Um Mouse 5/6th nefrectomia modelo que induz a miocardiopatia urêmica Experimental

Resumo

Este manuscrito fornece um procedimento cirúrgico de duas etapas detalhadas para executar o rato 5/6^th nefrectomia parcial (PNx) com ligadura de polo. Quatro semanas após a cirurgia, em comparação com a operação de ratos, os ratos PNx desenvolveram insuficiência renal, anemia, hipertrofia cardíaca, Fibrose cardíaca e diminuição da função sistólica e diastólica do coração.

Resumo

Doença renal crônica (DRC) é um grande fator de risco para eventos cardiovasculares e mortalidade e desenvolve progressivamente para o fenótipo clínico chamado "miocardiopatia urêmica". Descrevemos aqui um modelo experimental de rato CKD, denominado 5/6^th nefrectomia parcial (PNx) com ligadura de polo, que desenvolveu miocardiopatia urêmica no pós-operatório de quatro semanas. Este modelo de PNx foi realizado por uma cirurgia em duas fases. Na cirurgia de um passo, ambos os polos do rim esquerdo foram ligados. No passo dois cirurgia, que foi realizada 7 dias após a cirurgia de uma etapa, o rim direito foi removido. Para a cirurgia de Souza, realizaram-se os mesmos procedimentos de cirurgia, mas sem Polo ligadura do rim esquerdo ou remoção do rim direito. Os procedimentos cirúrgicos são mais fácil e menos demorado, em comparação com outros métodos. No entanto, os remanescentes massa renal funcional não é facilmente controlada como a ligadura da artéria renal. Quatro semanas após a cirurgia, em comparação com os ratos de operação, os ratos PNx desenvolveram insuficiência renal, anemia, hipertrofia cardíaca, Fibrose cardíaca e diminuição da função sistólica e diastólica do coração.

Introdução

CKD, também conhecida como insuficiência renal crônica, é uma perda progressiva da função renal ao longo do tempo que eventualmente se desenvolve em insuficiência renal permanente. CKD, de Estados de doença renal precoce do estágio ao estágio final da doença renal (DRT), é um grande fator de risco para eventos cardiovasculares e mortalidade e desenvolve progressivamente para o fenótipo clínico chamado "miocardiopatia urêmica"^{1, 2,3}. A miocardiopatia urêmica em pacientes com DRC ou DRT está associada com anormalidades cardiovasculares, principalmente causadas por sobrecarga do ventrículo esquerdo (LV) pressão e/ou volume, levando a hipertrofia LV (HVE), dilatação de LV e disfunção sistólica LV^{4 ,5,6}. Fibrose cardíaca é outro processo patológico comum de miocardiopatia urêmica que reduz a conformidade cardíaca resultando em disfunção diastólica LV. Fibrose cardíaca severa pode levar à morte súbita cardíaca, mesmo naqueles sem sintomas cardíacos⁷.

5/6^th PNx é um modelo animal de CKD comumente usado para estudos animais envolvendo a insuficiência renal, miocardiopatia urêmica e hipertensão. PNx é alcançado pela ablação do parênquima renal de 5/6. O modelo de rato foi desenvolvido inicialmente com as duas mais comuns protocolos empregados sendo a ressecção cirúrgica ou infarto. O modelo de PNx do rato é um modelo extremamente útil para estudar a miocardiopatia urêmica, com elevações substanciais na pressão arterial, hipertrofia cardíaca e insuficiência diastólica. Mais tarde, desenvolveram-se modelos de rato PNx, operados com as técnicas semelhantes, como o modelo de rato, devido à ampla disponibilidade e facilidade de fazer manipulações genéticas no sistema de rato.

É bem documentado que o estresse oxidante sistêmica é uma característica constante de ambos miocardiopatia urêmica clínica e experimental^8,9. Além disso, o estresse oxidante contribui para a síndrome urêmica¹⁰e desempenha um papel crítico na patogênese das anormalidades cardíacas visto em miocardiopatia urêmica^11,12,13. A este ponto, Nós demonstramos que o roedor de 5/6^th PNx modelo faz com que características fisiológicas, morfológicas e bioquímicas de miocardiopatia urêmica^{14,15,16, 17}. no rato PNx modelo descrito aqui, PNx-operado ratos desenvolveram estresse oxidativo significativo, pelo menos parcialmente mediado pela Na/K-ATPase, sinalizando a função, que é crítica em mediada por PNx experimental miocardiopatia urêmica. Atenuação de sinalização Na/K-ATPase não só reduz a amplificação oxidativa, mas também melhora as alterações fenotípica em mediada por PNx experimental miocardiopatia urêmica¹⁸.

Protocolo

todos os cuidados com animais e experiências foram aprovadas pelo Marshall University de cuidados institucionais com animais e Comissão de utilização (IACUC) de acordo com o National Institutes of Health (NIH) guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório. Camundongos C57BL/6 do sexo masculino (10-12 semanas de idade) foram alojados em uma unidade animal livre de patógeno em designado quartos equipados com gaiolas que fornecem ar purificado, sob um ciclo claro/escuro de 12 h. Comida e água foram fornecidos ad libitum.

1. preparação de cirurgia

Nota: os instrumentos cirúrgicos e materiais são obtidos de fontes diferentes que não são específicas para operações de cirurgia. Instrumentos e materiais de outras fontes também podem ser usados para a mesma finalidade. Consulte a Tabela de materiais, para obter uma lista de instrumentos cirúrgicos.

Tabela de

1. de preparação para a cirurgia
   1. lugar a seguir ao alcance de funcionamento: Aquecimento pad, lâmpada halógena, tanque de oxigênio e tanque de isoflurano, vaporizador de isoflurano, tosquiadeira de cabelo, creme da remoção do cabelo, escalas, esterilizadas funcionamento conjunto, linho cirúrgico esterilizado, cotonetes, álcool a 70%, solução de polyhydroxydine (contendo 1% de iodo), solução de NaCl 0,9%, buprenorfina de seringas e agulhas (30 G), suturas de seda 3-0 e 4-0, 1ml e penicilina, pomada antibiótica, e pomada lubrificante.
   2. Limpar a gaiola e coloque uma almofada de calor sob o fundamento para ratos habitação após a cirurgia.

2. Passo-um cirurgia: polo da ligadura da esquerda rim

Nota: manter condições estéreis durante a cirurgia. Cobrir os instrumentais cirúrgicos esterilizados em autoclave com uma almofada de estéril. Manter mais de um conjunto de instrumentos cirúrgicos na mão por mais de uma cirurgia evitar contaminação cruzada durante a cirurgia. Se os instrumentos precisam ser usados novamente, no caso de múltiplas cirurgias, desinfetar os instrumentos com solução de betadine e etanol a 70% e em seguida esterilizar em um esterilizador de grânulo de vidro germinador por 5 min. desinfectar a área de atuação com 70% de etanol. Vestir a toga, máscara (para cobrir nariz e boca), PAC (para cobrir a cabeça) e um par de luvas estéreis. Trocar as luvas após cada cirurgia.

1. Lavar e desinfectar as mãos e usar luvas cirúrgicas estéreis. Usar uma máscara e um tampão principal.
2. Desinfectar a tabela com álcool a 70%. Aplicar a pomada lubrificante para ambos os olhos do rato para evitar ressecamento do olho enquanto sob anestesia.
3. Coloque o mouse em uma câmara de indução de um sistema de vaporizador de isoflurano e induzir anestesia com uma mistura de 2,5% de isoflurano com oxigênio a 100% (0,8 - 1,2 L/min) 1-2 min.
   Nota: A eficácia da anestesia foi determinada pela ausência de reflexo de dor provocada por beliscar a cauda, bem como pela ausência de reflexo palpebral ao tocar a pálpebra.
4. Injetar penicilina (40.000 unidade/kg de peso corporal, IM) e a buprenorfina (0,02 mg/kg de peso corporal, SC) para prevenir a infecção e dor durante a cirurgia.
5. Coloque o mouse sobre uma almofada de aquecimento (inicialmente definido a 42 ° C) com um termômetro retal para manter e monitorar a temperatura do corpo em torno de 37 ° C durante o procedimento. Coloque o nariz de rato para o cone do nariz e ventilar com uma mistura de 0,8-1,2% de isoflurano com oxigênio a 100% (0,8-1,2 L/min) durante a cirurgia.
6. Posicione o mouse no lado direito. Raspar os pelos da área cirúrgica com um aparador de cabelo e em seguida, retire com o creme depilatório. Desinfecte o local com solução de polyhydroxydine (contendo 1% de iodo) seguido de etanol a 70%. Alinhar o linho cirúrgico autoclavado na área cirúrgica.
7. Fazer uma incisão lombar cm de ~1.0 e separar o músculo e a fáscia para expor o rim esquerdo, usando o bisturi e pinça ( Figura 1a).
8. Retirar o rim esquerdo suavemente puxando a gordura perirrenal com pequenas pinças sem corte. No processo, a fim de não perturbar a glândula adrenal, mova a glândula adrenal para cima do rim com fórceps.
9. Usando fórceps rombudo, tease suavemente o tecido conjuntivo e glândula adrenal da extremidade superior do rim em direção ao piloro médio do rim onde os vasos sanguíneos entram e saem. Identificar e isolar o ureter.
   Nota: O ureter situa-se próximo a metade inferior do rim incorporado no tecido conjuntivo e claramente visível sob luz.
10. Suavemente pegue o tecido conjuntivo e separar o tecido renal para garantir que o ureter não é ligado.
11. Antes de ligadura polar, use uma régua estéril para identificar a parte de 1/3 superior e inferior do rim. O rim de rato é geralmente em torno de 1.25-1.5 cm tempo
12. Ligam usando uma seda 3-0 sequência de sutura e com os devidos forçar, aproximadamente 0,4 cm da parte superior para o meio do piloro e do mesmo modo, 0,4 cm da porção inferior em direção ao piloro ( Figura 1a, pontilhado linhas).
13. Depois ligando os dois polos ( Figura 1b), permitem um tempo de observação de 2 min certificar-se de que não há nenhuma hemorragia.
    Nota: No processo, é muito importante evitar a ligadura da glândula supra-renal, artéria renal e ureter. Se o ureter esquerdo é ligado, o rato vai morrer após a remoção do rim direito em cirurgia o passo dois. A força da ligadura pode restringir o fluxo de sangue para os polos sem causar hemorragia intra-renal. Dentro de 1-2 min depois da ligadura, os polos são descoloridos devido o limite do fluxo de sangue para os polos.
14. Empurre o rim esquerdo de volta para o lugar original. Feche o músculo e a pele com fios de sutura de seda 4-0 e 3-0, respectivamente. Aplique pomada antibiótica na área cirúrgica para uma melhor recuperação e desinfecção.
15. Depois da ligadura, casa o mouse separadamente em uma gaiola com uma lâmpada de calor sobre a gaiola para que a área da cama é perto de 37 ° C (monitorizado com um termômetro), antes de colocar os animais em gaiolas individuais.
    Nota: Monitorar o mouse até que ele recuperou a consciência suficiente para manter a prostração esternal.
16. Permitir o fácil acesso a água e comida durante a recuperação. Administrar a penicilina e a buprenorfina cada 12 h para o primeiro 3 dias depois da cirurgia prevenir a infecção e dor.
    Nota: O mouse deve recuperar do trauma da cirurgia dentro de 2-3 dias e deve ser volta ao normal comer, beber e se movendo. Desta vez, na casa do mouse individualmente para recuperação completa. O seguinte deve ser monitorado: beber, comer, caminhar, padrões, andar desajeitado, encurvada atrás, descarga nasal ou ocular e comportamento agressivo. Eutanásia o mouse se mostra qualquer sinal de convulsão, coma, infecção intratável, dificuldade para andar, perda da marcha, incapaz de comer e beber e perda de mais de 15% peso de pré-operação.

3. Cirurgia de dois passo: remoção de rim direito

1. sete dias mais tarde, expor o rim direito, conforme descrito para o rim esquerdo em passos 2.1 a 2.10, exceto Coloque o mouse sobre seu lado esquerdo.
2. Colocar o rim direito sobre o linho e limpar gordura e tecido conjuntivo circundantes com fórceps rombudo.
3. Identificar a veia e artéria renal e em seguida coloque duas ligaduras (seda 3-0) cada com um único nó solto ao redor dos vasos. Tease suavemente o tecido conjuntivo e adrenal glândula da extremidade superior do rim em direção ao piloro médio do rim usando fórceps rombudo. Suavemente, deslocar o ureter da extremidade inferior e amarrar todos os vasos juntos (seda 3-0) sem causar sangramento.
4. Mover os dois nós de ligadura solta ao longo dos vasos. Um em direção ao lado da aorta abdominal e o outro para o lado do rim.
5. Primeiro amarrar o nó de ligadura (para o lado de aorta abdominal) com nó duplo; um nó sólido mudará a cor do rim direito. Amarrar o nó de ligadura (para o lado do rim) com nó duplo. Deixe espaço suficiente entre estes dois nós dobro a fim de cortar os vasos entre os dois nós sem cortar os maçaricos de ligadura.
6. Cortar os vasos renais entre os dois nós e remover o rim direito. Verifique possível sangramento dos vasos renais.
7. Secar o rim direito, usando gaze estéril e pesá-lo
8. Fechar a incisão do músculo com sequência de sutura de seda 4-0 e, em seguida, feche a incisão da pele com sequência de sutura de seda 3-0.
9. De casa o mouse separadamente em uma gaiola limpa solitário com uma lâmpada de calor sobre a gaiola (passo 2.15), com fácil acesso à água e comida para pelo menos 24 h para recuperação. Administrar a penicilina e a buprenorfina cada 12 h por 3 dias para evitar infecção e dor.
   Nota: O mouse deve recuperar do trauma da cirurgia dentro de 2-3 dias e deve ser volta ao normal de comer, a beber e a mover-se.
10. Após a cirurgia, monitorar os ratos duas vezes ao dia por três dias e depois uma vez por dia para a duração do experimento. Siga os procedimentos de monitorização e tratamento pós-cirúrgicos descritos na etapa 2.16.

4. Sham a cirurgia

1. para a cirurgia de Souza, executar os mesmos procedimentos de cirurgia, incluindo a exposição do rim, dissecação de tecido e o fechamento da ferida, mas sem a ligadura de polo do rim esquerdo ou remoção do rim direito.

5. avaliação de miocardiopatia urêmica Experimental

1. um dia antes do sacrifício, executar uma ecocardiografia transtorácica e capturar imagens ¹⁸.
   Nota: Aqui, a Ecocardiografia transtorácica foi realizada com um mouse tratamento tabela e termômetro retal. As imagens ecocardiográficas foram capturadas usando um 18-38 MHz funcionamento transdutor de frequência ligado a um sistema da imagem latente. Espessura de parede relativo (RWT), índice de desempenho miocárdico (MPI) e índice de massa de ventrículo esquerdo (LVMI) foram calculados como descrevemos ¹⁸.
2. Na hora do sacrifício, medir o peso do corpo. Hematócrito (HCT) com uma centrífuga HCT conforme fabricante ' instruções s. Prepare as amostras de plasma utilizando tubos revestidos por heparina por centrifugação por 10min a 1.500 x g a 4 ° C em uma centrífuga de mesa refrigerada as amostras de sangue. Medir a cistatina C, creatinina e usando kits de seguir o fabricante ' instruções s. Realizar as medições em duplicado.
3. No final do experimento, anestesiar os ratos com cetamina (90 mg/kg, IP) e xylaxine (10 mg/kg, IP) e sacrificar-se por toracotomia. Medir o peso do coração após removê-lo do peito. Prepare cardíaco (LV) e rim homogenates, bem como a determinação do colágeno tipo 1 (COL-1), a fosforilação de carbonilação c-Src e proteína, como descrito antes ^{18 , 19}.

Resultados

Os dados indicaram que este modificado 5/6^th PNx modelo pela ligadura de polo é um modelo simples e eficaz para investigar miocardiopatia urêmica. No pós-operatório de quatro semanas, este PNx modelo apresenta deficiência da função renal, anemia, hipertrofia cardíaca, Fibrose cardíaca e diminuição da função sistólica e diastólica do coração. Os resultados estão resumidos a seguir.

No...

Discussão

O rato 5/6^th PNx modelo tem sido amplamente utilizado para estudar CKD. Devido o muito rim tamanho menor no mouse, a ligadura da artéria clássica e ressecção de polo são muito desafiadores em modelos do rato com possíveis altas taxas de mortalidade e inesperado sangramento/hemorragia.

Adotamos um modelo de PNx rato com ligadura de polo para superar a perda de sangue/hemorragias. Este modelo de PNx leva menos tempo com a taxa de sobrevivência melhorada e alta reprodutibilidade...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Iris Scissors, 11.5 cm, Straight	World Precision Instruments	501758
WPI Swiss Tweezers #5 11 cm, 0.1x0.06 mm Tips	World Precision Instruments	504506
Jewelers #5 Forceps, 11cm, Straight, Titanium	World Precision Instruments	555227F
Iris Forceps, 10cm, Straight, Serrated	World Precision Instruments	15914
Tweezers #3, 11cm, 0.2x0.4mm Tips	World Precision Instruments	501976
Medesy Iris 4.5" Curved Scissors, Stainless Steel	Net23	3512	www.Net32.com
Dr. Slick Iris Scissors; 3.5"	Avid Max	220-1-965-IrisScsrs-P	www.Avid Max.com
Miltex Iris Scissors 4 1/8" Curved	4mdmedical	V95-306	www.4mdmedical.com
5" Hemostat clap, curved jaw	PJTool	4355	www.pjtool.com
sklar Knapp Iris scissors, straight and sharp/blunt 4"	Medical Device depot	64-3430	www.medicaldevicedepot.com
Kelly Hemostatic Forceps straight 5.5"	Pilgtimmedical	FA710-50	www.pilgtimmedical.com
C57BL/6 mice	Hilltop Lab Animals Inc.
Mouse Handling Table and rectal thermometer	Visualsonics
MicroScan transducer	Vevo 1100	MS400
Vevo 1100 Imaging System	FUJIFILM VisualSonics Inc.
Cystatin C ELISA kit and mouse creatinine kit	Crystal Chem. Inc.
Mouse BUN ELISA kit	MyBioSource Inc