Un modèle de néphrectomie souris 5/6ème qui induit la cardiomyopathie et urémique expérimentale

Résumé

Ce manuscrit fournit une intervention chirurgicale en deux étapes détaillées pour effectuer la néphrectomie partielle^th 5/6 de la souris (PNx) avec ligature du pôle. Quatre semaines après la chirurgie, par rapport aux souris opérés, les souris PNx développé la fibrose cardiaque, hypertrophie cardiaque, anémie, insuffisance rénale et une diminution de la fonction cardiaque systolique et diastolique.

Résumé

Insuffisance rénale chronique (IRC) est un grand facteur de risque d’événements cardio-vasculaires et la mortalité et se développe progressivement au phénotype clinique appelé « cardiomyopathie et urémique ». Nous décrivons ici un modèle expérimental de souris CKD, nommé néphrectomie partielle de^th 5/6 (PNx) avec ligature de pôle, qui a développé et urémique cardiomyopathie à post-chirurgie de quatre semaines. Ce modèle de PNx a été effectué par une chirurgie en deux étapes. Dans l’étape-une chirurgie, les deux pôles du rein gauche ont été ligaturés. En étape 2 chirurgie, qui a été réalisée 7 jours après la chirurgie une étape, le rein droit a été supprimé. Pour la chirurgie de l’imposture, les mêmes procédures de chirurgie ont été réalisées, mais sans pole ligature du rein gauche ou enlèvement du rein droit. Les interventions chirurgicales sont plus faciles et moins de temps, par rapport aux autres méthodes. Cependant, le reste des masse rénale fonctionnelle ne sont pas aussi facilement contrôlée comme la ligature de l’artère rénale. Quatre semaines après la chirurgie, en comparaison avec les souris opérés, les souris PNx développé la fibrose cardiaque, hypertrophie cardiaque, anémie, insuffisance rénale et une diminution de la fonction cardiaque systolique et diastolique.

Introduction

CKD, aussi appelée insuffisance rénale chronique, est une perte progressive de la fonction rénale au fil du temps qui finit par se développe en insuffisance rénale permanente. CKD, des États de maladie rénale stade précoce vers l’insuffisance rénale terminale (IRT), est un grand facteur de risque d’événements cardio-vasculaires et la mortalité et se développe progressivement au phénotype clinique appelé « cardiomyopathie et urémique »^{1, 2,3}. La cardiomyopathie et urémique chez les patients atteints d’IRC ou insuffisance rénale terminale est associée à des malformations cardiovasculaires, principalement causées par la surcharge de pression (LV) ventriculaire gauche et/ou de volume, conduisant à une hypertrophie (HVG) LV, LV dilatation et dysfonctionnement systolique VG^{4 ,5,6}. La fibrose cardiaque est un autre processus pathologique commun de cardiomyopathie et urémique qui réduit la conformité cardiaque résultant en dysfonction diastolique du VG. La fibrose cardiaque sévère peut conduire à la mort cardiaque subite, même chez les personnes sans symptômes cardiaques⁷.

Le 5/6^ème PNx est un modèle animal couramment utilisé de CKD pour les études sur l’animal impliquant une insuffisance rénale, une cardiomyopathie et urémique et l’hypertension. PNx est obtenue par l’ablation du parenchyme rénal 5/6. Le modèle de rat a été initialement développé avec les deux plus courantes protocoles utilisés étant la résection chirurgicale ou infarctus du myocarde. Le modèle de PNx de rat est un modèle extrêmement utile pour étudier la cardiomyopathie et urémique avec élévations importantes dans la tension artérielle, hypertrophie cardiaque et affaiblissement de la fonction diastolique. Plus tard, les souris PNx modèles, exploités avec des techniques similaires comme le modèle de rat, ont été développés en raison de la grande disponibilité et la facilité de faire des manipulations génétiques dans le système de souris.

Il est bien documenté que le stress oxydant systémique est une caractéristique constante de ces deux cliniques et expérimentales de cardiomyopathie et urémique^8,9. De plus, stress oxydant contribue au syndrome urémique¹⁰et joue un rôle essentiel dans la pathogenèse de l’anomalie cardiaque vu dans la cardiomyopathie et urémique^11,12,13. Jusqu'à présent, nous avons démontré que le rongeur 5/6^ème PNx modèle entraîne des caractéristiques morphologiques, physiologiques et biochimiques de cardiomyopathie et urémique^{14,15,16, 17}. dans le modèle murin PNx décrit ici, fonctionnant sur PNx souris ont développé le stress oxydatif important, au moins partiellement médiée par la Na/K-ATPase fonction, qui est essentielle dans la cardiomyopathie et urémique expérimentale induite par le PNx de signalisation. Atténuation de la Na/K-ATPase de signalisation non seulement réduit l’amplification oxydative, mais améliore également les changements phénotypiques de cardiomyopathie et urémique expérimentale induite par le PNx¹⁸.

Protocole

tous les soins des animaux et des expériences ont été approuvées par le Marshall University Institutional Animal Care et utilisation Comité (IACUC) conformément au Guide National Institutes of Health (NIH) pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Les souris C57BL/6 mâles (âgés de 10 à 12 semaines) sont trouvaient à une animalerie gratuit pathogène dans désigné équipées de cages qui fournissent l’air purifié suivant un cycle lumière/obscurité de 12 h. Nourriture et eau ont été fournis ad libitum.

1. préparation de la chirurgie

Remarque : les instruments chirurgicaux et les matériaux proviennent de différentes sources qui ne sont pas spécifiques aux opérations de chirurgie. Instruments et matériaux provenant d’autres sources peuvent également être utilisés aux mêmes fins. Voir la Table des matières pour obtenir une liste d’instruments chirurgicaux.

Table

1. préparation pour la chirurgie
   1. Place le texte suivant à la portée de fonctionnement : chauffage pad, lampe halogène, réservoir d’oxygène et réservoir d’isoflurane, vaporisateur isoflurane, tondeuse à cheveux, crème dépilatoire, échelles, stérilisés ensemble, draps chirurgicaux stérilisés, cotons-tiges, alcool à 70 %, solution de polyhydroxydine (contenant de l’iode 1 %), solution de NaCl à 0,9 %, buprénorphine (30 G), 3-0 et 4-0 points de suture en soie, les aiguilles et seringues de 1 mL et pénicilline, onguent antibiotique, de fonctionnement et pommade ophtalmique lubrifiante.
   2. Nettoyer une cage et placer un coussin chauffant sous la literie pour les souris logement après chirurgie.

2. Étape-une intervention chirurgicale : ligature de rein gauche de pôle

Remarque : maintenir des conditions stériles pendant la chirurgie. Couvrir les instruments chirurgicaux stérilisés à l’autoclave avec un tampon stérile. Conserver plus d’un ensemble d’instruments chirurgicaux dans la main pendant plus d’une intervention chirurgicale prévenir la contamination croisée pendant la chirurgie. Si les instruments doivent être réutilisés, dans le cas de plusieurs chirurgies, désinfecter les instruments avec la solution de bétadine et de l’éthanol à 70 % et ensuite stériliser dans un stérilisateur de perle de verre germinator pendant 5 min. désinfecter la zone de fonctionnement avec l’éthanol à 70 %. Porter une robe, masque (à couvercle nez et la bouche), cap (pour couvrir la tête) et une paire de gants stériles. Changer de gants après chaque intervention chirurgicale.

1. Laver et désinfecter les mains et porter des gants chirurgicaux stériles. Porter un chapeau de tête et un masque.
2. Désinfecter la table avec l’alcool à 70 %. Appliquer la pommade ophtalmique lubrifiante pour les deux yeux de la souris pour prévenir le dessèchement des yeux sous anesthésie.
3. Placer la souris dans une chambre de l’induction d’un système de vaporisateur isoflurane et induire l’anesthésie avec un mélange d’isoflurane 2,5 % avec 100 % d’oxygène (0,8 - 1,2 L/min) pendant 1-2 min.
   Remarque : L’efficacité de l’anesthésie a été déterminée par l’absence de réflexe de la douleur provoquée par pincement de la queue, ainsi que par l’absence de réflexe palpébral en appuyant sur la paupière.
4. Injecter de la pénicilline (40 000 unité/kg de poids corporel, IM) et la buprénorphine (0,02 mg/kg de poids corporel, SC) pour prévenir l’infection et la douleur pendant la chirurgie.
5. Placer la souris sur un tapis chauffant (initialement fixée à 42 ° C) avec un thermomètre rectal pour maintenir et surveiller la température du corps autour de 37 ° C au cours de la procédure. Placer le nez de souris dans le cône de nez et de ventiler avec un mélange de 0,8 à 1,2 % isoflurane avec 100 % d’oxygène (0,8 à 1,2 L/min) pendant la chirurgie.
6. Placer la souris sur le côté droit. Raser les poils de la zone chirurgicale avec une tondeuse à cheveux, puis enlever avec la crème dépilatoire. Désinfecter le site avec la solution polyhydroxydine (contenant de l’iode 1 %), suivi de l’éthanol à 70 %. Alignez autoclavés draps chirurgicaux sur la zone chirurgicale.
7. Faire une incision lombaire de ~1.0 cm et séparer les muscles et fascia pour exposer le rein gauche à l’aide du scalpel et les forceps ( Figure 1 a).
8. Retirer le rein gauche très doucement en tirant sur la graisse périrénales avec une petite pince émoussée. Dans le processus, pour ne pas déranger la glande surrénale, relevez la glande surrénale du rein avec une pince.
9. Using pince émoussée, tease doucement le tissu conjonctif et la glande surrénale de l’extrémité supérieure du rein vers le pylore moyen du rein où les vaisseaux sanguins entrer et sortir. Identifier et isoler l’uretère.
   Remarque : L’uretère se trouve près de la moitié inférieure du rein intégré dans le tissu conjonctif et clairement visible sous la lumière.
10. Doucement, prenez le tissu conjonctif et séparer le tissu rénal pour s’assurer que l’uretère n'est pas ligaturé.
11. Avant des trompes polaires, utilisez une règle stérile pour identifier la partie 1/3 supérieure et inférieure du rein. Le rein de souris est généralement autour de 1,25 à 1,5 cm long.
12. Ligate utilisant une soie de 3-0 chaîne de suture et avec la propre force, environ 0,4 cm de la partie supérieure vers le milieu du pylore et de la même façon, 0,4 cm de la partie inférieure vers le pylore ( Figure 1 a, pointillé Lines).
13. Après ligature des deux pôles ( Figure 1 b), permettent un temps de 2 min d’observation pour s’assurer qu’il n’y a pas de saignement.
    Remarque : Dans le processus, il est très important d’éviter la ligature de la glande surrénale, artère rénale et de l’uretère. Si l’uretère gauche est ligaturé, la souris va mourir après l’ablation du rein droit dans la chirurgie de l’étape 2. La force de la ligature peut restreindre le débit sanguin vers les pôles sans causer un saignement intra rénal. Dans 1-2 minutes après la ligature, les pôles sont décolorés en raison de la limite du débit sanguin vers les pôles.
14. Repousser le rein gauche à l’emplacement d’origine. Fermer les muscles et la peau avec des cordes de suture de soie de 4-0 et 3-0, respectivement. Appliquer une pommade antibiotique sur la zone chirurgicale pour une meilleure récupération et désinfection.
15. Après la ligature, maison la souris séparément dans une cage avec une lampe chauffante au-dessus de la cage afin que le domaine de la literie est proche de 37 ° C (contrôlés avec un thermomètre), avant de placer les animaux dans des cages individuelles.
    NOTE : Surveiller la souris jusqu'à ce qu’il a repris connaissance suffisante pour maintenir le décubitus sternal.
16. Permettent un accès facile à l’eau et de nourriture pendant la récupération. Administrer de la pénicilline et la buprénorphine chaque 12 h pour la premier 3 jours après la chirurgie prévenir l’infection et douleur.
    Remarque : La souris devrait récupérer du traumatisme de la chirurgie dans les 2-3 jours et devrait être de retour à la normale manger, de boire et de déplacement. À cette époque, la maison la souris individuellement pour restauration complète. Ce qui suit doit être surveillé : boire, manger, marche des patrons, démarche maladroite, dos voûté, décharge oculaire ou nasale et un comportement agressif. Euthanasier la souris si elle montre des signes de saisie, coma, infection incurable, difficulté à marcher, perte de la marche, incapable de manger et boire et perte de plus de 15 % poids de pré-opération.

3. Chirurgie de l’étape 2 : suppression du rein droit

1. sept jours plus tard, exposer le rein droit comme pour le rein gauche en étapes 2.1 à 2.10, sauf placer la souris sur son côté gauche.
2. Placer le rein droit sur la toile de lin et désactivez environnant la graisse et du tissu conjonctif avec une pince émoussée.
3. Identifier l’artère rénale et la veine et puis placer deux ligatures (soie de 3-0) chacun avec un seul noeud lâche autour des vaisseaux. Doucement taquiner le tissu conjonctif et les surrénales glande de l’extrémité supérieure du rein vers le pylore moyen du rein avec une pincette émoussé. Doucement déplacer l’uretère de l’extrémité inférieure et attacher tous les vaisseaux ensemble (soie de 3-0) sans provoquer de saignements.
4. Déplacer les deux noeuds de ligature lâche le long des vaisseaux. Un du côté de l’aorte abdominale et l’autre vers le côté du rein.
5. Tout d’abord attacher le noeud de ligature (vers le côté de l’aorte abdominale) avec doubles noeuds ; un noeud solid changera la couleur du rein droit. Attacher le noeud de ligature (vers le côté de rein) avec doubles noeuds. Laisser suffisamment d’espace entre ces deux doubles noeuds afin de couper les navires entre les deux noeuds sans couper les noeuds de la ligature.
6. Couper les vaisseaux rénaux entre les deux noeuds et retirer le rein droit. Recherchez les saignements possibles des vaisseaux rénaux.
7. Sécher le rein droit à l’aide d’une gaze stérile et peser it.
8. Refermer l’incision du muscle avec chaîne de suture de soie de 4-0, puis fermez l’incision de la peau avec de la ficelle de suture de soie de 3-0.
9. Maison la souris séparément dans une cage propre solitaire avec une lampe chauffante au-dessus de la cage (étape 2.15) avec un accès facile à l’eau et de nourriture pendant au moins 24 h de récupération. Administrer de la pénicilline et la buprénorphine toutes les 12 h pendant 3 jours pour prévenir toute infection et douleur.
   Remarque : La souris devrait récupérer du traumatisme de la chirurgie dans les 2-3 jours et devrait être de retour à la normale manger, boire et se déplaçant.
10. Après la chirurgie, surveiller les souris deux fois par jour pendant trois jours et puis une fois par jour pendant la durée de l’expérience. Suivez les procédures de suivi et des traitements post-opératoires décrits à l’étape 2.16.

4. Simulacre de chirurgie

1. pour la chirurgie de l’imposture, exécutez les procédures chirurgie, y compris l’exposition du rein, dissection du tissu et fermeture de la plaie, mais sans la ligature de pôle du rein gauche ou enlèvement du rein droit.

5. évaluation de cardiomyopathie et urémique expérimental

1. un jour avant le sacrifice, effectuer une échocardiographie transthoracique et capturer les images ¹⁸.
   NOTE : Ici, l’échocardiographie transthoracique a été réalisée avec une souris manipulation table et thermomètre rectal. Les images échocardiographiques ont été capturées à l’aide d’un 18-38 MHz capteur de fréquence d’exploitation attaché à un système d’imagerie. Épaisseur relative (RWT), indice de performance myocardique (MPI) et indice de masse ventriculaire gauche (LVMI) ont été calculés comme nous décrit ¹⁸.
2. à l’heure du sacrifice, mesurer le poids du corps. Mesurer l’hématocrite (HCT) avec une centrifugeuse HCT selon les fabricant ' instructions de s. Préparer les échantillons de plasma à l’aide de tubes revêtus d’héparine en centrifugeant les échantillons de sang pendant 10 min à 1 500 g à 4 ° C dans une centrifugeuse réfrigérée sur table. Mesurer la cystatine C, créatinine et BUN utilisant des kits d’après le fabricant ' instructions de s. Effectuer les mesures en double exemplaire.
3. à la fin de l’expérience, anesthésier les souris avec la kétamine (90 mg/kg, IP) et xylaxine (10 mg/kg, IP) et sacrifier par thoracotomie. Mesurer le poids du coeur après son retrait de la poitrine. Préparer cardiaque (LV) et des homogénats de reins, ainsi que détermination du collagène de Type 1 (COL-1), la phosphorylation de carbonylation c-Src et des protéines, comme décrit précédemment ^{18 , 19}.

Résultats

Les données ont indiqué que cette modification 5/6^ème PNx par ligature de pôle est un modèle simple et efficace d’enquêter sur la cardiomyopathie et urémique. Post-chirurgie de quatre semaines, ce PNx modèle présente avec facultés affaiblies de la fonction rénale, anémie, hypertrophie cardiaque, fibrose cardiaque et une diminution de la fonction cardiaque systolique et diastolique. Les résultats sont résumés ci-dessous.

Discussion

Le rat 5/6^ème PNx modèle a été largement utilisé pour l’étude CKD. En raison de la taille beaucoup plus petite rein chez la souris, la ligature de l’artère classique et la résection du pôle sont des modèles de souris avec les taux de mortalité élevé possible et perte de saignement inattendu/sang restent très difficiles.

Nous avons adopté un modèle murin de PNx avec ligature de la pole à surmonter la perte de sang/saignement. Ce modèle de PNx prend moins de temp...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Iris Scissors, 11.5 cm, Straight	World Precision Instruments	501758
WPI Swiss Tweezers #5 11 cm, 0.1x0.06 mm Tips	World Precision Instruments	504506
Jewelers #5 Forceps, 11cm, Straight, Titanium	World Precision Instruments	555227F
Iris Forceps, 10cm, Straight, Serrated	World Precision Instruments	15914
Tweezers #3, 11cm, 0.2x0.4mm Tips	World Precision Instruments	501976
Medesy Iris 4.5" Curved Scissors, Stainless Steel	Net23	3512	www.Net32.com
Dr. Slick Iris Scissors; 3.5"	Avid Max	220-1-965-IrisScsrs-P	www.Avid Max.com
Miltex Iris Scissors 4 1/8" Curved	4mdmedical	V95-306	www.4mdmedical.com
5" Hemostat clap, curved jaw	PJTool	4355	www.pjtool.com
sklar Knapp Iris scissors, straight and sharp/blunt 4"	Medical Device depot	64-3430	www.medicaldevicedepot.com
Kelly Hemostatic Forceps straight 5.5"	Pilgtimmedical	FA710-50	www.pilgtimmedical.com
C57BL/6 mice	Hilltop Lab Animals Inc.
Mouse Handling Table and rectal thermometer	Visualsonics
MicroScan transducer	Vevo 1100	MS400
Vevo 1100 Imaging System	FUJIFILM VisualSonics Inc.
Cystatin C ELISA kit and mouse creatinine kit	Crystal Chem. Inc.
Mouse BUN ELISA kit	MyBioSource Inc