Mappatura delle interazioni RNA-RNA globalmente utilizzando Psoralen biotinilato

Riepilogo

Qui, abbiamo dettagliato il metodo di equilibrio di P soralen crosslinked, L igated e S elected H ybrids (SPLASH), che consente mapping a livello genomico delle interazioni RNA-RNA intramolecolari e intermolecolari in vivo . SPLASH può essere applicato per studiare interagenti RNA di organismi compresi lieviti, batteri e umani.

Abstract

Sapere come i RNA interagiscono con se stessi e con gli altri è fondamentale per capire la regolazione del gene basato su RNA nella cellula. Mentre esempi di interazioni RNA-RNA come le interazioni di microRNA-mRNA sono state dimostrate per regolare l'espressione genica, l'intero grado in cui si verificano interazioni RNA nella cella è ancora sconosciuto. I metodi precedenti per studiare le interazioni di RNA si sono concentrati principalmente su subsets di RNA che interagiscono con una particolare proteina o specie di RNA. Qui, abbiamo dettagliato un metodo denominato S equencing di P soralen crosslinked, L igated, e S eletti H ybrids (SPLASH) che consente la cattura genoma di interazioni RNA in vivo in modo imparziale. SPLASH utilizza la reticolazione in vivo , la legatura di prossimità e il sequenziamento ad alta velocità per identificare partner globalmente associati alla base di RNA intramolecolare e intermolecolare. SPLASH può essere applicato a diversi organismi, compresi batteri, lieviti e cellule umane, nonché aS diverse condizioni cellulari per facilitare la comprensione della dinamica dell'organizzazione di RNA in diversi contesti cellulari. L'intero protocollo sperimentale SPLASH richiede circa 5 giorni per completare e il flusso di lavoro computazionale richiede circa 7 giorni per completare.

Introduzione

Studiare come macromolecole si piegano e interagiscono tra loro è la chiave per comprendere la regolazione del gene nella cellula. Mentre molti sforzi sono stati focalizzati nell'ultimo decennio per comprendere come il DNA e le proteine ​​contribuiscono alla regolazione del gene, è relativamente meno noto circa la regolazione post-trascrizionale dell'espressione genica. L'RNA trasporta informazioni sia nella sequenza lineare che nella struttura secondaria e terziaria ¹ . La sua capacità di fondare la coppia con se stessa e con gli altri è importante per la sua funzione in vivo . I progressi recenti nel sondaggio della struttura secondaria RNA a elevata produttività hanno fornito preziosi approfondimenti sulle posizioni delle regioni a doppia e singola banda nel transcriptoma ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8} , howeVer le informazioni sui partner di interazione di coppia sono ancora in gran parte mancanti. Per determinare quale sequenza RNA interagisce con un'altra regione RNA nel trascrittoma, abbiamo bisogno di informazioni globali a livello di coppia.

La mappatura delle interazioni RNA in coppia in maniera globale e imparziale è stata tradizionalmente una grande sfida. Mentre gli approcci precedenti, come CLASH ⁹ , hiCLIP ¹⁰ e RAP ¹¹ , vengono utilizzati per identificare le interazioni RNA in modo scalare, queste tecniche tipicamente mappano l'accoppiamento base di RNA per un sottoinsieme di RNA che interagiscono con una particolare specie di proteine ​​o RNA. Gli sviluppi recenti nello studio delle interazioni globali di RNA includono il metodo RPL ¹² , che non stabilizza le interazioni RNA in vivo e quindi può solo catturare un sottoinsieme di interazioni in vivo . Per superare queste sfide, noi e gli altri abbiamo sviluppato strategie prive di genoma e maestoseP interazioni di RNA in vivo , utilizzando versioni modificate del psoralen ^{13 , 14 , 15} del reticolatore. In questo protocollo, descriviamo i dettagli per eseguire l'equilibrio di S di P soralen incrociato, L igato e S eligibriti (SPLASH), che utilizza il psoralene biotinilato in RNA in accoppiamento a base di collegamento in vivo in seguito alla legatura di prossimità e ad alta sequenza di throughput a Individuare i partner RNA base-pairing in tutto il genoma ( Figura 1 ) ¹⁵ .

In questo manoscritto descriviamo i passaggi per eseguire SPLASH utilizzando cellule aderenti colte, in questo caso le cellule HeLa. Lo stesso protocollo può essere facilmente adattato alle cellule di mammiferi di sospensione e alle cellule di lievito e batteri. In breve, le cellule HeLa vengono trattate con psoralene biotinilato e irradiati a 365 nm per incrociare in coppia le coppie di RNA interattive in vivo. I RNA vengono quindi estratti dalle cellule, frammentati e arricchiti per le regioni di reticolazione usando perline di streptavidina. I frammenti RNA interattivi vengono quindi legati insieme usando la legatura di prossimità e fatti in una libreria di cDNA per la sequenza profonda. Al sequenziamento, gli RNA chimerici vengono mappati sul transcriptome / genoma per identificare le regioni interagenti RNA che sono accoppiate tra loro. Abbiamo utilizzato con successo SPLASH per identificare migliaia di interazioni RNA in vivo in lieviti e diverse cellule umane, tra cui l'accoppiamento base di RNA intramolecolare e intermolecolare in diverse classi di RNA, come snoRNA, lncRNA e mRNA, per intravedere nell'organizzazione strutturale e nei modelli di interazione Di RNA nella cella.

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Protocollo

1. Trattamento delle cellule HeLa con estrazione di Psoralen e RNA biotinilata

1. Coltivano le cellule HeLa nel mezzo di Eagle di Dulbecco (DMEM) integrato con 10% di siero fetale fetale (FBS) e 1% di penicillina streptomicina (PS) in una piastra di 10 cm.
2. Lavare le cellule HeLa due volte con 5 ml di 1x PBS. Scaricare completamente il PBS dal piatto posando il piatto verticalmente per 1 minuto.
3. Aggiungere 1 ml di PBS contenente 200 μM di psoralene biotinilato e 0,01% w / v digitonin, alle cellule uniformemente e incubare a 37 ° C per 5 min. Mentre il psoralen biotinilato può entrare nella cella, la sua permeabilità è molto più alta quando le cellule sono esposte a basse quantità di digitonina (0,01%) per 5 min
4. Rimuovere il coperchio della piastra da 10 cm contenente le celle HeLa trattate e posizionare il piatto piatto su ghiaccio. Irradiare il piatto contenente le celle con UV 365 nm per 20 minuti su ghiaccio, a distanza di 3 cm dalle lampadine UV, utilizzando il reticolatore UV.
5. Isolare tOtal RNA dalle cellule HeLa mediante l'estrazione di guanidinium tiocianato-fenolo-cloroformio seguendo il protocollo del produttore. Aggiungere 1: 1 volume di isopropanolo per precipitare l'RNA a temperatura ambiente per 30 min.
   Punto di pausa: RNA può essere conservato a -20 ° C in isopropanolo a tempo indeterminato. Una macchia di punti può essere eseguita a questo punto per verificare che il psoralen biotinilato è entrato con successo nelle cellule e ha RNA reticolato in vivo ( Figura 2 ).
6. Centrifugare l'RNA precipitato a 20.000 xg per 30 minuti a 4 ° C per recuperare l'RNA. Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 ml di etanolo freddo al 70% al pellicola RNA per lavare l'RNA.
7. Centrifugare i campioni a 20.000 xg per 15 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e asciugare l'aria del pellet per 5 minuti a temperatura ambiente.
8. Aggiungere acqua nuclease libera al pellet RNA e quantificare la concentrazione di RNA utilizzando lo spettrometro UV.
   Punto di pausa: RNA può essere conservato a -80 ° C dopo fCongelamento a coclea in azoto liquido.

2. Frammentazione di RNA

1. Preriscaldare 15 μL di tampone di frammentazione 2x RNA e 10 μL campione RNA (1 μg / μL) singolarmente in 0,2 mL di tubi PCR, a 95 ° C per 1 min. Mescolare 10 μL del tampone di frammentazione 2x RNA riscaldato con un campione di RNA da 10 μL pipettando verso l'alto e verso il basso. Incubare il campione a 95 ° C per 5 min. Interrompere la reazione facendo raffreddare la reazione sul ghiaccio.
2. Trasferire e raggruppare le 2 reazioni di frammentazione in un tubo microfuge da 1,5 ml. Aggiungere alla soluzione 40 μL di acqua libera da nucleasi alla reazione, 10 μl di 3 M acetato di sodio, 1 μl di glicogeno e 300 μl di etanolo al 100% alla reazione di frammentazione. Incubare l'RNA a -20 ° C per almeno 1 h per precipitare l'RNA.
3. Centrifugare l'RNA precipitato a 20.000 xg per 30 minuti, rimuovere il surnatante e lavare l'RNA utilizzando 1 mL di etanolo al 70%.
4. Centrifugare l'RNA a 20.000 xg per 15 minuti, remOve il surnatante e sciogliere l'RNA in 20 μl di acqua libera da nucleasi.

3. Selezione e eluizione di dimensioni RNA

1. Aggiungere 20 μL di colorante di carica RNA al RNA recuperato nel tubo microfuge. Riscaldare l'RNA con il colorante di carica RNA a 95 ° C per 3 minuti e metterlo su ghiaccio per 2 min.
2. Aggiungere 3 μL di colorante di carica RNA a 0,25 μL di scala del DNA da 10 nt in un tubo a microfuga. Scaldare la scaletta a 95 ° C per 3 minuti e metterlo su ghiaccio per 2 min.
3. Caricare la scala denaturata e campioni su un gel di urea di TBE da 8,6 cm x 6,8 cm 6% e frazionare la dimensione con elettroforesi per 40 minuti a 180 V. Venga gelato il gel in 10 ml di tampone TBE contenente 1: 10.000 di macchie di gel di acido nucleico per 5 Min al buio.
4. Puntare un tubo microfugo da 0,6 ml pulito in fondo usando un ago da 24 G e inserirlo in un tubo microfugo da 2 ml.
5. Visualizzare le bande sul gel post-macchiato utilizzando un transilluminatore e tagliare una fetta di gel corrispondente a 90-110 nt. Trasferire la fetta di gel nel tubo microfuge da 0.6 ml forato nel tubo microfuge da 2 mL. La selezione di questa dimensione viene eseguita per consentire ai frammenti chimerici di avere una lunghezza minima per mappare il trascrittomato e di distinguere i prodotti legati alla prossimità rispetto ai prodotti non lucrati nei passaggi di selezione a valle.
6. Centrifugare le fettine di gel a 12.000 xg a temperatura ambiente per 2 minuti per strappare la fetta di gel e raccogliere nel tubo microfuge da 2 mL. Scartare il tubo vuoto da 0,6 ml di microfuge. Aggiungere 700 μl di tampone di eluizione alla fetta di gel triturata nel tubo microfuge da 2 mL e incubare a 4 ° C per una notte con rotazione costante, per consentire la diffusione dei campioni nel tampone.
7. Trasferire le fette di gel e il tampone di eluizione in un filtro a tubo di centrifuga e centrifugare a 20.000 xg per 2 min. Le fette del gel saranno intrappolate nel vano superiore del filtro. Scartare le fettine di gel e il vano superiore.
8. Aggiungere 1 μl di glicogeno e 700 μl di 100% isopropanolo al filtrato nel tubo microfugo e precipitare l'RNA a -20 ° C per almeno 1 h o durante la notte.
   Punto di pausa: RNA può essere precipitato in isopropanolo indefinitamente a -20 ° C.
9. Centrifugare l'RNA precipitato a 20.000 xg per 30 minuti a 4 ° C per recuperare l'RNA. Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 ml di etanolo a freddo del 70% per lavare il pellet RNA. Centrifugare il pellet lavato a 20.000 xg per 15 minuti a 4 ° C.
10. Rimuovere il tampone di lavaggio e aggiungere 20 μL di acqua libera da nucleasi per risospendere l'RNA. Quantitate la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrometro UV.
    Punto di pausa: L'RNA può essere conservato a -80 ° C dopo il congelamento in azoto liquido.

4. Arricchimento delle regioni di RNA Crosslinking

1. Vortex streptavidina ha rivestito ampiamente i branelli magnetici per riposizionare le perle in modo omogeneo nel tubo. Trasferire 100 μL di branelli in un tubo da 1,5 ml di microfuge e metterlo su un magneteIc per 1 min per consentire alle perle di attaccarsi al lato magnetico del tubo. Rimuovere attentamente il tampone di memorizzazione dalle perle e togliere il tubo dal supporto del magnete.
2. Aggiungere 1 mL di lysis buffer alle perle nel tubo microfuge e pipettare verso l'alto e verso il basso. Mettere le perline contenenti microfuge sul supporto magnetico per 1 min per separare le perle dal tampone di lavaggio. Ripetere questo per un totale di 3 lavaggi.
3. Rimuovere il tampone di lavaggio dalle perle, posizionando i fori contenenti microfuge sul supporto magnetico per 1 minuto. Aggiungere l'inibitore della RNasi (1: 200) al tampone di lisi e aggiungere 100 μl di tampone di lisi ai branchi lavati nel tubo microfuge.
4. Aggiungere 2 mL di bucido di ibridazione preparato di fresco, 1 mL di tampone di lisi addizionato, 1,5 μg di RNA frazionato di dimensioni e 100 μl di brani resuspendati in un tubo centrifugo conico da 15 mL. Vortex del tubo delicatamente.
5. Incubare il tubo centrifugo conica da 15 ml a 37 ° C per 30 min con rotazione fine a fine.Preriscaldare il tampone di lavaggio a 37 ° C.
6. Posizionare i tubi centrifugati conici da 15 ml su un supporto magnetico per 15 ml di tubi per 2 minuti per separare le sfere dal tampone. Pipettare con cura il tampone dal tubo e scartarlo.
7. Aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio pre-riscaldato alle perle, pipettare verso l'alto e verso il basso e trasferire le perle in un tubo da 1,5 ml di microfuge. Incubare alle perline a 37 ° C per 5 minuti, con rotazione fine a fine.
8. Centrifugare brevemente il contenuto del tubo microfugo. Posizionare le perline lavate da 1,5 ml in tubi a microfuga su un supporto magnetico per tubi da 2 ml per 1 min, per separare le perle dal tampone di lavaggio. Rimuovere il tampone dalle perle pipettando delicatamente il tampone dal tubo microfugo.
9. Aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio pre-riscaldato alle perle e pipetta su e giù per ripetere il lavaggio. Eseguire un totale di 5 lavaggi. Alla fine del lavaggio del 5 ^° , rimuovere il tampone di lavaggio posizionando i fori contenenti microfuge sul supporto magnetico1 minuto.

5. Ligation di prossimità

1. Aggiungere 1 mL di tampone polinucleotide chinasi T4 a freddo (PNK) ai branchi lavati e incubare le perline per 5 minuti a 4 ° C, con rotazione fine a fine. Posizionare il tubo microfugo contenente le perle sulla striscia magnetica per un minuto e rimuovere delicatamente il buffer T4 PNK. Ripetere questo passaggio per un totale di 2 lavaggi e rimuovere il buffer PN4 T4 dopo l'ultimo lavaggio.
2. Aggiungere i tamponi alle perle, secondo la tabella 1 . Per consentire che le estremità 3 'del frammento RNA siano legate a 3' adattatori di seguito, incubare le perle nel tampone a 37 ° C per 4 ore con agitazione costante per convertire il gruppo fosfato ciclico 3 'alla fine dell'RNA a 3 'OH.
3. Aggiungere i buffers alla reazione precedente, secondo la tabella 2 . Per consentire l'5 'estremità dei frammenti RNA per essere competente, incubare la reazione a 37 ° C per 1 h con agitazione costante in presenza di ATP, Per convertire 5 'OH sul RNA a 5' fosfato.
4. Aggiungere la tampone alla reazione precedente per eseguire la legatura di prossimità, secondo la tabella 3 . Incubare la reazione a 16 ° C per 16 h, con agitazione costante,
5. Posizionare il microfuge contenente l'RNA ligato su un supporto magnetico per 1 minuto. Rimuovere con cura il surnatante e aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio a temperatura ambiente ai talloni. Riposizionare pipettando verso l'alto e verso il basso.
6. Posizionare il tubo del microfugo sul supporto magnetico per 1 min e rimuovere attentamente il tampone di lavaggio. Eseguire un totale di 2 lavaggi e rimuovere il tampone di lavaggio dalle perle alla fine del secondo lavaggio.
7. Aggiungere 100 μL di RNA PK Buffer alle perle e riposare pipettando verso l'alto e verso il basso. Riscaldare i campioni a 95 ° C per 10 minuti su un blocco termico.
8. Far raffreddare il campione in ghiaccio per 1 min e aggiungere 500 μL di tiocianato-fenolo-cloroformio guanidino al campione. Mescolare vorticando vigorosamente per 10 s. Incubare il miscuglioA temperatura ambiente per 10 min.
   Punto di pausa: RNA può essere immagazzinato in tiocianato-fenolo-cloroformio di guanidina a -80 ° C per un paio di mesi.
9. Aggiungere 100 μl di cloroformio ai campioni estratti di guanidinium tiocianato-fenolo-cloroformio. Vortice vigorosamente per 10 s. Centrifugare i campioni a 20.000 xg per 15 minuti a 4 ° C.
10. Trasferire 400 μl dello strato acquoso in un nuovo tubo microfuge da 1,5 ml. Aggiungere 800 μL (2 volumi) di etanolo al 100% e mescolare pipettando verso l'alto e verso il basso.
11. Trasferire la soluzione RNA alle colonne di pulitura RNA e recuperare l'RNA seguendo le istruzioni del produttore, assicurando che anche i piccoli RNA siano mantenuti. Eluire l'RNA in 100 μl di acqua priva di nucleasi.
    Punto di pausa: L'RNA può essere conservato a -80 ° C dopo il congelamento in azoto liquido.

6. Reverse crosslinking di Psoralen biotinilato

1. Trasferire il 100 μL di campioni eluiti in un pozzetto di un pozzetto di 24 pozzmangiò. Rimuovere la copertura e irradiare il campione sotto UV 254 nm, per 5 minuti in ghiaccio.
2. Trasferire il campione reticolato retroscopico in un tubo microfugo pulito. Aggiungere 10 μl di acetato di sodio, 1 μl di glicogeno e 300 μl di etanolo al 100% e precipitare l'RNA a -20 ° C per almeno 1 h o durante la notte.
   Punto di pausa: RNA può essere precipitato in etanolo a tempo indeterminato a -20 ° C.
3. Centrifugare l'RNA precipitato a 20.000 xg per 30 minuti a 4 ° C per recuperare l'RNA. Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 ml di etanolo a freddo del 70% per lavare il pellet RNA.
4. Centrifugare il pellet lavato a 20.000 xg per 15 minuti a 4 ° C. Rimuovere il tampone di lavaggio e aggiungere 4,25 μl di acqua libera da nucleasi per risospendere l'RNA. Trasferire l'RNA in un tubo PCR da 0,2 ml.
   Punto di pausa: L'RNA può essere conservato a -80 ° C dopo il congelamento in azoto liquido.

7. Trascrizione inversa e circolarizzazione cDNA

1. Aggiungere 0,75 μLDi RNA linker (0,5 μg / μL) al campione riutilizzato in tubo PCR e scaldare a 80 ° C per 90 s. Posizionare il campione in ghiaccio per 2 min.
2. Aggiungere i buffers al campione denaturato per la legatura adattatore 3 ', secondo la tabella 4 . Incubare la reazione a 25 ° C per 2,5 ore.
3. Trasferire la reazione a un tubo microfuge da 1,5 ml. Aggiungere la reazione a 90 μL di acqua libera da nucleasi, seguita da 10 μl di acetato di sodio, 1 μl di glicogeno e 300 μl di etanolo al 100%. Precipitare l'RNA a -20 ° C per almeno 1 h o durante la notte.
   Punto di pausa: RNA può essere precipitato in etanolo a tempo indeterminato a -20 ° C.
4. Centrifugare l'RNA precipitato a 20.000 xg per 30 minuti a 4 ° C per recuperare l'RNA. Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 ml di etanolo a freddo del 70% per lavare il pellet RNA.
5. Centrifugare il pellet lavato a 20.000 g per 15 minuti a 4 ° C. Rimuovere il tampone di lavaggio risospendere il pellet in 5 μL di nuclease free wAter.
6. Aggiungere 5 μL di colorante di carica RNA al RNA recuperato nel tubo microfuge. Riscaldare l'RNA con il colorante di carica RNA a 95 ° C per 3 minuti e metterlo su ghiaccio per 2 min.
7. Aggiungere 3 μL di colorante di carica RNA a 0,25 μL di scala del DNA da 10 nt in un tubo a microfuga. Scaldare la scaletta a 95 ° C per 3 minuti e metterlo su ghiaccio per 2 min.
8. Eseguire la frazionamento di dimensione usando 8,6 cm x 6,8 cm 6% TBE gel urea come nei passaggi 3.3 e 3.4.
9. Visualizzare il gel macchiato con macchia di acido nucleico utilizzando il transilluminatore e tagliare una fetta di gel corrispondente a 110-140 nt sulla scala. Trasferire la fetta di gel nel tubo microfuge da 0.6 ml perforato nel tubo microfuge da 2 ml e seguire il protocollo dai passaggi 3.6- 3.9.
10. Aggiungere 5 μl di acqua libera da nucleasi per risospendere il pellet RNA. Trasferire l'RNA in un tubo PCR da 0,2 ml.
    Punto di pausa: L'RNA può essere conservato a -80 ° C dopo il congelamento in azoto liquido.
11. Aggiungere 1 μl di primer RT a 1,2581; M all'RNA nel tubo PCR e scaldare a 80 ° C per 2 min. Posizionare il campione in ghiaccio per 2 min.
12. Aggiungere i buffer per la trascrizione inversa secondo la tabella 5 . Incubare la reazione a 50 ° C per 30 min.
13. Aggiungere 1,1 μL di 1 N NaOH alla reazione e scaldare a 98 ° C per 20 minuti. Mettere la reazione sul ghiaccio.
14. Trasferire la reazione a un tubo microfuge da 1,5 ml. Aggiungere la reazione a 90 μL di acqua libera da nucleasi, seguita da 10 μl di acetato di sodio, 1 μl di glicogeno e 300 μl di etanolo al 100%. Precipitare il DNA a -20 ° C per almeno 1 h o durante la notte.
    Punto di pausa: il DNA può essere precipitato in etanolo a tempo indeterminato a -20 ° C.
15. Centrifugare il DNA precipitato a 20.000 g per 30 minuti a 4 ° C per recuperare il DNA. Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 ml di etanolo a freddo del 70% per lavare il pellet di DNA. Centrifugare il pellet lavato a 20.000 xg per 15 minuti a 4 ° C. Rimuovere il tampone di lavaggio riposizionare la pellicolaLasciare in 5 μL di acqua libera da nucleasi.
16. Eseguire la frazionamento di dimensione usando 8,6 cm x 6,8 cm 6% TBE gel urea come nei passaggi 3.3 e 3.4.
17. Visualizzare il gel post-macchiato utilizzando il transilluminatore e tagliare una fetta di gel corrispondente a 200-240 nt sulla scala. Il cDNA trascritto trasversale è ora 96 ​​basi più lungo del frammento RNA a causa dell'aggiunta del primer di 96 basi RT. Trasferire la fetta di gel nel tubo microfuge da 0.6 ml forato nel tubo microfuge da 2 mL.
18. Centrifugare le fettine di gel a 12.000 xg a temperatura ambiente per 2 minuti per strappare la fetta di gel e raccogliere nel tubo microfuge da 2 mL. Scartare il tubo vuoto da 0,6 ml di microfuge.
19. Aggiungere 700 μl di tampone di eluizione alla fetta di gel triturata nel tubo microfuge da 2 mL e incubare a 37 ° C per 2 ore con rotazione costante. Seguire il protocollo come descritto nei passaggi 3.7-3.8.
20. Aggiungere 6 μl di acqua libera da nucleasi per risospendere il pellet di DNA. Trasferire il DNA in un tubo PCR da 0,2 ml.
    Punto di pausa: il DNA può essere conservato a -80 ° C dopo il congelamento in azoto liquido.
21. Aggiungere i buffers alla reazione per la circularizzazione del cDNA, secondo la tabella 6 . Incubare la reazione a 60 ° C per 1 h e scaldare a 80 ° C per 10 minuti per inattivare la reazione.
22. Trasferire la reazione a un tubo microfuge da 1,5 ml. Purificare il cDNA circolare utilizzando una colonna di pulizia del DNA seguendo le istruzioni del produttore. Aggiungere 20 μL di acqua nulcile libera alla colonna per eluire il cDNA purificato.
    Punto di pausa: il DNA può essere conservato a -20 ° C per un paio di mesi.

8. Amplificazione PCR (PCR a piccola scala)

1. Aggiungere i buffer alla reazione secondo la tabella 7 per l'amplificazione PCR per testare il numero minimo di cicli necessari per l'amplificazione della biblioteca.
2. Impostare le condizioni di ciclo di PCR secondo la tabella 8 . Sospendere la reazione e trasferire 5 μL diLa reazione PCR a 10, 15 e 20 cicli, in tubi separati da 1,5 ml di microfuge.
3. Aggiungere 1 μL di colorante carica gel a DNA da 6x a ciascuna delle 5 μl di reazione PCR nei vari cicli. Eseguire l'elettroforesi gel su un gel agarosio del 3% a 120 V per 1 h per visualizzare i prodotti PCR.
   1. Utilizzare il numero più basso di cicli PCR (Y) che mostrano l'amplificazione a circa 250 basi (nella figura 3 vi è una banda forte a 15 cicli di amplificazione e una debole banda a 10 cicli. Generare abbastanza materiale per la sequenza profonda in quanto la quantità di cDNA utilizzata è di 10 volte quella di amplificazione PCR a piccola scala).

9. Amplificazione PCR (Large Scale PCR) e Purificazione

1. Aggiungere i buffers alla reazione secondo la tabella 9 per l'amplificazione PCR per PCR di grandi dimensioni.
2. Impostare le condizioni di ciclo di PCR in base aTabella 10 .
3. Aggiungere 5 μl di colorante carica gel del DNA da 6x alla 25 μL di reazione PCR e caricare in un pozzetto di un gel agaroso del 3%. Caricare una scala del DNA di 1 kb più in un pozzetto separato. Eseguire l'elettroforesi a gel a 100 V, per 1,5 h.
4. Visualizzare il gel completo con un transilluminatore UV.
5. Dimensione estrarre una fetta di gel contenente prodotti PCR da 200- 300 basi e trasferire il gel in un tubo microfugo pulito da 2 ml.
6. Aggiungere 1 ml di tampone di solubilità gel, da un kit di estrazione del gel di DNA, alla fetta di gel e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti, o fino a quando il gel si dissolve, con agitazione costante.
7. Aggiungere 200 μL di isopropanolo al gel dissolto e mescolare bene pipettando. Trasferire 700 μl del campione in una colonna di pulizia di estrazione del gel di DNA e centrifugare a 13.000 xg per 30 s. Tenere il trasferimento del campione disciolto alla colonna finché tutto il campione è stato caricato sulla colonna.
8. Aggiungere 500 μL di tampone di solubilità in gel,Seguita da 700 μL di tampone di lavaggio in colonna, alla colonna, secondo il protocollo del produttore. Aggiungere 12 μL di acqua priva di nucleasi al centro della colonna per eludere il DNA. Punto di pausa: il DNA può essere conservato a -20 ° C.
9. Quantitate la concentrazione del DNA usando la quantificazione fluorometrica. Se vengono create molteplici librerie e raggruppate insieme per il sequenziamento, aggiungere una quantità uguale di ciascun campione alla piscina, per la sequenza di rendimenti elevata.

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Risultati

La figura 1 rappresenta lo schema del flusso di lavoro SPLASH. Dopo l'aggiunta di psoralene biotinilato in presenza di 0,01% di digitonina e di reticolazione UV, viene estratto un totale di RNA dalle cellule e viene eseguita una macchia di punti per assicurare che il collegamento a biotinilato con l'RNA sia accaduto in modo efficace ( Figura 2 ). Utilizziamo oligosini biotinilati 20 come controlli positivi per titolare l...

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Discussione

Qui descriviamo in dettaglio il flusso di lavoro sperimentale e computazionale per SPLASH, un metodo che ci permette di identificare le interazioni RNA a due mani in modo genico-wide. Abbiamo utilizzato con successo SPLASH nelle colture batteriche, lieviti e umane e anticipo che la strategia possa essere ampiamente applicata a organismi diversi in diversi stati cellulari. Uno dei passaggi critici del protocollo è quello di iniziare con almeno 20 μg di RNA reticolato per avere materiale adeguato per i processi a valle....

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb Plus DNA Ladder	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10787026	DNA ladder
10 bp DNA ladder	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10821-015	DNA ladder
20% SDS solution	First BASE	BUF-2052-1L
20x SSC	First BASE	BUF-3050-20X1L
3.0 M Sodium Acetate Solution	First BASE	BUF-1151-1L-pH5.2	Required for nucleic acid precipitation
40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1	Bio-Rad	1610145	TBE Urea gel component
Ambion Buffer Kit	Life Technologies Holdings Pte Ltd	AM9010
Ammonium Persulfate, Molecular Grade	Promega	V3131	TBE Urea gel component
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	B0126-25G
Chloroform	Merck	1.02445.1000	RNA extraction
Single strand DNA ligase	Epicentre	CL9025K	CircLigase II ssDNA Ligase
Centrifuge tube filters	Sigma-Aldrich	CLS8160-96EA	Costar Spin-X centrifuge tube filters
D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE	Sigma-Aldrich	D5628-1G	For cell treatment
Dark Reader Transilluminator	Clare Chemical Research	Dark Reader DR89X Transilluminator	Blue light transilluminator
DNA Gel Loading Dye (6x)	Life Technologies Holdings Pte Ltd	R0611	Required for agarose gel electroporation
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Pan BioTech	P04-03500	For Hela cell culture
Streptavidin magnetic beads	Life Technologies Holdings Pte Ltd	65002	Dynabeads MyOne Streptavidin C1
Magnetic stand for 15 mL tubes	Life Technologies Holdings Pte Ltd	12301D	DynaMag-15
Magnetic stand for 15 mL tubes	Life Technologies Holdings Pte Ltd	12321D	DynaMag-2
ThermoMixer	Eppendorf	5382 000.015	Eppendorf ThermoMixer C
Biotinylated psoralen	Life Technologies Holdings Pte Ltd	29986	EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin
F8T5/BL	Hitachi	F8T5/BL	365 nm UV bulb
Fetal Bovine Serum	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10270106	Components of Hela medium
Formamide	Promega	H5052	Component in hybridization buffer
G8T5	Sankyo-Denki	G8T5	254 nm UV bulb
Glycogen	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10814010	Required for nucleic acid precipitation
Nanodrop	Life Technologies Holdings Pte Ltd	Nanodrop 2000	Spectrophotometer for nucleic acidquantification
Nuclease free water	First BASE	BUF-1180-500ml
Penicillin Streptomycin	Life Technologies Holdings Pte Ltd	15140122	Components of Hela medium
High-Fidelity DNA polymerase (2x)	Life Technologies Holdings Pte Ltd	F531L	Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (2x)
Primers Set 1	New England Biolabs	E7335L	PCR primers
DNA Gel Extraction Kit	QIAgen	28106	QIAquick Gel Extraction Kit
Fluorometric Quantification kit	Life Technologies Holdings Pte Ltd	Q32854	Qubit dsDNA HS Assay Kit
RNA clean up kit	Qiagen	74106	RNeasy Mini Kit Silica-membrane column
Rnase Inhibitor	Life Technologies Holdings Pte Ltd	AM2696	SUPERase In
Reverse transcriptase	Life Technologies Holdings Pte Ltd	18080400	SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix
Nucleic Acid Gel Stain	Life Technologies Holdings Pte Ltd	S11494	SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL
T4 Polynucleotide Kinase	New England Biolabs	M0201L	End repair enzyme
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs	M0204L	Enzyme for proximity ligation
T4 RNA Ligase 2, truncated KQ	New England Biolabs	M0373L	Enzyme for adaptor ligation
Temed	Bio-Rad	1610801	TBE Urea gel component
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform	Life Technologies Holdings Pte Ltd	15596018	TRIzol® Reagent for RNA extraction
Urea	First BASE	BIO-2070-5kg
UV crosslinker	Stratagene	400072	UV Stratalinker 1800
UV Transilluminator	UVP	95-0417-01	For visualizing of bands
Xylene Cyanol FF	Sigma-Aldrich	X4126-10G
DNA cleanup it	Zymo Research	D4004	Zymo DNA concentrator-5
List of software required
FastQC software	0.11.4	http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
SeqPrep software	1.0.7	https://github.com/jstjohn/SeqPrep
BWA software	0.7.12	http://bio-bwa.sourceforge.net/
SAMTOOLS software	1.2.1	http://www.htslib.org/
PULLSEQ software	1.0.2	https://github.com/bcthomas/pullseq
STAR software	2.5.0c	https://github.com/alexdobin/STAR
rem_dups.py PYTHON script	PYTHON 2.7.11	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
find_chimeras.py PYTHON script	PYTHON 2.7.11	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
pickJunctionReads.awk AWK script	AWK GNU 4.1.2	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
Buffer composition
Elution buffer
0.3 M sodium acetate
Lysis Buffer
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer
100 mM NaCl
10 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
0.5% SDS
Hybridization Buffer
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4 °C)
Always add Superase-in fresh before use
2x SSC Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
2x RNA fragmentation buffer
18 mM MgCl2
450 mM KCl
300 mM Tris-Cl pH 8.3
2x RNA loading Dye
95% Formamide
0.02% SDS
0.02% bromophenol blue
0.01% Xylene Cyanol
1 mM EDTA
3' RNA adapter sequence: 5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC
RT primer sequence: AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG