Нервосберегающая Середина-уретральная обструкция (Nemo) у самок мелких грызунов

Резюме

Традиционное моделирование частичной обструкции выходного отверстия мочевого пузыря у грызунов чревато гибелью животных. Травма денервации от рассечения вокруг проксимальной уретры и шейки мочевого пузыря также вызывает серьезную обеспокоенность. Мы разработали и оценили безопасную и надежную модель обструкции середины уретры, избегая при этом недостатки традиционной модели.

Аннотация

Частичная обструкция инфравезикальной (pBOO) имеет высокую распространенность, вызывает значительное бремя для пациента, и огромные затраты на здравоохранение. Наиболее распространенная модель животных для изучения ремоделирования мочевого пузыря в pBOO являются женскими грызунами, подвергающихся частичной обструкцию у проксимального мочеиспускательного канала. Изменчивость степени обструкции и гибели животных являются основными проблемами с проксимальной обструкцией. Кроме того, рассечения вокруг проксимальной уретры и шейки мочевого пузыря ставит под угрозу иннервацию мочевого пузыря.

Мы разработали модель нервосберегающая середине уретры обструкции (Nemo) для pBOO избежать недостатков традиционной модели. Мы подошли к уретре только уступающую лобковому симфизу, что устранило необходимость в лапаротомию, а также для рассечения в этой области; Кроме того, поперечно-полосатый сфинктер уретры остался нетронутым. Мы провели NEMO у самок крыс линии Sprague-Dawley (12 препятствий, 6 фиктивных животных), а также у самок C57 / BL6 мышей (20 обструкциис, 18 фиктивных животных). Через две недели мы оценивали функцию мочевого пузыря, мочевой пузырь массу и массу тела.

У нас не было среди obstructed- смертности или ложнооперированными самок крыс; как описаны для традиционных проксимального pBOO-методы, мы связали шов вокруг проксимальной уретры и временно помещаются 0,9 мм металлического стержня. NEMO вызвало увеличение массы мочевого пузыря 85% после двух недель, средний остаточный объем мочи было 0,4 мл в частично закупоренных крысах в то время как только 0,03 мл в фиктивных животных. У мышей, мы тестировали 3 размеров канюль, что мы, расположенных вдоль уретры при перевязке шва. Мы обнаружили, что с использованием 27 калибра канюли в результате более чем на 50% смертности животных; помещая 25 калибра канюли не дают желаемого ответа в увеличении массы мочевого пузыря; с использованием 26 калибра канюли дали положительные результаты с минимальной гибелью животных (1/8) еще значительным увеличением в 2 раза в массах мочевого пузыря.

Введение

Частичная инфравезикальная обструкция (pBOO) имеет высокую распространенность и может привести к серьезной дисфункции мочевого пузыря ^1; спектр колеблется от врожденных пороков развития, таких как задней уретры клапаны или гипоспадии, более приобретенных стриктур уретры к доброкачественной гиперплазии предстательной железы. Последнее влияет на более чем 30% мужчин шестидесяти лет и старше ^2. Большое бремя пациента и огромные затраты на здравоохранение , связанные с pBOO гарантируют значительное исследовательское усилие , приложенное в изучении ремоделирования мочевого пузыря в ответ на сопротивление увеличились отток ^3. С 2006 до 2015 года, более 220 PubMed не индексируются были опубликованы статьи о влиянии pBOO на мочевой пузырь.

Хотя модели на животное для pBOO были разработаны в течение нескольких видов ^4, такие как крысы ^{5, 6} кролика, свиньи ^7, и Мышиныее ^{8, 9,} возможно, наиболее часто используемые модели на животных , однако являются самок крыс , перенесших частичную закупорку проксимальной уретры; Доступ к брюшной полости животных, экстериоризации мочевого пузыря, а также рассечение вокруг шейки мочевого пузыря неизбежны с этой традиционной проксимальной техникой уретральной обструкции. Изменчивость в степени обструкции и гибели животных являются лишь некоторые из проблем , связанных с этой процедурой ^{10, 11;} мы показали , что в ложнооперированных животных, рассечение вокруг проксимальной уретры приводит к физиологическим изменениям , которые коррелируют с потерей нервных волокон в шейке мочевого пузыря ^12. Этот вывод указывает на то, что наиболее часто используется модель животного pBOO, который включает в себя доступ к проксимальной уретры у самок грызунов, приводит к травмам денервации с соответствующими структурными и функциональными изменениями мочевого пузыря, воздействуяфиктивные и препятствовали животным. Поэтому необходим альтернативный подход избежать травм денервации. В нашей лаборатории разработана и оценен подход нервосберегающего Середина-уретральная обструкцию (НЕМО), эффективно в отношении индукции ожидаемых заградительных-ассоциированных изменений в мочевом пузыре, такие как увеличение массы органа и остаточной моче, в то время как ложно-оперированные животные были неотличимы от неоперированных контрольных животных , Кроме того, исчерчен сфинктер уретры остался нетронутым, как она лежит проксимально по отношению к уровню диссекции. Кроме того, изменчивость в увеличении обструкции-индуцированной массы мочевого пузыря была значительно ниже, чем в традиционных проксимальной уретры обструкции и животных смертность была равна нулю.

Мы также успешно применяется NEMO у самок мышей с менее чем 10% смертности в закупоренных животных, в то время как все модели pBOO для мышей, описанных к настоящему времени были связаны со смертностью около 50%. Изучение ремоделирования мочевого пузыря в контексте pBOO у мышей выиграют от applicabilность всего спектра трансгенных модификаций.

Анатомические вокруг середины уретры у самок грызунов не вызывают нежелательные и искажающие структурные или функциональные изменения в мочевом пузыре наблюдается в традиционной проксимальной модели обструкции. Тем не менее, вызывая частичную закупорку в середине уретры уровне все еще вызывает гипертрофию мочевого пузыря и увеличение остаточной мочи, как и ожидалось от животной модели pBOO. Важно отметить, что выполнение NEMO у мышей открывает исследование ремоделирования мочевого пузыря в pBOO к трансгенным методам, которые практически недоступны в более крупных грызунах.

протокол

Следующий экспериментальный протокол был одобрен комитетом по уходу за животными учреждения.

1. NEMO у самок крыс

1. подготовка
   1. Поместите женского пола Sprague-Dawley крыс весом примерно 200 г под 3% изофлуран анестезии, взвешивать животное, и бритье и дезинфицировать prepubic область 3 раза с использованием йода хирургической скраб.
   2. На грелку, ленты задних конечностей и хвоста вниз и катетеризировать мочевой пузырь с 20-го калибра ангиокатетер, который также аккуратно тесьмой вниз, чтобы предотвратить скольжение.
2. рассечение
   1. Используйте скальпель, чтобы выполнить 8 мм продольного разрез кожи от ощутимого лобкового симфиза в стороне уретры. Снимите кожу с обеих сторон для облегчения последующего закрытия раны.
   2. Рассеките прямо, чтобы идентифицировать стентированную уретру путем продольного расширения с тонкими ножницами. Поместите тонкие самоудерживающиеся крючки кожи для усиления воздействияМочеиспускательного канала.
   3. Выполните некоторое нежное продольное растекание с использованием изогнутых ножниц, дорсальных к уретре, чтобы развить плоскость между уретрой и влагалищем. Затем, пропустите 4-0 шелковый шов за уретрой и подготовьте двойной бросок хирургического узла.
3. Частичная уретральная непроходимость
   1. Снимите ангиокатетер, поместите 0,9-миллиметровый металлический стержень параллельно уретре, затем затяните узел вокруг уретры и металлического стержня, чтобы последний после этого легко выскользнул.
   2. Закрепите узел еще тремя бросками, используя мягкое натяжение, прежде чем снимать стержень. Вырежьте концы шовного материала длиной около 3 мм или 4 мм, если последующее освобождение обструкции является частью эксперимента.
4. Закрытие раны
   1. Приблизительно парауретральные железы используют погребенный одиночный шов рассасываемого плетеного шва 4-0.
   2. Закройте кожу с помощью утопленного горизонтального матраца, используя тот же абсорбируемый сутЮр. Примечание: В то время как это может показаться нетрадиционным использовать рассасывающийся шовный материал для кожи проникающего стежок, мы не сталкивались осложнения, такие как раневая инфекция, и что удаление шовного можно избежать.
5. После ухода
   1. Вводят бупренорфина 0,1 мг / кг подкожно перед помещением крысы в ​​клетке восстановления.
   2. Предлагаем мягкую диету восстановления в течение первых 24 часов до одной Размещенный крысы. После этого периода, дом животные снова в тех же пар, как до процедуры при условии, что они делают хорошо, и принадлежат к одной и той же группе лечения.
   3. Проверьте крыса ежедневно для размера мочевого пузыря и общего благосостояния; записывать свой вес, по крайней мере, раз в неделю.

2. NEMO у самок мышей

1. подготовка
   1. Поместите женский C57BL / 6 мыши весом около 18 г, и действовать подробно описано в шаге 1.1.1.
   2. Продолжать как указано в шаге 1.1.2, за исключением использования 24 калибра ангiocatheter.
2. рассечение
   1. Используйте скальпель для выполнения 6 мм продольного разреза кожи от ощутимого лобкового симфиза в стороне уретры.
   2. Рассеките прямо, чтобы идентифицировать стентированную уретру путем продольного расширения с тонкими ножницами. Снять нервно-сосудистый пучок работает вентрально на уретру по аналогичной тупым.
   3. Выполните некоторые нежные продольное распространение с помощью изогнутых ножниц спинных к уретре, чтобы развить плоскость между уретрой и влагалищем. Затем, прямо пройти 5-0 не рассасывающиеся плетеные шовный позади уретры и подготовить двойной бросок узла хирурга.
3. Частичная обструкция уретры
   1. Подключение ангиокатетер с 1 мл шприц и вводят 0,1 мл нормального солевого раствора в мочевой пузырь.
   2. Поместите 26 калибра канюли параллельно мочеиспускательного канала. Аккуратно затяните узел вокруг мочеиспускательного канала и канюли, потянув назад angiocaе.
   3. Безопасный узел с более 3 бросков, используя нежное напряжение перед снятием канюли.
   4. Тест мочи появляется в слуховом проходе при легком надавливании на мочевом пузыре животного; ослабить галстук, если не в состоянии выразить мочу. В противном случае, срежьте шов заканчивается длиной около 3 мм.
4. закрытие ран
   1. Закройте кожу с погребенным горизонтальным матрасом стежком с использованием 5-0 плетеных шовной рассасывающимся.
5. После ухода
   1. Вводят 0,1 мг / кг подкожно бупренорфин до помещения мышей в клетке восстановления.
   2. Предлагаем мягкую диету восстановления в течение первых 48 часов в одной Размещенный мыши. После этого периода, дом животные снова в одних и тех же группах, как до процедуры, при условии, что они делают хорошо, и принадлежат к одной и той же группе лечения.
      Примечание: Мыши с ощутимым вздутие мочевого пузыря через 24 ч после процедуры, которые не аннулированию при обращении с перепредставлены препятствия и умрёте в пвнутр 1 - 2 дней, если не забрано под наркозом для удаления мешающей лигатуры.
   3. Проверьте мышей ежедневно для размера мочевого пузыря и общего благосостояния; записывать свой вес, по крайней мере, раз в неделю.

Результаты

Нервосберегающая Середина-уретральная обструкция (Nemo) у самок крыс

смертность

Мы провели в середине уретры препятствие на более чем 40 самок крыс до сих пор и не было смертности.

Обсуждение

Смертность животных является одной из основных проблем традиционной модели pBOO в проксимальной уретре, на 15% или более во многих докладах ^{10, 11, 13.} NEMO, как представляется, имеет минимальную смертность при применении у самок крыс. ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Female rat	Charles-River Canada	Sprague Dawley Rat (Crl:SD); Strain Code: 400	about 200 g
Isoflorane vaporizer	Benson medical industries inc.	TEC III Isoflurane; product code: 53-T3ISO
Isoflorane	Fresenius Kabi Animal Health	Isoflorane; product code CP0406V2	250 mL bottle
Disposable scalpel	Ted Pella, Inc.	#15 Sterile, Stainless Steel Scalpels; catalogue number 549-9-15S
Microscopy forceps	Ted Pella, Inc.	Aesculap Microscopy Forceps, Finepoint, 115mm; product number 5443
Adson forceps	Ted Pella, Inc.	Aesculap Adson Dissection Forceps, Curved, 120mm; product number 5002-9
Curved surgical scissors	Ted Pella, Inc.	Surgical Scissors, Curved, S/S, 105mm; catalogue number 1376
0.9 mm inox metal rod	goodfellow.com	Stainless Steel - AISI 316L Wire Diameter:0.9mm; order code 911-684-65
Skin hooks - self made from inox steel	goodfellow.com	Stainless Steel - AISI 316L Wire Diameter:0.9mm; order code 911-684-65
4-0 Silk suture	esutures.com	4-0 Sofsilk black 98" strand; product number LS640
5-0 Vicry suture	esutures.com	5-0 Vicryl undyed 27" RB-1 taper; product number J213H
Needle holder	Medsupplier.com	Integra Miltex Carb-N-Sert Baumgartner Needle Holder - 5 1/2"; product code SKU NEE4484-8-40TC SKU NEE4484-8-40TC SKU NEE4484-8-40TC
Temgesic (Buprenorphine)	first veterinary supply	Buprenex 0.3MG/ml inj amps; item #075701
1 mL syringe with 27 G needle	Fisher Scientific	BD Tuberculin Syringe, BD 309623
20 G Angiocath	Fisher Scientific	Andwin Scientific ANGIOCATH 20 GA; Catalog No. NC9561906
Recovery diet	clearh2o	DietGel 31M; 72-08-5022
C57Bl/6 female mice	Charles-River Canada	C57BL/6 Mouse (C57BL/6NCrI); Strain Code: 027	about 18 g
24 G angiocath	Fisher Scientific	Hanna Pharmaceutical Supply Co., Inc. IV CATH ANGIOCATH 24GX3/4IN; Catalog No. NC9814340
5-0 Ethibond	esutures.com	5-0 Ethibond green 30" RB-1 taper; product number X550H
26 G syringe needle	Sigma-Aldrich	BD Precisionglide syringe needle, Gauge 26; z192392
Normal Saline	Baxter	0.9% Sodium Chloride Injection, USP, 100 mL MINI-BAG; product code 2B0043