In Vitro et In Vivo la détection des Mitophagy dans les cellules humaines, C. Eleganset la souris

Résumé

Mitophagy, le processus de compensation endommagée mitochondries, est nécessaire au maintien de l’homéostasie et de la santé mitochondriale. Cet article présente certaines de la mitophagy dernière méthodes de détection dans les cellules humaines, Caenorhabditis eleganset la souris.

Résumé

Les mitochondries sont les puissances des cellules et produisent de l’énergie cellulaire sous forme d’ATP. Dysfonctionnement mitochondrial contribue au vieillissement biologique et une grande variété de troubles y compris les maladies métaboliques, maladies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer (ma) et la maladie de Parkinson (MP) et les syndromes de vieillissement prématuré. Maintien d’une santé mitochondriale dépend de la biogenèse mitochondriale et le déminage efficace de dysfonctionnels mitochondries par l’intermédiaire de mitophagy. Des méthodes expérimentales pour détecter avec précision l’autophagie/mitophagy, en particulier dans des modèles animaux, ont été difficiles à développer. Les progrès récents vers la compréhension des mécanismes moléculaires de mitophagy a permis le développement de techniques de détection de nouveaux mitophagy. Ici, nous présentons plusieurs techniques polyvalents pour surveiller les mitophagy dans les cellules humaines, Caenorhabditis elegans (p. ex., Rosella et souches DCT-1 / LGG-1) et les souris (mt-Keima). Une combinaison de ces techniques de détection de mitophagy, y compris l’évaluation interspécifique, améliorera la précision des mesures mitophagy et conduire à une meilleure compréhension du rôle de mitophagy dans la santé et la maladie.

Introduction

Mitophagy est essentiel pour fonctionnement mitochondrial. Les mitochondries croisent de multiples voies de signalisation de cellulaire et sont des organites subcellulaires universels responsables de la production d’énergie cellulaire et métabolisme cellulaire calcium homeostasis^{1,2,3, 4}. mitochondries constamment expérience défis provenant de sources endogènes et exogènes, tels que les espèces réactives de l’oxygène (ROS) et substances toxiques mitochondriales, respectivement, qui conduisent à la génération des « âgés » et dysfonctionnels mitochondries. Diminue l’efficacité de la production d’ATP tout en augmentant la quantité de ROS nuisibles accumulation des mitochondries endommagés et a été liée à des maladies liées au vieillissement telles que les maladies métaboliques, AD et PD^1,5,6 . Pour éviter tout dysfonctionnement cellulaire induite par les mitochondries, cellules nécessité de reconnaître spécifiquement endommagé les mitochondries et leur enlever efficacement grâce à un processus cellulaire appelé autophagie mitochondriale (mitophagy). Cela démontre l’importance des mitophagy en santé et maladie illustre la nécessité de méthodes précises et efficaces détecter les mitophagy in vitro et in vivo.

Mitophagy est un processus de plusieurs étapes impliquant de nombreuses protéines et protéines complexes^5,7,8. En bref, une mitochondrie endommagée est tout d’abord reconnue et engloutie par une double membrane phagophore, qui peut provenir de la membrane plasmique, réticulum endoplasmique, appareil de Golgi, noyau ou mitochondrie lui-même^9,10. Le phagophore sphérique s’allonge et finalement scelle les mitochondries à l’intérieur, qui constitue l’autophagosome mitochondriale (mitophagosome). Le mitophagosome fusionne alors avec le lysosome pour dégradation, formant un autolysosome dans lequel la mitochondrie endommagée est dégradée et recyclé^7,8. Principales protéines autophagiques également impliqués dans mitophagy comprennent : Autophagy Related 7 (ATG7) et Beclin1 (initiation), protéine Microtubule-Associated 1 a/1 b-Light Chain 3 (LC3-II) (LGG-1 s elegan c.) et p62 (composants de phagophore), et glycoprotéine de la membrane lysosomale associés à 2 (LAMP2)^6,7. En outre, il y a plusieurs protéines essentielles propres à mitophagy, y compris induite par le gène PTEN putatif Kinase 1 (rose-1), Parkin1, Dot nucléoprotéines 52 kDa (NDP52), optineurin, BCL2 Interacting Protein 3 comme (NIX/BNIP3L) (DCT-1 chez c. elegans), entre autres^5,6,11.

Une méthode courante pour détecter des changements dans les niveaux de l’autophagie est par le ratio du LC3-II/LC3-I ou LC3-II/actine. Toutefois, cette méthode est non spécifique, comme une augmentation de ce ratio peut refléter une ouverture accrue ou une fusion avec facultés affaiblies de mitophagosome au lysosome¹². Une autre méthode consiste à évaluer la colocalisation entre un marqueur d’autophagie (p. ex., LC3) et une protéine mitochondriale (p. ex., Translocase of externe mitochondriale Membrane 20 (TOMM20, qui peuvent être dégradés par protéasomes)). Cependant, ceci peuvent seulement indiquer les changements dans les niveaux de mitophagy total et ne peut pas distinguer les étapes à laquelle blocage se produit. Cela peut être clarifié en utilisant des inhibiteurs lysosomales (p. ex., E64d + pepstatine A, appelés EP) en parallèle pour causer l’accumulation de mitophagosomes. La différence entre le nombre de mitophagosomes au départ et le nombre de mitophagosomes après un traitement avec l’EP peut indiquer mitophagy. Ces limitations ont incité le développement de techniques de détection de nouveaux mitophagy. Compte tenu de l’importance croissante des mitophagy dans un large éventail de maladies humaines, nous présentons plusieurs techniques de détection de mitophagy robuste qui peuvent être utiles pour les chercheurs. Nous couvrir les techniques in vitro et in vivo et recommandons de combiner plusieurs techniques pour vérifier les changements de mitophagy.

Protocole

Animaux (souris mâles et femelles) est nés et élevés dans une animalerie accrédité, conformément et approbation de la Commission de l’emploi et de NIH animalier. Méthodes d’euthanasie doivent être conformes à toutes les réglementations nationales et institutionnelles.

1. détection de Mitophagy dans les cellules humaines

1. Détection de mitophagy à l’aide de plasmide mt-Keima
   Remarque : La protéine Keima, fusionnée à un signal de cible des mitochondries, simplifié en mt-Keima, s’est avérée utile pour la détection in vivo mitophagy. MT-Keima est une protéine fluorescente ratiométrique sensibles au pH, qui présente une fluorescence verte (excitation 458 nm) dans des conditions de base ou neutres et fluorescence rouge (excitation 561 nm) dans des conditions acides. Des mitochondries saines se développent dans des conditions de base ou neutres (pH 7-8) et sont indiqués par une fluorescence verte lorsque transfectées avec mt-Keima. Lorsque les mitochondries subissent mitophagy et fusionnent avec les lysosomes acides, le pH descend à 4,5 et mitochondries contenant mt-Keima présentent une fluorescence rouge^6,13,14. Ce qui est important, mt-Keima est résistante aux protéases lysosomales, permettant l’évaluation des mitophagy sur de longues périodes. Le protocole ci-dessous est conçu pour les plaques 6 puits.
   1. Jour 1 : Utiliser des cellules humaines primaires (par exemple, les fibroblastes) ou immortalisé les cellules humaines (par exemple, les cellules Hela ou U2OS cellules). Graines environ 0,3 à 1 × 10⁶ cellules/puits (selon le taux de croissance de cellules pour permettre aux cellules d’atteindre 70 % confluence le lendemain) dans une plaque 6 puits. Maintenir les cellules dans un milieu de culture cellulaire complet (Eagle modifié (DMEM) additionné de Dulbecco avec 10 % SVF et 1 % solution de pénicilline-streptomycine mixte) et incuber dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C (20 % O₂, 5 % CO₂ ). Ajouter 1 mL, milieu de culture cellulaire complet/puits dans une plaque 6 puits.
      Remarque : Gène surexpression/knockdown ou médicaments traitements peuvent s’effectuer à ce stade⁶.
   2. Jour 2 : Mélanger de l’ADN plasmidique mt-Keima⁶ et réactif de transfection d’ADN (le mélange pour un puits d’une plaque de 6 puits).
      1. Diluer 15 µL d’un réactif de transfection d’ADN avec 150 µL de milieu sans sérum selon le protocole du fabricant.
      2. Diluez 2 à 5 µg d’ADN plasmidique mt-Keima avec 150 µL de milieu sans sérum.
      3. Ajouter dilué mt-Keima plasmide de réactif dilué de transfection des ADN, Vortexer pendant 10 s et incuber pendant 10 min à température ambiante.
         Remarque : L’optimisation des conditions de la transfection d’ADN peut être nécessaire en fonction de la taille de la plaque (voir protocoles de la manufacturers' pour plus de détails).
      4. Ajouter le mélange réactif ADN/transfection goutte aux cellules, puis secouez les plaques doucement pendant 5-10 s jusqu'à ce que la solution est complètement mélangée.
   3. Jour 3 : Changer les médias en remplaçant le milieu de réactif contenant de l’ADN transfection avec milieu de culture cellulaire complet frais (1 mL/puits).
   4. Jour 4 : Image les cellules à l’aide de la microscopie confocale⁶. Utiliser les deux canaux d’imagerie : canal vert (excitation 458 nm, émission 570-695 nm) pour visualiser les mitochondries normales et canal rouge (excitation 561 nm, émission 570-695 nm) pour visualiser les mitochondries qui sont en cours de mitophagy. L’image au hasard 20 zones sous un grossissement de x 40 pour un montant total de 100-200 cellules dans chaque cupule.
   5. Effectuer l’analyse des données. Calculer l’indice de « mitophagy » (pourcentage des mitochondries en cours de mitophagy), à l’aide de logiciels d’analyse image de quantifier la quantité de fluorescence dans les canaux rouges et verts : prendre le ratio de la fluorescence rouge à fluorescence rouge + vert, et multiplier par 100⁶.
      NOTE : Solutions de rechange de transfection incluent l’utilisation de lignes mt-Keima stablement exprimé aux cellules HeLa¹⁴. Étant donné que les cellules HeLa n’expriment pas de Parkin, Parkin doit être exprimé stablement Etudier mitophagy Parkin-dépendante dans cette lignée cellulaire.
2. Détection de mitophagy à l’aide de la colocalisation entre sous-unité d’oxydase du Cytochrome C II (restriction) et LAMP2
   Remarque : La restriction est une protéine de la membrane interne mitochondriale génome encodé. Le « indice de mitophagy » égale le rapport entre la restriction colocalisée avec LAMP2 exprimée en pourcentage du montant total de la restriction.
   1. Les cellules HeLa (ou autres cellules d’intérêt mentionnée à l’étape 1.1.1) de graines dans une lame de 4 puits chambre (1-5 × 10,⁴ cellules dans 1 mL, milieu de culture cellulaire complet/puits) dans une cellule culture incubateur à 37 ° C (20 % O₂, 5 % de CO₂) pendant la nuit.
   2. Ajouter 3,0 µL de carbonyle 10 mM - 4-(trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP) de cyanure et incuber dans l’incubateur de culture cellulaire (étape 1.2.1) pendant 3 h.
      Remarque : Autres médicaments affectant les mitophagy peuvent être utilisés.
   3. Enlever le milieu de culture à l’aide d’une pipette 1 mL, laver les cellules deux fois avec 1 mL/bien du froid (0-4 ° C) 1 x PBS. Laisser la solution reposer 10-30 s avant le prochain lavage. Puis ajouter 0,5 mL de paraformaldéhyde à 3,7 % (PFA) en solution 1 PBS x dans chaque puits et incuber pendant 10 minutes sur la glace pour fixer les cellules.
      ATTENTION : PFA est la toxine. Travailler sous une hotte lorsque vous utilisez PFA.
   4. Jeter la solution de la PFA à l’aide d’une pipette 1 mL, laver les cellules deux fois avec froid 1 X PBS (1 mL/puits ; laissez la solution reposer pendant 10 s avant le prochain lavage) et permeabilize les cellules avec 1 mL/puits de 0,25 % de détergent (dans du PBS 1 x) pendant 10 minutes sur la glace.
   5. Jeter le tampon perméabilisant, laver délicatement les cellules deux fois avec froid 1 x PBS et jeter (laissez la solution reposer pendant 10 s entre les lavages). Bloquer les cellules avec 1 mL/puits de 5 % FBS dans du PBS 1 x nuit à 4 ° C. Couvrir les chambres afin d’éviter la perte d’humidité.
   6. Préparer les 0,5 mL/puits d’une solution d’anticorps mixte d’anticorps de restriction (souris, dilution de 1/250) et anticorps LAMP2 (lapin, dilution 01:20-01:50) dans du PBS 1 x 5 % FBS, et le magasin sur la glace pour 0,5 à 1 h.
   7. Retirez la lame de 4 puits chambre de la chambre froide et jeter la solution de saturation avec une pipette de 1 mL. Laver délicatement les cellules deux fois avec 1 mL/puits de froid 1 x PBS et jeter (laissez la solution reposer pendant 10 s entre les lavages), puis ajouter 0,5 mL/ainsi de solution mixte d’anticorps. Incuber à 37 ° C pendant 1 heure sur un agitateur à faible vitesse.
   8. Jeter la première solution d’anticorps à l’aide d’une pipette 1 mL et délicatement laver les cellules trois fois avec 1 mL/puits de PBS 1 x contre le rhume et la jeter. Laissez la solution se trouve pour 10 s avant le prochain lavage. Ajouter 1 mL/puits des anticorps secondaires fluorescents (p. ex., anti-lapin de chèvre avec nm de longueur d’onde 568 de la protéine fluorescente rouge (DP) pour LAMP2 ; et chèvre anti-souris avec nm de longueur d’onde 488 de la protéine fluorescente verte (GFP) pour restriction) en dilution de 1/250 avec 5 % FBS dans du PBS 1 x. Recouvrir la lame de 4 puits chambre avec du papier aluminium et incuber à 37 ° C pendant 1 heure sur un agitateur à faible vitesse.
   9. Jeter la deuxième solution d’anticorps avec une pipette de 1 mL. Laver délicatement les cellules six fois avec 1 mL/puits de PBS 1 x contre le rhume. Laisser la solution pendant 1 min avant le prochain lavage.
   10. Monter les cellules avec 50 µL/puits de milieu de montage antifade au DAPI et ajoutez les lamelles.
   11. Les cellules sous un microscope confocal avec 66 x huile d’immersion et de grossissement d’image (tuile scanne / mosaïques peuvent être utilisés pour augmenter le nombre de cellules par le logiciel). Utiliser les mêmes paramètres tels que la durée de l’exposition de canal, gain numérique, offset numérique, etc. tout au long de l’imagerie tout processus (voir instructions de logiciel pour plus de détails)¹⁵.
   12. Logiciel d’analyse de colocalisation utilisation d’analyser quantitativement au moins 20 images aléatoires de 100 cellules¹⁵. Utilisez la fonction « Bézier fermée » pour sélectionner des cellules individuelles ensemble. Comparer le coefficient de colocalisation de la Pearson de GFP de DP, pondéré ou non pondéré, pour déterminer les niveaux de mitophagy dans les cellules analysées. Maintenir les valeurs de réticule horizontal et vertical du logiciel d’analyse colocalisation tout au long de l’analyse. Pour définir correctement ces réticules, préparer deux séries supplémentaires de cellules et étiqueter une restriction et les autres LAMP2. Ensuite, affectez à réticule directement au-dessus de la distribution des pixels pour chaque canal¹⁵ (voir les instructions du logiciel pour plus de détails).
3. Un haut débit d’imagerie de mesure pour le dépistage de la mitophagy
   Remarque : Effectuer des écrans à haut débit de composés induisant mitophagy ou inhibant la mitophagy de grandes bibliothèques composés est techniquement difficile. Une technique d’imagerie basée sur la co-localisation des mitochondries avec autophagosomes est une alternative plus simple, mais très sensible pour mitophagy¹⁶de dépistage.
   1. Jour 1 : Semences de cellules (par exemple, les fibroblastes humains primaires à 5 000 cellules/100 mL cell culture media/puits) dans une plaque à 96 puits (voir étape 1.1.1).
   2. Jour 2 : Traiter les cellules dès le deuxième jour avec FCCP ou autres composés d’intérêt pour les temps d’incubation désigné (voir étape 1.2.2).
   3. Suivez les étapes 1.2.2-1.2.9 utilisant les anticorps primaires de restriction (souris, dilution de 1/250 avec 5 % FBS dans du PBS 1 x) et LC3B (lapin, 1/100-dilution de 1 : 200 avec 5 % FBS dans du PBS 1 x). Par ailleurs, les anticorps primaires pour restriction et LAMP2 peuvent être utilisés.
   4. Les cellules à l’aide d’un lecteur de fluorescence¹⁶de l’image. Recueillir les images dans les champs placés au hasard et avec un minimum 500 cellules/puits.
   5. Analyser les données à l’aide d’une cellule analyseur personnalisé protocole¹⁶.

2. détection des Mitophagy chez c. elegans

Remarque : Le nématode c. elegans fournit une plate-forme pour doser mitophagy au niveau de l’organisme. Deux souches peuvent être utilisés pour surveiller mitophagy : Rosella (1) les mitochondries ciblées (mtRosella) ou mitophagy (2) récepteurs DCT-1 fusionnée à la GFP avec marqueur autophagosomal LGG-1 fusionné avec Acropora SP. protéine fluorescente rouge (DsRed)^{5, 17}.

1. Mitophagy surveillance d’un biocapteur Rosella
   NOTE : Rosella est un biocapteur moléculaire qui combine un pH insensible DsRed fusionnée à une variante GFP sensibles au pH. Le biocapteur Rosella tire parti des différences entre le lysosome acide (pH ~ 4,5) et d’autres compartiments cellulaires pH. Ce biocapteur a été utilisé pour contrôler avec succès mitophagy dans Saccharomyces cerevisiae et de plusieurs lignées cellulaires de mammifères, tels que HeLa HEK293 et HCT116^18,19. Nous adapté ce journaliste polyvalent de double-fluorescentes et généré transgéniques c. elegans nématodes exprimant axés sur les mitochondries Rosella (mtRosella) dans les cellules musculaires paroi corporelle. Induction de Mitophagy est indiquée par un ratio GFP/DsRed réduit de fluorescence de la mtRosella.
   1. Jour 1 : Pick L4 larves vers exprimant axés sur les mitochondries Rosella (mtRosella) dans les cellules musculaires paroi corporelle sur une plaque de croissance de nématode Media (NGM) ensemencée avec e. coli (OP50) à l’aide d’un microscope de dissection⁵. Placer les vers/plaque de 10-20 au moins trois plaques de 3,5 cm. Incuber les nématodes à la température standard de 20 ° C⁵.
      Remarque : Voir la référence pour l’anatomie du ver, y compris l’identification des larves de L4²⁰et la façon de faire un choix qui permet de transférer vers d’un endroit à un autre²¹.
   2. Jour 5 : Synchroniser les nématodes en sélectionnant 15-20 larves transgéniques de L4 et leur transfert sur frais OP50 boutonnée plaque NGM. Utiliser au moins cinq plaques par condition expérimentale.
   3. Jour 7 : Préparer les plaques des véhicules pour les médicaments qui affectent le mitophagy des intérêts ou des témoins positifs.
      1. Tuer les bactéries e. coli (OP50) ensemencées en exposant des plaques NGM pendant 15 min avec 222 µW/cm² (intensité) de la lumière UV pour s’assurer que les composés induisant la mitophagy ne sont pas métabolisés par les bactéries. Plaques doivent être exposés avec 2 000 J/m².
         NOTE : Secondes d’exposition nécessaire = 2 000/((intensity in µW/cm²) * 100).
      2. Ajouter des composés d’intérêt vers le haut des plaques NGM ensemencés. Ajouter une quantité équivalente de véhicule composé (solvant utilisé pour dissoudre les composés, tels que le diméthylsulfoxyde (DMSO)) sur la plaque du véhicule comme témoin négatif. Pour un contrôle positif de l’induction de la mitophagy, une substance toxique mitochondriale, le paraquat (concentration finale de 8 mM) a été utilisé. Ajouter une solution contenant 10 µL de stock de paraquat de 8 M avec 190 µL de ddH₂O sur le dessus de la gélose pour le groupe de traitement. Pour le groupe de véhicule, ajouter une solution contenant 10 µL de DMSO avec 190 µL de ddH₂O sur le dessus de la gélose.
         NOTE : La solution de travail du paraquat peut se conserver pendant 1 mois à 4 ° C.
      3. Agiter doucement les plaques jusqu'à ce que la drogue ou véhicule recouvre toute la surface. Laisser les plaques à sécher avec le couvercle fermé à température ambiante pendant au moins 1 h avant de transférer les vers.
         NOTE : Plaques de drogue peuvent également être préparés en ajoutant des médicaments dans le liquide NGM avant elle se solidifie.
   4. Jour 7 : Transfert de 10-20 d’âgés de 2 jours adultes animaux transgéniques préparées à l’étape 2.1.2 aux plaques contenant soit le paraquat, composés des intérêts, ou d’un véhicule (DMSO). Incuber les animaux transgéniques à 20 ° C pendant 2 jours.
   5. Jour 9 : Préparer 2 % d’agarose tampons (voir Documents supplémentaires). Puis ajoutez une goutte (10 µL) de 20 mM levamisole en M9 par pad. Immobiliser les animaux transgéniques pour l’imagerie, en les plaçant dans la chute de M9-levamisole. Placez délicatement une lamelle sur le dessus.
   6. Capturer des animaux transgéniques à l’aide d’une caméra attachée à un microscope à épifluorescence. Acquisition d’images fluorescentes de nématodes ensemble transgéniques exprimant des mtRosella dans les cellules musculaires paroi corporelle de grossissement 10 X⁵. Enregistrer les images recueillies.
   7. Traiter les images acquises avec les logiciels ImageJ. Analyser les cellules de muscle de paroi corporelle situés dans la tête du ver pour éviter l’autofluorescence dans les tissus intestinaux. Mesurer la moyenne intensité valeur et total zone de pixels pour chaque image fluorescente seulement de la région céphalique de chaque animal. Pour analyser la zone d’intérêt :
      1. Sélectionnez « split canal » sous le menu déroulant « image » et « color » de convertir des images.
      2. Utiliser l’outil « sélection à main levée » pour capturer la zone fluorescente d’intérêt.
      3. Sélectionnez la commande « mesure » dans le menu déroulant « analyser » et effectuer une analyse d’intensité pixel.
      4. Intensité de pixels doit être normalisée en divisant l’intensité de la superficie totale analysée. Après normalisation, calculer la GFP DsRed ratio²².
   8. Utiliser l’analyse statistique logiciel soit conduite de student t-test (comparaison entre les deux groupes) ou ANOVA (comparaison entre plusieurs groupes) pour l’analyse statistique p < 0,05 comme significatives^5,17 .
2. Évaluation de mitophagy à l’aide de co-localisation entre DCT-1 et 1-LGG
   Remarque : Le DCT-1 est une protéine de la membrane mitochondriale externe qui agit comme un récepteur de mitophagy en réponse au stress des conditions, semblables à ses orthologues putatif BNIP3 et NIX/BNIP3L mammifères⁵. Ainsi, mitophagy initiation évalue la co-localisation entre mitophagy du récepteur et autophagosomal protéine membranaire DCT-1 LGG-1 (homologue de la LC3 chez les mammifères).
   1. Jour 1 : Pick L4 larves d’animaux transgéniques exprimant la DCT-1::GFP et DsRed::LGG-1 dans la paroi corporelle muscle cellules⁵ sur un OP50 ensemencé plaque NGM. Placer 5 à 10 vers/3.5 cm plaque et utiliser au moins trois besants. Incuber les nématodes à 20 ° C.
      Remarque : Les transgènes sont situés sur des plasmides distincts et ils ne sont pas intégrés dans le génome. Ramasser les nématodes, les rol-6(su1006) et p_myo-2 marqueurs de contransformation GFP. Seulement vers transgéniques avec les deux marqueurs contransformation expriment la DCT-1::GFP et DsRed::LGG-1 dans les cellules musculaires paroi corporelle.
   2. Suivez les étapes de 2.1.2-2.1.5.
   3. Image simple paroi corporelle les cellules musculaires à l’aide d’une caméra attachée à un microscope confocal^5,23. Détecter les bordures de cellules de muscle de toute paroi corporelle et z-pile de prendre des images moins 63 x grossissement. Un grossissement supérieur peut également être utilisé.
   4. Ouvrir et traiter les images obtenues avec le logiciel confocal. Ouverture de mitophagy est indiqué par la co-localisation des récepteurs mitophagy (DCT-1::GFP) jusqu'à la borne autophagosomal (DsRed::LGG-1). Manuellement mesurer les événements de colocalisation dans chaque pile de paroi corporelle muscle cellule⁵. Il est essentiel pour assurer la cohérence tout au long des expériences de tous les paramètres de microscope et caméra (lentille et loupe, filtres, durée d’exposition, résolution, intensité du laser, gain, etc.). A noter tous les réglages.
   5. Utiliser l’analyse statistique logiciel soit conduite de student t-test (comparaison entre les deux groupes) ou ANOVA (comparaison entre plusieurs groupes) pour l’analyse statistique p < 0,05 comme significatives^5,17 . Usage de comparaisons bidirectionnelles de la Student t-test (p < 0,05 est considérée comme significative). Pour les comparaisons multiples utilisez l’analyse de variance simple facteur (ANOVA), corrigé par le test post hoc de Bonferroni. Nous vous recommandons d’analyser au moins 50-70 animaux ou des cellules de muscle de paroi corporelle de 30 à 50 pour chaque condition expérimentale. Réitérer l’expérience au moins trois fois.

3. détection des Mitophagy chez la souris

NOTE : Des méthodes précédentes pour détecter les mitophagy chez les souris étaient encombrantes, insensible et difficile à quantifier. Un modèle de souris transgénique exprimant la forme mitochondriale ciblée du reporter fluorescent Keima (mt-Keima) peut maintenant être utilisé afin d’évaluer les niveaux de mitophagy dans un large éventail de conditions physiologiques et physiopathologiques.

1. Euthanasier la souris à l’aide d’un protocole approuvé par l' animalier institutionnel et Comité d’utilisation¹⁴.
2. Fixez la souris (face ventrale vers le haut) à la plate-forme de travail à l’aide de goupilles dans les membres. Faites une incision dans le bas ventre à l’aide de ciseaux de microchirurgie et forceps pour exposer le foie²⁴. Couper un morceau de foie (par exemple, un morceau de lobe droit à 1 × 1 × 1 cm) à l’aide de ciseaux de microchirurgie et de forceps.
   NOTE : Détection de mitophagy chez la souris est complexe et nécessite des connaissances sur l’anatomie de souris et de manipulation de la souris très habile et de chirurgie de la souris. Ce protocole prévoit des étapes fondamentales, clés sur cette méthode et une méthode plus détaillée est disponible²⁴.
3. Placer l’échantillon du foie sur une plaque métallique sur la glace pour refroidir rapidement les tissus. Garder le tissu sur la plaque de métal froide et traiter le plus rapidement possible. Idéalement, utilisez moins de 1 h de la dissection.
4. Soulevez l’échantillon du foie avec une pincette courbée et rincer avec 5 mL de PBS glacée 1 x.
5. Transférer le foie dans une boîte de Pétri (Ø 100 mm) sur la glace à l’aide de l’extrémité de la cuillère d’une spatule.
6. Couper l’échantillon du foie à la main dans 0,5 à 1 coupes mm d’épaisseur à l’aide de lames seul bord.
7. Transvaser avec soin les sections de tissu pour un plat de dessous de verre avec une pincette de microchirurgie.
8. Poser soigneusement la section du foie avec une pince pour l’aplatir sur le fond.
9. Couvrir le foie en tranches de 3-5 gouttes de PBS 1 x contre le rhume.
   NOTE : La coloration DAPI est recommandée pour identifier la zone d’intérêt dans certains tissus (p. ex., cerveau)²⁴. Pour valider la co-localisation du signal rouge TM-Keima avec le lysosome, lysosomales colorants, comme le dextran cascade bleu et lysosensor, peuvent être utilisé²⁴.
10. Les sections de tissu sous microscopie confocale, par l’intermédiaire de deux excitations séquentielle²⁴de l’image. Set de deux canaux d’imagerie : « vert » canal mt-Keima (excitation 458 nm, émission 570-695 nm estimés) et « rouge » mt-Keima (excitation 561 nm, émission 570-695 nm estimés). Gérer des paramètres d’imagerie entre des conditions expérimentales. Pour l’imagerie plus efficace, analyser deux animaux en même temps.

Résultats

Détection des Mitophagy dans les cellules humaines :

À l’aide de la procédure présentée ici, l’humains cellules HeLa ont été transfectées avec mt-Keima plasmide. Cellules saines ont démontré un réseau bien organisé mitochondrial (GFP, 488 nm) avec une incidence peu de mitophagy (DP, 561 nm). Cependant, les cellules prétraitées avec un découpleur mitochondrial FCCP (30 µM pour 3 h) présentaient une augmentation...

Discussion

Une mesure précise de mitophagy est techniquement difficile. Ici, nous présentons plusieurs techniques robustes qui permettent les deux détection qualitative des mitophagy et quantification des niveaux mitophagy dans les modèles expérimentaux de laboratoire courantes.

Acquisition de données réplicables, un modèle expérimental au moins trois répétitions biologiques est nécessaire. Tous les chercheurs impliqués dans l’expérimentation et l’analyse doivent être aveugle aux ident...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
mt-Keima mouse	Jackson Laboratory
Lipofectamine 2000 DNA transfection reagent	Thermofisher	#11668027
Opti-MEM medium (Gibco)	Thermofisher	#31985062	serum-free medium
mtKemia plasmid: pCHAC-mt-mKeima	addgene	#72342
COXII antibody (mouse)	abcam	#ab110258
LAMP2 antibody (rabbit)	NOVUS	#CD107b
goat-anti-rabbit with wavelength 568 nm of red fluorescent protein (RFP)	Thermofisher	#Z25306	Alexa Fluor 568 dye
goat-anti-mouse with wavelength 488 nm of green fluorescent protein (GFP)	Thermofisher	#Z25002	Alexa Fluor 488 dye
prolong gold antifade with DAPI	Invitrogen	#P36931
6-well plate	SIGMA Corning Costar	#CLS3516
4-well chamber slide	THermofisher, Nunc Lab-Tek	#171080
Nunc F 96-well plate	Thermofisher	#152038
LC3B antibody rabbit	NOVUS	#NB100-2220
DNA antibody	Progen Biotechnik	#anti-DNA mouse monoclonal, AC-30-10
DAPI	Thermofisher	#D1306	antifade mounting medium with DAPI
IN Cell analyzer (fluorescent reader )	GE Healthcare Life Sciences	#IN Cell analyzer 2200
Eclipse TE-2000e confocal microscope	Nikon	#TE-2000e
Colocalization software	Volocity	#Volocity 6.3	alternative Zeiss ZEN 2012 software
IN Cell Investigator Software	GE Healthcare Life Sciences	#28408974
cell culture medium	Thermofisher	#DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermofisher	#15140122
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	#12003C-1000ML
Cell culture Incubator	Thermofisher	#Thermo Forma 3110 CO2 Water Jacketed Incubator
epifluorescence microscope	Zeiss		Zeiss Axio Imager Z2
camera	Olympus		Olympus DP71
confocal microscope	Zeiss		Zeiss Axio Observer Z1
confocal software	Zeiss		ZEN 2012
image analysis software	Image J	colocalization analysis, etc	https://imagej.nih.gov/ij/
statistical analysis software	GraphPad Software Inc., San Diego, USA		GraphPad Prism software package
material to make a worm pick	Surepure Chemetals	#4655	The pick is made of 30 gauge 90% platinum 10% iridium wire
IR: N2;Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella]	Material inquiry to Tavernarakis Nektarios		Maintain transgenic animals at 20 °C
IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1]	Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 TOMM-20::Rosella	Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
pdct-1 DCT-1::GFP	Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 DsRed::LGG-1	Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
Paraquat solution	see supplementary data for preparation
M9 buffer	see supplementary data for preparation
M9-levamisole buffer	see supplementary data for preparation
Glass Microscope Slides and Coverslips	Fisher Scientific	#B9992000
Surgical forceps	STERIS Animal Health	19 Piece Canine Spay Pack Economy
Surgical scissors	STERIS Animal Health	19 Piece Canine Spay Pack Economy
1x PBS	Thermofisher	#AM9625	10x PBS needs to be diluted to 1x PBS by using ddH2O
shaker	Fisher Scientific	#11-676-178	Thermo Scientific MaxQ HP Tabletop Orbital Small Open Air Platform Shaker Package A
2% agarose pad	see supplementary data for preparation
Vibroslice blades	World precision instruments	#BLADES-2	single-edge blade
metal plate	MSC	#78803988	0.012 in thick x 6 in wide x 12 in long, 430 Stainless Steel Sheet
Triton X-100			detergent
Methyl viologen dichloride hydrate	Sigma-Aldrich	#856177	paraquat
Incubator for nematodes	AQUALYTIC		Incubator to maintain 20 °C
Dissecting stereomicroscope	Olympus	SMZ645
Confocal microscope	Zeiss	AxioObserver Z1	For nematodes (step 2)
epifluorescence microscope	Zeiss	AxioImager Z2	For nematodes (step 2)
UV crosslinker	Vilber Lourmat	BIO-LINK – BLX-E365	UV light source; 356 nm