Biotinylated Psoralen을 사용하여 RNA-RNA 상호 작용을 세계적으로 매핑

요약

여기에서는 생체 내에서 분자 내 및 분자간 RNA-RNA 상호 작용의 게놈 전체 매핑을 가능하게하는 P soralen crosslinked, Ligated 및 S - selected Hysbrids (SL)의 S equencing 방법을 자세히 설명합니다. SPLASH는 효모, 박테리아 및 인간을 포함한 유기체의 RNA 상호 작용을 연구하는 데 적용 할 수 있습니다.

초록

RNA가 어떻게 상호 작용 하는지를 아는 것은 세포에서 RNA 기반의 유전자 조절을 이해하는 데 중요합니다. microRNA-mRNA 상호 작용과 같은 RNA-RNA 상호 작용의 예가 유전자 발현을 조절하는 것으로 나타 났지만 RNA 상호 작용이 세포에서 일어나는 전체 범위는 아직 알려지지 않았습니다. RNA 상호 작용을 연구하기위한 이전의 방법은 주로 특정 단백질 또는 RNA 종과 상호 작용하는 RNA의 부분 집합에 초점을 맞추었다. 여기에서는 P soralen crosslinked, Ligated 및 S elected H ybrids (SPLASH)라는 이름의 방법을 상세히 설명합니다.이 방법을 사용하면 생체 내 에서 RNA 상호 작용 을 편파적으로 캡처 할 수 있습니다. SPLASH는 생체 내 교차 결합, 근접 결합 및 높은 처리량 시퀀싱을 사용하여 분자 내 및 분자간 RNA 염기쌍 파트너를 세계적으로 확인합니다. SPLASH는 박테리아, 효모 및 인간 세포를 포함한 다른 유기체에 적용 할 수 있습니다.다양한 세포 환경에서 RNA 조직의 역 동성을 이해하는 데 도움이되는 다양한 세포 조건을 제공합니다. 전체 실험 SPLASH 프로토콜은 완료하는 데 약 5 일이 걸리고 계산 워크 플로는 완료하는 데 약 7 일이 걸립니다.

서문

거대 분자들이 서로 어떻게 접히고 상호 작용하는지 연구하는 것은 세포에서의 유전자 조절을 이해하는 열쇠입니다. 지난 수십 년간 DNA와 단백질이 유전자 조절에 어떻게 기여하는지에 대한 많은 노력이 집중되어 왔지만, 유전자 발현의 전사 후 조절에 관해서는 알려진 바가 상대적으로 적다. RNA는 선형 서열과 ² 차 및 3 차 구조 모두에서 정보를 전달한다. 생체 내에서 자신과 다른 사람과 쌍을 이루는 능력이 중요합니다. 고 처리량 RNA 2 차 구조 탐색에서의 최근의 진보는 트랜스 크립 풋 ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8} , howe에서 이중 및 단일 가닥 영역의 위치에 대한 가치있는 통찰을 제공했다페어링 상호 작용 파트너에 대한 ver 정보가 아직 많이 누락되었습니다. transcriptome에서 어떤 RNA 서열이 다른 RNA 영역과 상호 작용 하는지를 결정하기 위해, 우리는 전구 쌍방향 정보가 필요합니다.

쌍방향의 RNA 상호 작용을 전지구하고 공평하지 않은 방식으로 매핑하는 것은 전통적으로 중요한 과제였습니다. CLASH ⁹ , hiCLIP ¹⁰ 및 RAP ¹¹ 과 같은 이전의 접근법은 대규모 방식으로 RNA 상호 작용을 확인하는 데 사용되지만 이러한 기술은 일반적으로 특정 단백질 또는 RNA 종과 상호 작용하는 RNA의 하위 집합에 대해 RNA 염기쌍을 매핑합니다. 세계적 RNA 상호 작용을 연구하는 최근의 연구에는 생체 내에서 RNA 상호 작용 을 안정화시키지 않는 생체 내 상호 작용의 부분 집합 만 포착 할 수있는 RPL ¹² 방법이 포함된다. 이러한 어려움을 극복하기 위해 우리와 다른 사람들은 게놈 전반에 걸친 공평한 전략을 개발하여p RNA interactomes 를 in vivo 에서 사용하여 crosslinker psoralen ^{13 , 14 , 15} 의 변형 된 버전을 사용했습니다. 이 프로토콜에서는 생체 내에서 염기쌍 결합 RNA를 가교 결합시킨 비 오티 닐화 된 소 랄렌을 사용하여 근접 결합 및 높은 처리량 시퀀싱을 수행 한 P soralen crosslinked, Ligated 및 Sided H ybrids (SPLASH)의 S equencing을 수행하기위한 세부 사항을 설명합니다. 게놈 전체 RNA base-pairing 파트너를 확인하십시오 ( 그림 1 ).

이 원고에서 배양 된 접착 세포,이 경우에는 HeLa 세포를 사용하여 SPLASH를 수행하는 단계를 설명합니다. 동일한 프로토콜은 포유 동물 현탁액 및 효모 및 박테리아 세포에 쉽게 적용될 수 있습니다. 간략하게, HeLa 세포를 바이오 티 닐화 된 소 랄렌으로 처리하고 생체 내에서 상호 작용하는 RNA 염기 쌍을 가교 결합시키기 위해 365 nm에서 조사 하였다. 그런 다음 RNA를 세포에서 추출하고 스트렙 트 아비딘 (streptavidin) 구슬을 사용하여 가교 결합 영역을 강화하고 단편화합니다. 인터랙 팅 RNA 단편은 근접 결합을 사용하여 함께 결찰되고 심층 시퀀싱을위한 cDNA 라이브러리로 만들어진다. 시퀀싱시 키메라 RNA는 transcriptome / genome에 매핑되어 서로 쌍을 이루는 RNA 상호 작용 영역을 식별합니다. 우리는 SPLASH를 이용하여 snoRNA, lncRNA 및 mRNA와 같은 RNA의 다양한 부류에서 분자 내 및 분자간 RNA 염기 쌍 형성을 비롯하여 구조 조직 및 상호 작용 패턴을 엿볼 수있는 효모 및 다른 인간 세포 에서 생체 내 에서 수천 건의 RNA 상호 작용을 확인했습니다 세포에서 RNA의.

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프로토콜

1. Biotinylated Psoralen과 RNA 추출을 이용한 HeLa 세포의 치료

1. 10cm 플레이트에서 10 % 태아 소 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 스트렙토 마이신 (PS)을 보충 한 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM)에 배양 한 HeLa 세포.
2. HeLa 세포를 1x PBS 5 mL로 두 번 씻으십시오. 1 분 동안 접시를 수직으로 배치하여 접시에서 과잉 PBS를 완전히 배출하십시오.
3. Biotinylated psoralen과 0.01 % w / v digitonin을 200 μM 함유 한 PBS 1 mL를 세포에 균일하게 가하고 37 ° C에서 5 분간 품다. biotinylated 소 랄렌은 세포에 들어갈 수 있지만, 세포가 5 분 동안 낮은 수치의 digitonin (0.01 %)에 노출 될 때 그 투과성은 훨씬 더 높습니다
4. 처리 HeLa 세포가 들어있는 10cm 플레이트의 뚜껑을 제거하고 얼음 접시를 놓습니다. 자외선 crosslinker를 사용하여 자외선 전구에서 3cm의 거리에 얼음에 20 분 동안 365nm의 자외선과 세포를 포함하는 요리를 조사.
5. 격리제조 업체의 프로토콜에 따라 guanidinium thiocyanate - 페놀 - 클로로포름 추출하여 HeLa 세포에서 otal RNA. 실온에서 30 분 동안 RNA를 침전시키기 위해 1 : 1 부피의 이소프로판올을 첨가한다.
   정지 지점 : RNA는 이소프로판올에서 무한정 -20 ° C에 보관할 수 있습니다. 도트 블랏은이 단계에서 수행되어 biotinylated psoralen이 성공적으로 세포에 들어 왔고 in vivo에서 가교 된 RNA를 확인합니다 ( 그림 2 ).
6. RNA를 회수하기 위해 4 ℃에서 30 분 동안 20,000 xg에서 침전 된 RNA를 원심 분리한다. 뜨는를 제거하고 RNA를 씻어 RNA 펠렛에 70 % 찬 에탄올 1 ML을 추가합니다.
7. 4 ° C에서 15 분 동안 20,000 xg에서 샘플을 원심 분리하십시오. 상등액을 제거하고 실온에서 5 분 동안 펠렛을 공기 건조시킨다.
8. RNA pellet에 nuclease free water를 넣고 UV 분광계를 사용하여 RNA 농도를 정량하십시오.
   일시 정지 점 : RNA는 f 후에 -80 ° C에서 보관할 수 있습니다.액체 질소에서 래싱 동결.

2. RNA 단편화

1. 95 ° C에서 1 분간 0.2 mL PCR 튜브에서 2 x RNA fragmentation buffer 15 μL와 RNA 샘플 10 μL (1 μg / μL)을 개별적으로 예열하십시오. 아래로 pipetting하여 10 μL RNA 샘플과 가열 2X RNA 조각 버퍼의 10 μL를 섞는다. 샘플을 95 ℃에서 5 분 동안 배양한다. 얼음 위에서 반응물을 신속하게 냉각시켜 반응을 멈추십시오.
2. 1.5 ML microfuge 튜브에 2 조각 반응을 전송하고 풀. 반응에 Nuclease 무료 물 40 μL, 3 M 나트륨 아세테이트 10 μL, 글리코겐 1 μL 및 조각 반응에 100 % 에탄올 300 μL를 추가합니다. RNA를 침전시키기 위해 적어도 1 시간 동안 -20 ° C에서 RNA를 배양하십시오.
3. 침전 된 RNA를 30 분 동안 20,000 xg에서 원심 분리하고, 상층 액을 제거하고 70 % 에탄올 1 mL를 사용하여 RNA를 씻는다.
4. RNA를 20,000 xg에서 15 분간 원심 분리하십시오.뜨는를 제거하고 20 μl의 nuclease 무료 물에 RNA를 분해.

3. RNA 크기 선택 및 용리

1. microfuge 튜브에서 회수 RNA에 RNA 로딩 염료 20 μL를 추가합니다. 95 ° C에서 3 분 동안 RNA 로딩 염료로 RNA를 가열하고 2 분 동안 얼음 위에 놓습니다.
2. Microfuge 튜브에 10nt DNA 사다리 0.25 μL에 RNA 로딩 염료 3 μL를 추가합니다. 95 ° C에서 3 분 동안 사다리를 가열하고 2 분 동안 얼음 위에 놓습니다.
3. 변성 사다리와 샘플을 180V에서 40 분 동안 전기 영동에 의한 8.6cm x 6.8cm 6 % TBE 우레아 겔 및 크기 분획에 놓습니다. 5 분 동안 핵산 겔 얼룩의 1 : 10,000을 함유하는 TBE 완충액 10mL에서 겔을 염색합니다 어두운 밤.
4. 24 G 바늘을 사용하여 바닥에 깨끗한 0.6 ML microfuge 튜브를 찔러 2 ML microfuge 튜브에 넣으십시오.
5. transilluminator를 사용하여 포스트 얼룩이 진 젤의 밴드를 시각화하고 90-11에 해당하는 젤 슬라이스를 자르십시오.0 nt. 2 ML microfuge 튜브에 뚫린 0.6 ML microfuge 튜브에 젤 슬라이스를 전송합니다. 이 크기 선택은 키메라 단편이 트랜스 크립 to에 매핑하기위한 최소 길이를 가지도록하며, 하류 크기 선택 단계에서 근접 연결 제품 대 라이 게이션되지 않은 제품을 구별하기 위해 수행됩니다.
6. 젤 조각을 파쇄하고 2 ML microfuge 튜브에서 수집하기 위해 2 분 동안 실온에서 12,000 XG에서 젤 조각을 원심 분리하십시오. 빈 0.6 ML microfuge 튜브를 폐기하십시오. 버퍼로 샘플의 확산을 허용하기 위해 상수 회전 4 ° C 하룻밤 4에서 2 ML microfuge 튜브 및 부화에났습니다 젤 조각에 용리 버퍼 700 μL를 추가합니다.
7. 겔 조각과 용출 버퍼를 원심 튜브 필터에 옮기고 20,000 xg에서 2 분간 원심 분리합니다. 젤 슬라이스는 필터의 상단 구획에 갇히게됩니다. 젤 조각과 상단 구획을 버립니다.
8. 글리코겐 1 μL와 7microfuge tube의 여액에 100 μL의 이소프로판올을 넣고 최소 1 시간 또는 밤새 -20 ° C에서 RNA를 침전시킵니다.
   정지 지점 : RNA는 -20 ℃에서 무한정 이소프로판올에서 침전 될 수 있습니다.
9. RNA를 회수하기 위해 4 ℃에서 30 분 동안 20,000 xg에서 침전 된 RNA를 원심 분리한다. 뜨는를 제거하고 RNA 펠렛을 씻어 70 % 차가운 에탄올 1 ML을 추가합니다. 4 ° C에서 15 분 동안 20,000 xg에서 세척 한 펠릿을 원심 분리하십시오.
10. 세척 버퍼를 제거하고 RNA를 resuspend하는 nuclease 무료 물 20 μL를 추가합니다. 자외선 분광계를 사용하여 RNA의 농도를 정량하십시오.
    정지 지점 : RNA는 액체 질소에서 플래시 동결 후 -80 ° C에서 보관할 수 있습니다.

4. RNA 가교 영역의 강화

1. 소용돌이 streptavidin 코팅 된 자기 구슬을 격렬히 튜브에 균질하게 resuspend. 100 μL의 구슬을 1.5 mL 미세 튜브에 옮기고 자석 위에 놓습니다.ic은 구슬이 튜브의 자기면에 달라 붙도록 1 분 동안 서 있습니다. 구슬에서 저장 버퍼를 조심스럽게 제거하고 튜브를 자석 받침대에서 꺼냅니다.
2. microfuge 튜브와 피펫의 구슬에 1 ML의 용해 버퍼를 위아래로 추가합니다. 자석 버퍼에 구슬을 분리 1 분 자석 스탠드에 구슬을 포함 microfuge를 놓습니다. 이것을 3 회 반복하십시오.
3. 자성 스탠드에 구슬을 포함 microfuge를 1 분 동안 놓아서 구슬에서 세척 버퍼를 제거합니다. 용해 버퍼에 RNase 억제제 (1 : 200)를 추가하고 microfuge 튜브에 씻어 구슬에 용해 버퍼 100 μL를 추가합니다.
4. 갓 준비한 하이브 리다이 제이션 완충액 2 mL, 보충 용 용해 완충액 1 mL, 분획 화 된 RNA 1.5 μg 및 resuspended beads 100 μL를 15 mL 원추형 원심 튜브에 넣으십시오. 튜브를 부드럽게 보텍스하십시오.
5. 37 ° C에서 15 ML 원추형 원심 분리기 튜브를 품어 30 분 동안 회전을 끝내십시오.미리 37 ℃에서 워싱 완충액을 덥혀 라.
6. 버퍼에서 구슬을 분리 2 분 15 ML 튜브에 자기 스탠드에 15 ML 원추형 원심 분리기 튜브를 놓습니다. 완충액을 조심스럽게 튜브에서 빼내 버립니다.
7. 구슬에 사전 예열 세척 버퍼 1 ML을 추가하고 1.5 ML microfuge 튜브에 구슬을 위아래로 전송. 37 ° C에서 5 분 동안 비즈에서 인큐베이션하십시오.
8. microfuge tube의 내용물을 간단히 원심 분리하십시오. 세척 버퍼에서 구슬을 분리 1 분 2 ML 튜브에 자석 스탠드에 microfuge 튜브에 1.5 ML 씻어 구슬을 놓으십시오. 부드럽게 microfuge 튜브에서 버퍼를 pipetting하여 구슬에서 버퍼를 제거합니다.
9. 비드에 예열 된 세척 완충액 1 mL를 넣고 피펫을 위아래로 반복하여 세척하십시오. 총 5 번 세탁하십시오. 5 ^번째 세척이 끝나면, 자석 스탠드에 비즈가 들어있는 미세 지형을 놓아 세척 버퍼를 제거합니다.1 분.

5. 근접 연결

1. 세척 한 구슬에 차가운 T4 폴리 뉴클레오티드 키나아제 (PNK) 버퍼 1 ML을 추가하고 4 분 5 분 비즈를 품어 ° C, 끝 회전으로. 자성 스트립에 비즈가 들어있는 미세 튜브를 1 분 동안 넣고 부드럽게 T4 PNK 완충액을 제거합니다. 이 단계를 반복하여 총 2 회 세척하고 마지막 세척 후 T4 PNK 완충액을 제거합니다.
2. 표 1 에 따라 구슬에 완충액을 첨가하십시오. RNA 조각의 3 '말단을 아래의 3'아답터에 연결할 수 있도록하려면 RNA의 말단에있는 3 '사이 클릭 포스페이트 그룹을 37 ℃에서 4 시간 동안 일정한 교반으로 버퍼에서 배양하여 3'OH.
3. 표 2 에 따라 이전 반응에 완충액을 첨가한다. RNA 단편의 5 '말단이 연결 가능한 유도체가되도록하려면 ATP의 존재하에 일정한 교반하에 37 ° C에서 1 시간 반응을 항온 처리한다RNA상의 5 'OH를 5'포스페이트로 전환시킨다.
4. 표 3에 따라 근접 반응을 수행하기 위해 이전 반응에 버퍼를 추가합니다. 16 ° C에서 16 시간 동안 반응을 항온 배양하고,
5. 1 분 동안 자석 스탠드에 연결 RNA가 들어있는 microfuge를 놓습니다. 뜨는 부분을 조심스럽게 제거하고 실온 세척 완충액 1 mL를 비즈에 첨가한다. 위아래로 pipetting하여 Resuspend.
6. 1 분 동안 자석 스탠드에 microfuge 튜브를 놓고 신중하게 세척 버퍼를 제거하십시오. 총 2 번의 세척을 수행하고 두 번째 세척이 끝나면 세척 버퍼를 비드에서 제거합니다.
7. 구슬에 RNA PK 버퍼 100 μL를 추가하고 위아래로 pipetting하여 resuspend. 히트 블록에서 95 ° C에서 10 분 동안 시료를 가열합니다.
8. 얼음에서 1 분 동안 시료를 차게하고 시료에 guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform 500 μL를 첨가합니다. 10 초 동안 격렬하게 섞어서 섞는다. mixtureu를 품어 라.실온에서 10 분간 반응시킨다.
   Pause Point : RNA는 -80 ℃에서 guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform에 2 ~ 3 개월 동안 보관할 수 있습니다.
9. 구아니딘 티오 시아 네이트 - 페놀 - 클로로포름 추출 샘플에 클로로포름 100 μL를 첨가한다. 10 초 동안 활발하게 소용돌이 치다. 4 ° C에서 15 분 동안 20,000 xg에서 샘플을 원심 분리하십시오.
10. 수용액 층 400 μL를 새로운 1.5 mL 미세 튜브에 옮기십시오. 800 μL (2 부피)의 100 % 에탄올을 넣고 위아래로 pipetting하여 혼합합니다.
11. RNA 용액을 RNA cleanup column에 옮기고 제조자의 지시에 따라 RNA를 회수하여 작은 RNA가 유지되도록하십시오. nuclease없는 물 100 μL에서 RNA를 elute.
    정지 지점 : RNA는 액체 질소에서 플래시 동결 후 -80 ° C에서 보관할 수 있습니다.

6. Biotinylated Psoralen의 가교 가교

1. 용리 된 시료 100 μL를 24 well pl의 우물로 옮긴다.먹었다. 커버를 열고 UV 254 nm에서 샘플을 얼음 위에서 5 분간 조사합니다.
2. 반대 crosslinked 샘플을 깨끗한 microfuge 튜브로 전송하십시오. 아세트산 나트륨 10 μL, 글리코겐 1 μL 및 100 % 에탄올 300 μL를 첨가하고 -20 ° C에서 RNA를 침전 시키십시오.
   정지 지점 : RNA는 -20 ° C에서 무한정 에탄올에서 침전 될 수 있습니다.
3. RNA를 회수하기 위해 4 ℃에서 30 분 동안 20,000 xg에서 침전 된 RNA를 원심 분리한다. 뜨는를 제거하고 RNA 펠렛을 씻어 70 % 차가운 에탄올 1 ML을 추가합니다.
4. 4 ° C에서 15 분 동안 20,000 xg에서 세척 한 펠릿을 원심 분리하십시오. 세척 버퍼를 제거하고 RNA를 resuspend에 Nuclease 무료 물의 4.25 μL를 추가합니다. 0.2 ML PCR 튜브에 RNA를 전송하십시오.
   정지 지점 : RNA는 액체 질소에서 플래시 동결 후 -80 ° C에서 보관할 수 있습니다.

7. 역전사 및 cDNA 원형 화

1. 0.75 μL 추가RNA 링커 (0.5 μg / μL)를 PCR 튜브에 재현 탁한 시료와 80 ℃에서 90 초 동안 가열합니다. 샘플을 얼음에 2 분 동안 두십시오.
2. 표 4 에 따라 3 '어댑터 연결에 대한 변성 샘플에 버퍼를 추가합니다. 반응물을 25 ° C에서 2.5 시간 동안 품어 낸다.
3. 1.5 ML microfuge 튜브에 반응을 전송하십시오. 반응에 nuclease 무료 물 90 μL, 나트륨 아세테이트, 글리코겐 1 μL 100 % 에탄올 300 μL 10 μL 다음에 추가하십시오. 최소한 1 시간 또는 밤새 -20 ° C에서 RNA를 침전시킵니다.
   정지 지점 : RNA는 -20 ° C에서 무한정 에탄올에서 침전 될 수 있습니다.
4. RNA를 회수하기 위해 4 ℃에서 30 분 동안 20,000 xg에서 침전 된 RNA를 원심 분리한다. 뜨는를 제거하고 RNA 펠렛을 씻어 70 % 차가운 에탄올 1 ML을 추가합니다.
5. 4 ℃에서 15 분 동안 20,000 g에서 세척 된 펠릿을 원심 분리한다. 씻어 버퍼를 제거 nuclease 무료 5 μL의 펠렛을 resuspendater.
6. microfuge 튜브에서 회수 RNA에 RNA 로딩 염료 5 μL를 추가합니다. 95 ° C에서 3 분 동안 RNA 로딩 염료로 RNA를 가열하고 2 분 동안 얼음 위에 놓습니다.
7. Microfuge 튜브에 10nt DNA 사다리 0.25 μL에 RNA 로딩 염료 3 μL를 추가합니다. 95 ° C에서 3 분 동안 사다리를 가열하고 2 분 동안 얼음 위에 놓습니다.
8. 단계 3.3 및 3.4에서와 같이 8.6cm x 6.8cm 6 % TBE 우레아 겔을 사용하여 크기 분별을 수행하십시오.
9. transilluminator를 사용하여 핵산 얼룩으로 염색 젤을 시각화하고 사다리에 110-140 NT에 해당하는 젤 슬라이스를 자르십시오. 2 ML microfuge 튜브에 구멍이 난 0.6 ML microfuge 튜브에 젤 슬라이스를 전송하고 3.6- 3.9 단계에서 프로토콜을 따르십시오.
10. RNA 펠렛을 resuspend에 nuclease 무료 물 5 μL를 추가합니다. 0.2 ML PCR 튜브에 RNA를 전송하십시오.
    정지 지점 : RNA는 액체 질소에서 플래시 동결 후 -80 ° C에서 보관할 수 있습니다.
11. RT 프라이머 1 μL를 1.25에 첨가81, M을 PCR tube의 RNA에 첨가하고 80 ℃에서 2 분간 가열 하였다. 샘플을 얼음에 2 분 동안 두십시오.
12. 역전사를위한 버퍼를 표 5 에 따라 추가한다. 50 ° C에서 30 분 동안 반응을 품는다.
13. 1 N NaOH 1.1 μL를 반응물에 넣고 98 ° C에서 20 분간 가열한다. 반응물을 얼음에 담그십시오.
14. 1.5 ML microfuge 튜브에 반응을 전송하십시오. 반응에 nuclease 무료 물 90 μL, 나트륨 아세테이트, 글리코겐 1 μL 100 % 에탄올 300 μL 10 μL 다음에 추가하십시오. 적어도 1 시간 또는 밤새 -20 ° C에서 DNA를 침전시킵니다.
    정지 지점 : DNA는 -20 ° C에서 무기한 에탄올에서 침전 될 수 있습니다.
15. 침전 된 DNA를 4 ℃에서 30 분간 20,000 g으로 원심 분리하여 DNA를 회수한다. 뜨는를 제거하고 DNA 펠렛을 씻어 70 % 차가운 에탄올 1 ML을 추가합니다. 4 ° C에서 15 분 동안 20,000 xg에서 세척 한 펠릿을 원심 분리하십시오. 세척 버퍼를 제거하고 pel를 재현합니다.nuclease 무료 물 5 μL에 보자.
16. 단계 3.3 및 3.4에서와 같이 8.6cm x 6.8cm 6 % TBE 우레아 겔을 사용하여 크기 분별을 수행하십시오.
17. transilluminator를 사용하여 포스트 얼룩이 진 젤을 시각화하고 사다리에 200-240 NT에 해당하는 젤 슬라이스를 자르십시오. 역전사 된 cDNA는 이제 96 염기의 RT 프라이머를 첨가함으로써 RNA 단편보다 96 염기 더 길다. 2 ML microfuge 튜브에 뚫린 0.6 ML microfuge 튜브에 젤 슬라이스를 전송합니다.
18. 젤 조각을 파쇄하고 2 ML microfuge 튜브에서 수집하기 위해 2 분 동안 실온에서 12,000 XG에서 젤 조각을 원심 분리하십시오. 빈 0.6 ML microfuge 튜브를 폐기하십시오.
19. 2 ML microfuge 튜브에났습니다 젤 조각에 용리 버퍼 700 μL를 추가하고 37 ° C에서 일정한 회전과 2 시간 동안 품어. 단계 3.7 ~ 3.8에 설명 된대로 프로토콜을 따르십시오.
20. DNA 펠렛을 resuspend에 nuclease 무료 물 6 μL를 추가합니다. 0.2 ML PCR 튜브에 DNA를 전송합니다.
    Pause Point : 액체 질소로의 급속 냉동 후 DNA를 -80 ° C에서 보관할 수 있습니다.
21. 표 6 에 따라 cDNA circularization에 대한 반응에 버퍼를 추가합니다. 반응을 60 ℃에서 1 시간 동안 항온 배양하고 80 ℃에서 10 분 동안 가열하여 반응을 비활성화시킨다.
22. 1.5 ML microfuge 튜브에 반응을 전송하십시오. 제조 업체의 지침에 따라 DNA 클린업 컬럼을 사용하여 circularized cDNA를 정화. 정제 cDNA를 elution하기 위해 칼럼에 nuclease free water 20 μL를 첨가한다.
    Pause Point : DNA는 -20 ° C에서 2 ~ 3 개월 동안 보관할 수 있습니다.

8. PCR 증폭 (Small Scale PCR)

1. PCR 증폭을 위해 표 7 에 따라 반응 완충액을 첨가하여 라이브러리 증폭에 필요한 최소 사이클 수를 테스트합니다.
2. 표 8에 따라 PCR 사이클링 조건을 설정하십시오. 반응을 멈추고 5 μL별도의 1.5 mL microfuge 튜브에 10, 15 및 20 사이클에서 PCR 반응.
3. 다른 사이클에서 5 μL PCR 반응 각각에 6x DNA 겔로드 염료 1 μL를 추가합니다. PCR 제품을 시각화하기 위해 1 시간 120V에서 3 % 아가로 오스 겔에서 겔 전기 영동을 수행하십시오.
   1. 약 250 염기에서 증폭을 보이는 최저 PCR 사이클 수 (Y)를 사용하십시오 ( 그림 3 에서, 10 사이클에서 15 사이클의 증폭 및 약한 밴드에서 강한 밴드가 있음). 12 사이클의 대규모 PCR 증폭은 사용 된 cDNA의 양은 소규모 PCR 증폭의 10 배입니다.

9. PCR 증폭 (Large Scale PCR) 및 정제

1. 대규모 PCR의 PCR 증폭을 위해 표 9 에 따라 반응 완충액을 첨가한다.
2. 에 따라 PCR 순환 조건을 설정하십시오.표 10 .
3. PCR 반응 25 μL에 6X DNA 겔로드 염료 5 μL를 넣고 3 % 아가 로스 겔의 웰에 넣으십시오. 별도의 우물에 1 kb + DNA 사다리를 넣으십시오. 1.5 시간 동안 100V에서 겔 전기 영동을 수행하십시오.
4. UV Transilluminator를 사용하여 완성 된 젤을 시각화하십시오.
5. 크기는 200-300 기지에서 PCR 제품을 포함하는 젤 조각을 추출하고 깨끗한 2 ML microfuge 튜브에 젤을 전송하십시오.
6. 겔 슬라이스에 DNA 겔 추출 키트에서 겔 용해성 버퍼 1 ML을 추가하고 상온에서 30 분 동안 품어, 또는 지속적인 교반과 함께 젤이 녹을 때까지 품어 라.
7. 용해 된 겔에 이소프로판올 200 μL를 넣고 pipetting으로 잘 섞는다. 시료 700 μL를 DNA 겔 추출 정화 컬럼으로 옮기고 30 초 동안 13,000 xg에서 원심 분리하십시오. 모든 시료가 컬럼에로드 될 때까지 용해 된 시료를 컬럼으로 옮기십시오.
8. 500 μL 젤 용해도 버퍼를 추가,제조사의 프로토콜에 따라 컬럼 세척 버퍼 700 μL를 컬럼에 넣었다. nuclease-free 물 12 μL를 컬럼 중앙에 첨가하여 DNA를 제거하십시오. 정지 지점 : DNA는 -20 ° C에서 보관할 수 있습니다.
9. fluorometric quantification을 사용하여 DNA의 농도를 정량하십시오. 시퀀싱을 위해 여러 라이브러리를 구성하고 함께 풀링하는 경우 높은 처리량 시퀀싱을 위해 동일한 양의 각 샘플을 풀에 추가합니다.

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결과

그림 1 은 SPLASH 워크 플로우의 개략도입니다. 0.01 % digitonin 존재 하에서 biotinylated psoralen을 첨가하고 UV 가교 결합시 total RNA를 세포에서 추출하고 dot blot을 수행하여 RNA에 대한 biotinylated crosslinking이 효율적으로 일어 났는지 확인합니다 ( 그림 2 ). 우리는 biotinylated 20 base oligos를 양성 대조군으로 사용하여 biotinylated psoralen의 양을 ?...

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토론

여기서 우리는 게놈 전체에서 pair-wise RNA 상호 작용을 확인하는 방법 인 SPLASH의 실험 및 계산 워크 플로우에 대해 자세히 설명합니다. 우리는 박테리아, 효모 및 인간 문화에서 SPLASH를 성공적으로 활용했으며 전략이 다양한 세포 상태에서 다양한 유기체에 광범위하게 적용될 수있을 것으로 기대합니다. 프로토콜의 중요한 단계 중 하나는 하류 공정에 적합한 물질을 가지기 위해 적어도 20 μg의 가?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb Plus DNA Ladder	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10787026	DNA ladder
10 bp DNA ladder	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10821-015	DNA ladder
20% SDS solution	First BASE	BUF-2052-1L
20x SSC	First BASE	BUF-3050-20X1L
3.0 M Sodium Acetate Solution	First BASE	BUF-1151-1L-pH5.2	Required for nucleic acid precipitation
40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1	Bio-Rad	1610145	TBE Urea gel component
Ambion Buffer Kit	Life Technologies Holdings Pte Ltd	AM9010
Ammonium Persulfate, Molecular Grade	Promega	V3131	TBE Urea gel component
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	B0126-25G
Chloroform	Merck	1.02445.1000	RNA extraction
Single strand DNA ligase	Epicentre	CL9025K	CircLigase II ssDNA Ligase
Centrifuge tube filters	Sigma-Aldrich	CLS8160-96EA	Costar Spin-X centrifuge tube filters
D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE	Sigma-Aldrich	D5628-1G	For cell treatment
Dark Reader Transilluminator	Clare Chemical Research	Dark Reader DR89X Transilluminator	Blue light transilluminator
DNA Gel Loading Dye (6x)	Life Technologies Holdings Pte Ltd	R0611	Required for agarose gel electroporation
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Pan BioTech	P04-03500	For Hela cell culture
Streptavidin magnetic beads	Life Technologies Holdings Pte Ltd	65002	Dynabeads MyOne Streptavidin C1
Magnetic stand for 15 mL tubes	Life Technologies Holdings Pte Ltd	12301D	DynaMag-15
Magnetic stand for 15 mL tubes	Life Technologies Holdings Pte Ltd	12321D	DynaMag-2
ThermoMixer	Eppendorf	5382 000.015	Eppendorf ThermoMixer C
Biotinylated psoralen	Life Technologies Holdings Pte Ltd	29986	EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin
F8T5/BL	Hitachi	F8T5/BL	365 nm UV bulb
Fetal Bovine Serum	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10270106	Components of Hela medium
Formamide	Promega	H5052	Component in hybridization buffer
G8T5	Sankyo-Denki	G8T5	254 nm UV bulb
Glycogen	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10814010	Required for nucleic acid precipitation
Nanodrop	Life Technologies Holdings Pte Ltd	Nanodrop 2000	Spectrophotometer for nucleic acidquantification
Nuclease free water	First BASE	BUF-1180-500ml
Penicillin Streptomycin	Life Technologies Holdings Pte Ltd	15140122	Components of Hela medium
High-Fidelity DNA polymerase (2x)	Life Technologies Holdings Pte Ltd	F531L	Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (2x)
Primers Set 1	New England Biolabs	E7335L	PCR primers
DNA Gel Extraction Kit	QIAgen	28106	QIAquick Gel Extraction Kit
Fluorometric Quantification kit	Life Technologies Holdings Pte Ltd	Q32854	Qubit dsDNA HS Assay Kit
RNA clean up kit	Qiagen	74106	RNeasy Mini Kit Silica-membrane column
Rnase Inhibitor	Life Technologies Holdings Pte Ltd	AM2696	SUPERase In
Reverse transcriptase	Life Technologies Holdings Pte Ltd	18080400	SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix
Nucleic Acid Gel Stain	Life Technologies Holdings Pte Ltd	S11494	SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL
T4 Polynucleotide Kinase	New England Biolabs	M0201L	End repair enzyme
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs	M0204L	Enzyme for proximity ligation
T4 RNA Ligase 2, truncated KQ	New England Biolabs	M0373L	Enzyme for adaptor ligation
Temed	Bio-Rad	1610801	TBE Urea gel component
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform	Life Technologies Holdings Pte Ltd	15596018	TRIzol® Reagent for RNA extraction
Urea	First BASE	BIO-2070-5kg
UV crosslinker	Stratagene	400072	UV Stratalinker 1800
UV Transilluminator	UVP	95-0417-01	For visualizing of bands
Xylene Cyanol FF	Sigma-Aldrich	X4126-10G
DNA cleanup it	Zymo Research	D4004	Zymo DNA concentrator-5
List of software required
FastQC software	0.11.4	http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
SeqPrep software	1.0.7	https://github.com/jstjohn/SeqPrep
BWA software	0.7.12	http://bio-bwa.sourceforge.net/
SAMTOOLS software	1.2.1	http://www.htslib.org/
PULLSEQ software	1.0.2	https://github.com/bcthomas/pullseq
STAR software	2.5.0c	https://github.com/alexdobin/STAR
rem_dups.py PYTHON script	PYTHON 2.7.11	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
find_chimeras.py PYTHON script	PYTHON 2.7.11	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
pickJunctionReads.awk AWK script	AWK GNU 4.1.2	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
Buffer composition
Elution buffer
0.3 M sodium acetate
Lysis Buffer
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer
100 mM NaCl
10 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
0.5% SDS
Hybridization Buffer
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4 °C)
Always add Superase-in fresh before use
2x SSC Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
2x RNA fragmentation buffer
18 mM MgCl2
450 mM KCl
300 mM Tris-Cl pH 8.3
2x RNA loading Dye
95% Formamide
0.02% SDS
0.02% bromophenol blue
0.01% Xylene Cyanol
1 mM EDTA
3' RNA adapter sequence: 5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC
RT primer sequence: AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG