Préservation des nerfs Obstruction à mi-urétrale (NEMO) chez les femelles petits rongeurs

Résumé

modélisation classique de l'obstruction partielle de la vessie chez les rongeurs se heurte à la mortalité des animaux. Une blessure à la dénervation de dissection autour de l'urètre proximale et col de la vessie est également une préoccupation majeure. Nous avons développé et évalué un modèle d'obstruction à mi-urétrale sûre et fiable, en évitant les lacunes du modèle traditionnel.

Résumé

obstruction partielle de sortie de la vessie (pBOO) a une prévalence élevée, provoque la charge des patients importants et des coûts énormes de soins de santé. Le modèle animal le plus commun pour étudier le remodelage de la vessie chez les rongeurs femelles pBOO sont soumis à une obstruction partielle à l'urètre proximal. Variabilité dans le degré d'obstruction et de la mortalité des animaux sont des préoccupations majeures avec obstruction proximale. En outre, la dissection autour du col de la vessie et l'urètre proximal met en danger l'innervation de la vessie.

Nous avons développé un modèle avec préservation nerveuse obstruction à mi-urétrale (NEMO) pour pBOO éviter les inconvénients du modèle traditionnel. Nous avons approché l'urètre juste inférieur à la symphyse pubienne, ce qui rend inutile pour laparotomie, ainsi que pour la dissection dans ce domaine; En outre, le sphincter urétral striée est restée intacte. Nous avons effectué NEMO chez des rats Sprague-Dawley femelles (12 obstructions, 6 animaux fictifs), ainsi que chez les souris C57 / BL6 femelles (20 obstructions, 18 animaux sham). Au bout de deux semaines, nous avons évalué la fonction de la vessie, de la masse de la vessie, et la masse corporelle.

Nous avons eu aucune mortalité chez les rats femelles obstructed- ou une opération fictive; comme décrit pour la partie proximale traditionnelle pBOO-méthode, on a attaché le fil de suture autour de l'urètre proximal et placé temporairement tige métallique de 0,9 mm. NEMO induit une masse de la vessie en augmentation de 85% au bout de deux semaines, le volume d'urine résiduelle moyenne est de 0,4 mL chez le rat partiellement obstrués tandis que seulement 0,03 mL chez les animaux fictifs. Chez les souris, nous avons testé 3 tailles de canules que nous avons placé le long de l'urètre lors de l'amarrage de la suture. Nous avons constaté que l'aide d'une canule de calibre 27 a donné lieu à plus de 50% la mortalité des animaux; placer la canule de calibre 25 n'a donné la réponse souhaitée en augmentant la masse de la vessie; en utilisant une canule de calibre 26 a donné des résultats favorables avec la mortalité animale minimale (08/01) encore une importante augmentation de 2 fois la masse de la vessie.

Introduction

Obstruction partielle de sortie de la vessie (pBOO) a une prévalence élevée et peut conduire à un dysfonctionnement de la vessie sévère ^1; le spectre va de malformations congénitales telles que des valves de l'urètre postérieur ou hypospadias, plus de rétrécissement de l'urètre acquises à l'hyperplasie bénigne de la prostate. Celle - ci touche plus de 30% des hommes de soixante ans et plus ^2. Grande charge des patients et des coûts énormes de soins de santé associés à pBOO justifient l'effort de recherche considérable mis en étudier le remodelage de la vessie en réponse à la résistance à l'écoulement accrue ^3. De 2006 à 2015, plus de 220 PubMed indexé articles ont été publiés sur l'effet de pBOO sur la vessie.

Bien que les modèles animaux pour pBOO ont été mis au point dans plusieurs espèces ^4, comme le rat ^5, le lapin ^6, porc ^7, et des protocoles d' ententee ^{8, 9,} sans doute le modèle animal le plus couramment utilisés sont des rats femelles subissant toutefois une obstruction partielle de l'urètre proximal; l'accès à l'abdomen des animaux, extériorisant de la vessie, et la dissection autour du col de la vessie sont inévitables avec cette technique d'obstruction urétrale traditionnelle proximale. Variabilité dans le degré d'obstruction et de la mortalité des animaux ne sont quelques - unes des préoccupations liées à cette procédure ^{10, 11;} nous avons montré que dans les animaux opérés de manière fictive, dissection autour de l'urètre proximal entraîne des changements physiologiques qui sont en corrélation avec une perte de fibres nerveuses au niveau du col de la vessie ^12. Ce résultat indique que le plus couramment utilisé modèle animal pBOO, qui consiste à accéder à l'urètre proximal chez les rongeurs femelles, conduit à une lésion de la dénervation avec des changements structurels et fonctionnels associés de la vessie, affectanttrompe-l'œil et les animaux obstruées. Par conséquent, une approche alternative en évitant les blessures de dénervation était nécessaire. Notre laboratoire a développé et évalué un nerf épargnant Obstruction mi-urétrale (NEMO) approche, efficace pour induire des changements associés d'obstruction prévu dans la vessie tels que l'augmentation de la masse d'organes et de l'urine résiduelle, tandis que les animaux opérés de manière fictive étaient impossibles à distinguer des animaux témoins non opérés . En outre, le sphincter strié de l'urètre est resté intact car il se trouve à proximité du niveau de dissection. En outre, la variabilité augmentation induite par l'obstruction de la masse de la vessie était significativement plus faible que dans l'obstruction urétrale traditionnelle proximale et la mortalité des animaux a été nulle.

Nous avons également appliqué avec succès NEMO chez les souris femelles avec moins de 10% de mortalité chez les animaux obstruées, alors que tous les modèles pBOO pour les souris décrites à ce jour ont été associées à une mortalité d'environ 50%. L'étude de remodelage de la vessie dans le contexte de pBOO chez la souris bénéficiera de APPLICABILlité de l'ensemble du spectre des modifications transgéniques.

Dissection autour du milieu de l'urètre chez les rongeurs femelles ne provoque pas les modifications structurelles ou fonctionnelles indésirables et de confusion dans la vessie urinaire observée dans le modèle d'obstruction proximale traditionnelle. Néanmoins, l'induction d'une obstruction partielle au niveau de la mi-urétrale provoque encore l'hypertrophie de la vessie et l'urine résiduelle a augmenté, comme prévu à partir d'un modèle animal pour pBOO. Fait important, l'exécution NEMO chez la souris ouvre une enquête de remodelage de la vessie dans pBOO des procédés transgéniques, qui sont pratiquement indisponible chez les rongeurs plus grandes.

Protocole

Le protocole expérimental suivant a été approuvé par le comité de protection des animaux de l'institution.

1. NEMO chez les rats femelles

1. Préparation
   1. Placer un rat Sprague-Dawley femelles pesant environ 200 g sous anesthésie à 3% d'isoflurane, peser l'animal, et se raser et désinfecter la zone prépubienne 3 fois en utilisant un lavage chirurgical iode.
   2. Sur un coussin chauffant, les membres postérieurs de bande et la queue vers le bas et cathétériser la vessie avec un angiocathéter de calibre 20, qui est également enregistré doucement vers le bas pour empêcher le glissement.
2. Dissection
   1. Utilisez un scalpel pour réaliser à partir de la symphyse pubienne palpable vers le méat urétral une incision longitudinale de la peau de 8 mm. Soulevez la peau de chaque côté pour faciliter la fermeture des plaies plus tard.
   2. On dissèque brusquement pour identifier l'urètre stent par étalement longitudinal avec des ciseaux fins. Placez des crochets fines de la peau autostatiques pour améliorer l'expositionde l'urètre.
   3. Effectuer une certaine douceur d'étalement longitudinal en utilisant des ciseaux courbes dorsale de l'urètre pour développer le plan entre l'urètre et du vagin. Ensuite, passer carrément une suture de soie 4-0 derrière l'urètre et de préparer la double jet de noeud d'un chirurgien.
3. Obstruction urétrale partielle
   1. Retirer le angiocathéter, placer une tige parallèle de métal de 0,9 mm à l'urètre, puis serrer le noeud autour de la tige de l'urètre et de métal, de sorte que ce dernier glisse encore facilement par la suite.
   2. Fixer le noeud avec 3 lancers plus douce en utilisant la tension avant de retirer la tige. Couper le fil de suture se termine environ 3 mm de long, ou 4 mm en cas de rejet par la suite de l'obstruction fait partie de l'expérience.
4. fermeture de la plaie
   1. Approximer les glandes para-urétrales en utilisant un seul point de suture enterré tressée résorbable 4-0.
   2. Fermez la peau avec un point de matelas horizontal enterré en utilisant le même absorbable SUTure. Note: Bien qu'il puisse sembler non conventionnelle d'utiliser un fil résorbable pour un point-pénétrant la peau, nous ne avons rencontré des complications telles que les infections de plaies, et que le retrait de suture peut être évité.
5. après les soins
   1. Injecter buprénorphine 0,1 mg / kg sous-cutanée avant de placer le rat dans une cage de récupération.
   2. Offrir une alimentation de récupération douce pour les premières 24 h au seul rat Abrité. Après cette période, les animaux domestiques à nouveau dans les mêmes paires que avant la procédure à condition qu'ils se portent bien et appartiennent au même groupe de traitement.
   3. Vérifiez les rats quotidiens pour la taille de la vessie et le bien-être général; enregistrer leur poids au moins chaque semaine.

2. NEMO chez les souris femelles

1. Préparation
   1. Placer une souris femelle C57BL / 6 pesant environ 18 g, puis procéder comme détaillé dans l'étape 1.1.1.
   2. Procédez comme détaillé à l'étape 1.1.2, à l'exception d'utiliser un ang calibre 24iocatheter.
2. Dissection
   1. Utilisez un scalpel pour réaliser une incision longitudinale de la peau de 6 mm à partir de la symphyse pubienne palpable vers le méat urétral.
   2. On dissèque brusquement pour identifier l'urètre stent par étalement longitudinal avec des ciseaux fins. Soulever le faisceau neuro-vasculaire en cours d'exécution sur l'urètre ventralement par dissection mousse analogue.
   3. Effectuer une certaine douceur d'étalement longitudinal en utilisant des ciseaux courbes dorsale de l'urètre pour développer le plan entre l'urètre et du vagin. Ensuite, passer carrément une suture tressée non résorbable 5-0 derrière l'urètre et de préparer la double jet de noeud d'un chirurgien.
3. Obstruction urétrale partielle
   1. Connecter le angiocathéter avec une seringue de 1 mL et l'injection de 0,1 ml de solution saline normale dans la vessie.
   2. Placer une canule de calibre 26 parallèle à l'urètre. Serrer doucement le nœud autour de l'urètre et de la canule tout en tirant le angiocae.
   3. Fixer le noeud avec 3 lancers plus douce en utilisant la tension avant de retirer la canule.
   4. Test de l'urine apparaissant au méat sur une légère pression sur la vessie de l'animal; desserrer le lien si incapable d'exprimer l'urine. Dans le cas contraire, couper la suture se termine environ 3 mm de long.
4. fermeture de la plaie
   1. Fermez la peau avec un point de matelas horizontal enterré à l'aide d'une suture absorbable tressé 5-0.
5. après les soins
   1. Injecter 0,1 mg / kg de buprénorphine sous-cutanée avant de placer la souris dans une cage de récupération.
   2. Offrir une alimentation de récupération souple pour les premières 48 h à la seule souris Abrité. Après cette période, les animaux domestiques à nouveau dans les mêmes groupes que avant la procédure à condition qu'ils se portent bien et appartiennent au même groupe de traitement.
      REMARQUE: Les souris avec une vessie distendue palpable 24 h après la procédure qui ne supprime pas lorsqu'ils sont manipulés sont sur-obstruée et meurent dans le nposte 1 - 2 jours à moins que repris sous anesthésie pour le retrait du ligatures obstruant.
   3. Vérifier les souris quotidiennement pour la taille de la vessie et le bien-être général; enregistrer leur poids au moins chaque semaine.

Résultats

Préservation des nerfs Obstruction à mi-urétrale (NEMO) chez les rats femelles

Mortalité

Nous avons effectué une obstruction mi-urétrale sur plus de 40 rats femelles jusqu'à présent et n'a pas de mortalités.

Masse de la vessie

Discussion

La mortalité des animaux est l' une des principales préoccupations du modèle traditionnel de pBOO à l'urètre proximale, à 15% ou plus dans de nombreux rapports ^{10, 11, 13.} NEMO semble avoir un minimum de mortalité lorsqu'elle est appliquée chez les rats femelles. obstruction de l'urètre proximal chez la souris est techniquement plus difficile que chez les rats et donc encore plus sujett...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Female rat	Charles-River Canada	Sprague Dawley Rat (Crl:SD); Strain Code: 400	about 200 g
Isoflorane vaporizer	Benson medical industries inc.	TEC III Isoflurane; product code: 53-T3ISO
Isoflorane	Fresenius Kabi Animal Health	Isoflorane; product code CP0406V2	250 mL bottle
Disposable scalpel	Ted Pella, Inc.	#15 Sterile, Stainless Steel Scalpels; catalogue number 549-9-15S
Microscopy forceps	Ted Pella, Inc.	Aesculap Microscopy Forceps, Finepoint, 115mm; product number 5443
Adson forceps	Ted Pella, Inc.	Aesculap Adson Dissection Forceps, Curved, 120mm; product number 5002-9
Curved surgical scissors	Ted Pella, Inc.	Surgical Scissors, Curved, S/S, 105mm; catalogue number 1376
0.9 mm inox metal rod	goodfellow.com	Stainless Steel - AISI 316L Wire Diameter:0.9mm; order code 911-684-65
Skin hooks - self made from inox steel	goodfellow.com	Stainless Steel - AISI 316L Wire Diameter:0.9mm; order code 911-684-65
4-0 Silk suture	esutures.com	4-0 Sofsilk black 98" strand; product number LS640
5-0 Vicry suture	esutures.com	5-0 Vicryl undyed 27" RB-1 taper; product number J213H
Needle holder	Medsupplier.com	Integra Miltex Carb-N-Sert Baumgartner Needle Holder - 5 1/2"; product code SKU NEE4484-8-40TC SKU NEE4484-8-40TC SKU NEE4484-8-40TC
Temgesic (Buprenorphine)	first veterinary supply	Buprenex 0.3MG/ml inj amps; item #075701
1 mL syringe with 27 G needle	Fisher Scientific	BD Tuberculin Syringe, BD 309623
20 G Angiocath	Fisher Scientific	Andwin Scientific ANGIOCATH 20 GA; Catalog No. NC9561906
Recovery diet	clearh2o	DietGel 31M; 72-08-5022
C57Bl/6 female mice	Charles-River Canada	C57BL/6 Mouse (C57BL/6NCrI); Strain Code: 027	about 18 g
24 G angiocath	Fisher Scientific	Hanna Pharmaceutical Supply Co., Inc. IV CATH ANGIOCATH 24GX3/4IN; Catalog No. NC9814340
5-0 Ethibond	esutures.com	5-0 Ethibond green 30" RB-1 taper; product number X550H
26 G syringe needle	Sigma-Aldrich	BD Precisionglide syringe needle, Gauge 26; z192392
Normal Saline	Baxter	0.9% Sodium Chloride Injection, USP, 100 mL MINI-BAG; product code 2B0043