini Kit Silica-membrane column
Rnase Inhibitor	Life Technologies Holdings Pte Ltd	AM2696	SUPERase In
Reverse transcriptase	Life Technologies Holdings Pte Ltd	18080400	SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix
Nucleic Acid Gel Stain	Life Technologies Holdings Pte Ltd	S11494	SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL
T4 Polynucleotide Kinase	New England Biolabs	M0201L	End repair enzyme
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs	M0204L	Enzyme for proximity ligation
T4 RNA Ligase 2, truncated KQ	New England Biolabs	M0373L	Enzyme for adaptor ligation
Temed	Bio-Rad	1610801	TBE Urea gel component
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform	Life Technologies Holdings Pte Ltd	15596018	TRIzol® Reagent for RNA extraction
Urea	First BASE	BIO-2070-5kg
UV crosslinker	Stratagene	400072	UV Stratalinker 1800
UV Transilluminator	UVP	95-0417-01	For visualizing of bands
Xylene Cyanol FF	Sigma-Aldrich	X4126-10G
DNA cleanup it	Zymo Research	D4004	Zymo DNA concentrator-5
List of software required
FastQC software	0.11.4	http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
SeqPrep software	1.0.7	https://github.com/jstjohn/SeqPrep
BWA software	0.7.12	http://bio-bwa.sourceforge.net/
SAMTOOLS software	1.2.1	http://www.htslib.org/
PULLSEQ software	1.0.2	https://github.com/bcthomas/pullseq
STAR software	2.5.0c	https://github.com/alexdobin/STAR
rem_dups.py PYTHON script	PYTHON 2.7.11	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
find_chimeras.py PYTHON script	PYTHON 2.7.11	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
pickJunctionReads.awk AWK script	AWK GNU 4.1.2	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
Buffer composition
Elution buffer
0.3 M sodium acetate
Lysis Buffer
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer
100 mM NaCl
10 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
0.5% SDS
Hybridization Buffer
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4 °C)
Always add Superase-in fresh before use
2x SSC Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
2x RNA fragmentation buffer
18 mM MgCl2
450 mM KCl
300 mM Tris-Cl pH 8.3
2x RNA loading Dye
95% Formamide
0.02% SDS
0.02% bromophenol blue
0.01% Xylene Cyanol
1 mM EDTA
3' RNA adapter sequence: 5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC
RT primer sequence: AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG