Nerve-sparing Mid-ostruzione uretrale (Nemo) nel femminile piccoli roditori

Riepilogo

modellazione tradizionale di parziale ostruzione della vescica nei roditori è carico di mortalità degli animali. Una lesione denervazione dalla dissezione attorno alla uretra e la vescica collo prossimale è anche di grande preoccupazione. Abbiamo sviluppato e valutato un modello mid-ostruzione uretrale sicuro ed affidabile, evitando le carenze del modello tradizionale.

Abstract

Parziale ostruzione della vescica (pBOO) ha una elevata prevalenza, provoca notevole onere del paziente, e costi sanitari enormi. Il modello animale più comune per indagare rimodellamento della vescica in pBOO sono roditori di sesso femminile sottoposte a parziale ostruzione al uretra prossimale. Variabilità nel grado di ostruzione e mortalità degli animali sono maggiori preoccupazioni con ostruzione prossimale. Inoltre, sezionare intorno al uretra e la vescica collo prossimale mette a repentaglio innervazione della vescica.

Abbiamo sviluppato un modello un'ostruzione uretrale metà nerve-sparing (Nemo) per pBOO evitando gli svantaggi del modello tradizionale. Ci siamo avvicinati l'uretra appena inferiore alla sinfisi pubica, che ha ovviato alla necessità di laparotomia, nonché per la dissezione in questo settore; Inoltre, lo sfintere uretrale striato rimasta intatta. Abbiamo eseguito nemo in ratti femmina Sprague-Dawley (12 ostruzioni, 6 animali sham), così come nella femminili / topo BL6 C57 (20 ostruzioneS, 18 animali sham). Dopo due settimane abbiamo valutato la funzione della vescica, la massa della vescica e la massa corporea.

Non avevamo alcuna mortalità tra i ratti femminili ostruiti o affamati; Come descritto per il tradizionale metodo pBOO prossimale, abbiamo legato la sutura attorno all'uretra prossimale e un asta metallica temporaneamente posizionata di 0.9 mm. NeMO ha indotto un aumento dell'85% della massa della vescica dopo due settimane, il volume medio di urina residuo è stato di 0,4 mL in ratti parzialmente ostruiti, mentre solo 0,03 mL negli animali affamati. Nei topi abbiamo testato 3 dimensioni di cannole che abbiamo posto lungo l'uretra quando legano la sutura. Abbiamo scoperto che l'utilizzo di una cannula da 27 gauge ha determinato una mortalità animale superiore al 50%; Posizionare la cannula a 25 gauge non ha dato la risposta desiderata in massa aumentante della vescica; Utilizzando una cannula a 26 gauge ha dato risultati favorevoli con una minima mortalità animale (1/8), ma un significativo aumento di massa della vescica di due volte.

Introduzione

Parziale di uscita della vescica ostruzione (pBOO) ha una elevata prevalenza e può causare grave disfunzione della vescica ^1; lo spettro varia da malformazioni congenite come valvole uretrali posteriori o ipospadia, oltre stenosi uretrale acquisiti a iperplasia prostatica benigna. Quest'ultima colpisce oltre il 30% degli uomini sessant'anni e più ^2. Grande peso del paziente e costi sanitari associati immensi pBOO garantiscono il notevole sforzo di ricerca messo in studiare il rimodellamento della vescica in risposta alla resistenza maggiore deflusso ^3. Dal 2006 fino al 2015, oltre 220 PubMed indicizzato articoli sono stati pubblicati per quanto riguarda l'effetto di pBOO sulla vescica urinaria.

Sebbene modelli animali per pBOO sono stati concepiti in diverse specie ^4, come il ratto ^5, il coniglio ^{6, 7} maiale, e mouse ^{8, 9,} probabilmente il modello animale più comunemente usati sono tuttavia ratti femmina sottoposti parziale ostruzione dell'uretra prossimale; l'accesso alle addome degli animali, esteriorizzante della vescica, e la dissezione attorno al collo della vescica sono inevitabili con questa tecnica tradizionale prossimale ostruzione uretrale. Variabilità nel grado di ostruzione e mortalità degli animali sono solo alcuni dei problemi associati a questa procedura ^{10, 11;} abbiamo dimostrato che in sham operati animali, dissezione intorno all'uretra prossimale provoca cambiamenti fisiologici che correlano con perdita delle fibre nervose al collo vescicale ^12. Questa scoperta indica che il pBOO modello più comunemente utilizzati degli animali, che prevede l'accesso alla uretra prossimale nei roditori di sesso femminile, porta ad un infortunio denervazione con i cambiamenti strutturali e funzionali associati della vescica, che colpiscesham e gli animali ostruite. Pertanto, è necessario un approccio evitare infortuni denervazione alternate. Il nostro laboratorio ha sviluppato e valutato un approccio nerve-sparing ostruzione Mid-uretrale (Nemo), efficace nell'indurre cambiamenti ostruzione associate attesi nella vescica, come aumento della massa organo e urina residua, mentre gli animali sham-operati erano indistinguibili da animali di controllo non operati . Inoltre, lo sfintere uretrale striato rimasta intatta come si trova prossimale al livello di dissezione. Inoltre, la variabilità in aumento ostruzione indotta in massa vescica era significativamente inferiore a quello tradizionale ostruzione uretrale prossimale e la mortalità degli animali era zero.

Abbiamo inoltre applicato con successo nemo in topi di sesso femminile con una mortalità inferiore al 10% negli animali ostruiti, mentre tutti i modelli pBOO per topi descritti fino ad oggi sono stati associati ad una mortalità intorno al 50%. Studiare rimodellamento della vescica nel contesto pBOO nei topi beneficerà di applicabilità di tutto lo spettro delle modificazioni transgeniche.

Sezionare intorno alla metà uretra nei roditori femmina non induce cambiamenti strutturali o funzionali indesiderabili e di confusione nella vescica urinaria osservata nel modello ostruzione prossimale tradizionale. Tuttavia, inducendo una parziale ostruzione a livello intermedio uretrale induce ancora ipertrofia vescicale e aumentato urina residua, come previsto da un modello animale per pBOO. È importante sottolineare che l'esecuzione di nemo in topi avvia un'indagine di rimodellamento della vescica in pBOO ai metodi transgenici, che sono virtualmente disponibili nei roditori più grandi.

Protocollo

Il seguente protocollo sperimentale è stato approvato dal comitato di cura degli animali dell'istituzione.

1. Nemo ratti femmina

1. Preparazione
   1. Posizionare un ratto femmina Sprague-Dawley del peso di circa 200 g sotto il 3% isoflurano anestesia, pesare l'animale, e la rasatura e disinfettare la zona prepubico 3 volte utilizzando uno scrub chirurgico iodio.
   2. Su una piastra elettrica, nastro arti posteriori e la coda verso il basso e cateterizzarla la vescica con un'angiocatheter calibro 20, che è anche leggermente nastro adesivo per impedire scorrimento.
2. Dissezione
   1. Utilizzare un bisturi per eseguire Ø 8 mm un'incisione cutanea longitudinale dalla sinfisi pubica palpabile verso il meato uretrale. Sollevare la pelle su entrambi i lati per facilitare la chiusura della ferita dopo.
   2. Sezionare bruscamente per identificare l'uretra stent da longitudinale diffondendo con forbici sottili. Bel posto ganci della pelle di auto-mantenendo per aumentare l'esposizionedell'uretra.
   3. Eseguire alcune delicato longitudinale diffusione usando forbici curve dorsale dell'uretra per sviluppare il piano tra uretra e la vagina. Poi, senza mezzi termini passare una sutura 4-0 di seta dietro l'uretra e preparare il doppio tiro di nodo di un chirurgo.
3. Parziale ostruzione uretrale
   1. Rimuovere l'angiocatheter, posizionare una barra metallica 0,9 millimetri parallelo all'uretra, e poi stringere il nodo intorno all'uretra e metallo asta, in modo che quest'ultimo scorre ancora fuori facilmente in seguito.
   2. Fissare il nodo con altri 3 tiri usando delicata tensione prima di rimuovere l'asta. Tagliare la sutura termina circa 3 mm, 4 mm o se successivo rilascio di ostruzione è parte dell'esperimento.
4. chiusura della ferita
   1. Ravvicinare le ghiandole parauretrali utilizzando un unico punto sepolta di intrecciato riassorbibile sutura 4-0.
   2. Chiudere la pelle con un punto materasso orizzontale sepolto utilizzando lo stesso sut assorbibileUre. Nota: Anche se può sembrare non convenzionale di utilizzare una sutura assorbibile per un punto della pelle-penetrante, non abbiamo incontrato complicazioni come infezioni della ferita, e che la rimozione di sutura può essere evitato.
5. dopo la cura
   1. Iniettare buprenorfina 0,1 mg / kg per via sottocutanea prima di posizionare il ratto in una gabbia di recupero.
   2. Offrire qualche dieta ripristino software per le prime 24 ore al singolo ratto ospitate. Dopo questo periodo, gli animali casa ancora nelle stesse coppie come prima della procedura purché facendo bene e appartengono allo stesso gruppo di trattamento.
   3. Controllare i ratti quotidiani per dimensioni della vescica e il benessere generale; registrare il loro peso almeno settimanalmente.

2. Nemo topi femmina

1. Preparazione
   1. Posizionare una femmina C57BL / 6 topo peso di circa 18 g e procedere come indicato al punto 1.1.1.
   2. Procedere come descritto nella fase 1.1.2, ad eccezione di utilizzare un ang 24-gaugeiocatheter.
2. Dissezione
   1. Utilizzare un bisturi per eseguire 6 mm incisione cutanea longitudinale dalla sinfisi pubica palpabile verso il meato uretrale.
   2. Sezionare bruscamente per identificare l'uretra stent da longitudinale diffondendo con forbici sottili. Sollevare il fascio neuro-vascolare esecuzione ventrale sull'uretra da analogo dissezione.
   3. Eseguire alcune delicato longitudinale diffusione usando forbici curve dorsale dell'uretra per sviluppare il piano tra uretra e la vagina. Poi, bruscamente passare una sutura 5-0 intrecciata non riassorbibile dietro l'uretra e preparare il doppio tiro di nodo di un chirurgo.
3. Parziale ostruzione uretrale
   1. Collegare l'angiocatheter con una siringa da 1 ml e iniettare 0,1 ml di soluzione fisiologica nella vescica.
   2. Posizionare un 26-gauge cannula parallela alla uretra. Stringere il nodo intorno all'uretra e la cannula mentre si tira indietro l'angioca.
   3. Fissare il nodo con altri 3 giri utilizzando una leggera tensione prima di rimuovere la cannula.
   4. Prova per l'urina che compare alla carne su una leggera pressione sulla vescica animale; Allentare il legame se non è in grado di esprimere l'urina. In caso contrario, tagliare le estremità della sutura di circa 3 mm di lunghezza.
4. Chiusura della ferita
   1. Chiudere la pelle con un punto di materasso orizzontale sepolto usando una sutura assorbibile intrecciata 5-0.
5. Dopo la cura
   1. Iniettare 0.1 mg / kg di buprenorfina sottocutanea prima di posizionare il mouse in una gabbia di recupero.
   2. Offrire una dieta morbida di recupero per i primi 48 h al mouse unico alloggiato. Dopo questo periodo, gli animali di casa nuovamente negli stessi gruppi come prima della procedura forniscono che stanno facendo bene e appartengono allo stesso gruppo di trattamento.
      NOTA: I topi con una vescica distesa palpabile 24 ore dopo che la procedura che non si svuota durante la manipolazione è over-obstructed e morirà entro il next 1 - 2 giorni a meno che non ripreso sotto anestesia per la rimozione della legatura ostruente.
   3. Controllare i topi quotidiani per dimensioni della vescica e il benessere generale; registrare il loro peso almeno settimanalmente.

Risultati

Nerve-sparing Mid-ostruzione uretrale (Nemo) nei ratti femmina

Mortalità

Abbiamo effettuato un mid-ostruzione uretrale su più di 40 ratti femmina finora e non ha avuto mortalità.

massa della vescica

massa vesci...

Discussione

Mortalità animale è una delle principali preoccupazioni del modello tradizionale della pBOO presso l'uretra prossimale, al 15% o più in molte relazioni ^{10, 11, 13.} NeMO sembra avere la mortalità minima quando viene applicata nei ratti femmina. Prossimale ostruzione uretrale nei topi è tecnicamente più impegnativo rispetto nei ratti, e quindi anche più inclini a complicazioni. Utilizzando una cannula ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Female rat	Charles-River Canada	Sprague Dawley Rat (Crl:SD); Strain Code: 400	about 200 g
Isoflorane vaporizer	Benson medical industries inc.	TEC III Isoflurane; product code: 53-T3ISO
Isoflorane	Fresenius Kabi Animal Health	Isoflorane; product code CP0406V2	250 mL bottle
Disposable scalpel	Ted Pella, Inc.	#15 Sterile, Stainless Steel Scalpels; catalogue number 549-9-15S
Microscopy forceps	Ted Pella, Inc.	Aesculap Microscopy Forceps, Finepoint, 115mm; product number 5443
Adson forceps	Ted Pella, Inc.	Aesculap Adson Dissection Forceps, Curved, 120mm; product number 5002-9
Curved surgical scissors	Ted Pella, Inc.	Surgical Scissors, Curved, S/S, 105mm; catalogue number 1376
0.9 mm inox metal rod	goodfellow.com	Stainless Steel - AISI 316L Wire Diameter:0.9mm; order code 911-684-65
Skin hooks - self made from inox steel	goodfellow.com	Stainless Steel - AISI 316L Wire Diameter:0.9mm; order code 911-684-65
4-0 Silk suture	esutures.com	4-0 Sofsilk black 98" strand; product number LS640
5-0 Vicry suture	esutures.com	5-0 Vicryl undyed 27" RB-1 taper; product number J213H
Needle holder	Medsupplier.com	Integra Miltex Carb-N-Sert Baumgartner Needle Holder - 5 1/2"; product code SKU NEE4484-8-40TC SKU NEE4484-8-40TC SKU NEE4484-8-40TC
Temgesic (Buprenorphine)	first veterinary supply	Buprenex 0.3MG/ml inj amps; item #075701
1 mL syringe with 27 G needle	Fisher Scientific	BD Tuberculin Syringe, BD 309623
20 G Angiocath	Fisher Scientific	Andwin Scientific ANGIOCATH 20 GA; Catalog No. NC9561906
Recovery diet	clearh2o	DietGel 31M; 72-08-5022
C57Bl/6 female mice	Charles-River Canada	C57BL/6 Mouse (C57BL/6NCrI); Strain Code: 027	about 18 g
24 G angiocath	Fisher Scientific	Hanna Pharmaceutical Supply Co., Inc. IV CATH ANGIOCATH 24GX3/4IN; Catalog No. NC9814340
5-0 Ethibond	esutures.com	5-0 Ethibond green 30" RB-1 taper; product number X550H
26 G syringe needle	Sigma-Aldrich	BD Precisionglide syringe needle, Gauge 26; z192392
Normal Saline	Baxter	0.9% Sodium Chloride Injection, USP, 100 mL MINI-BAG; product code 2B0043