In Vitro e In Vivo de deteção de Mitophagy em células humanas, C. Eleganse os ratos

Resumo

Mitophagy, o processo de compensação danificada mitocôndrias, é necessário para a manutenção de saúde e homeostase mitocondrial. Este artigo apresenta alguns dos mitophagy mais recente métodos de deteção em células humanas, Caenorhabditis eleganse os ratos.

Resumo

As mitocôndrias são as potências de células e produzem energia celular na forma de ATP. Disfunção mitocondrial contribui para o envelhecimento biológico e uma grande variedade de doenças, incluindo doenças metabólicas, doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer (AD) e a doença de Parkinson (PD) e síndromes de envelhecimento prematuro. Manutenção da saúde mitocondrial depende de biogênese mitocondrial e eficiente apuramento das mitocôndrias disfuncionais através de mitophagy. Métodos experimentais para detectar com precisão a autofagia/mitophagy, especialmente em modelos animais, tem sido um desafio para desenvolver. Recentes progressos no sentido da compreensão dos mecanismos moleculares de mitophagy permitiu o desenvolvimento de técnicas de deteção de novela mitophagy. Aqui, apresentamos várias técnicas versátil para monitorar mitophagy em células humanas, Caenorhabditis elegans (por exemplo, Rosella e estirpes DCT-1 / IgG-1) e os ratos (mt-Keima). Uma combinação destas técnicas de deteção de mitophagy, incluindo a avaliação entre espécies, irá melhorar a precisão das medições mitophagy e levar a uma melhor compreensão do papel do mitophagy na saúde e na doença.

Introdução

Mitophagy é essencial para a manutenção mitocondrial. Mitocôndria celular múltiplas vias de sinalização se cruzam e é organelas celulares sub universais responsáveis pela produção de energia celular, metabolismo celular e cálcio homeostase^{1,2,3, 4}. as mitocôndrias constantemente experimentam desafios de fontes endógenas e exógenas, como espécies reativas de oxigênio (ROS) e tóxicos mitocondriais, respectivamente, que levam à geração de mitocôndrias disfuncionais e "envelhecidas". Acúmulo de mitocôndrias danificadas diminui a eficiência da produção de ATP, enquanto aumenta a quantidade de ROS prejudiciais e tem sido associado a doenças relacionadas com a idade, como doenças metabólicas, AD e PD^1,5,6 . Para evitar a disfunção celular mitocôndria induzida, necessidade de células especificamente reconhecer danificado mitocôndrias e eficientemente removê-los através de um processo celular denominado autofagia mitocondrial (mitophagy). Isto demonstrou a importância da mitophagy em saúde e doença ilustra a necessidade de métodos precisos e eficientes detectar mitophagy tanto in vitro e in vivo.

Mitophagy é um processo de várias etapas que envolvem muitas proteínas e complexos de proteína a^5,7,8. Em breve, uma mitocôndria danificada primeiro é reconhecida e tragada por um phagophore double-membraned, que pode se originam da membrana plasmática, retículo endoplasmático, complexo de Golgi, núcleo ou mitocôndria em si^9,10. O esférico phagophore alonga e eventualmente lacra as mitocôndrias no interior, que constitui o autophagosome mitocondrial (mitophagosome). O mitophagosome então se funde com o lisossomo para degradação, formando um autolysosome em que a mitocôndria danificada é degradadas e reciclados^7,8. Principais proteínas autophagic também envolvidas em mitophagy incluem: autofagia relacionados 7 (ATG7) e Beclin1 (iniciação), proteína Microtubule-Associated 1A/1B-luz corrente 3 (LC3-II) (LGG-1 em c. elegans) e p62 (componentes do phagophore), e glicoproteína de membrana lisossomal-associado 2 (luz2)^6,7. Além disso, há várias proteínas essenciais exclusivos para mitophagy, incluindo induzida por PTEN putativo quinase 1 (rosa-1), proteína Nuclear de ponto 52 kDa (NDP52), Parkin1, optineurin, BCL2 interagindo proteína 3 como (NIX/BNIP3L) (DCT-1 em c. elegans), entre outros^5,6,11.

Um método comum para detectar mudanças nos níveis de autofagia é pela relação de LC3-II/LC3-I ou II/LC3-actínio. No entanto, esse método é inespecífico, como um aumento desta relação pode refletir uma iniciação maior ou uma fusão prejudicada de mitophagosome a lisossoma¹². Outro método consiste em avaliar o colocalization entre um marcador de autofagia (por exemplo, LC3) e uma proteína mitocondrial (por exemplo, Translocase de exterior mitocondrial membrana 20 (TOMM20, que pode ser degradado por proteasomes)). No entanto, isto só pode indicar alterações nos níveis de mitophagy total e não consegue distinguir da execução no qual bloqueio ocorre. Isso pode ser esclarecido usando inibidores dos lisossomos (por exemplo, A E64d + Pepstatin, denominado EP) em paralelo para causar o acúmulo de mitophagosomes. A diferença entre o número de mitophagosomes na linha de base e o número de mitophagosomes após o tratamento com EP pode indicar mitophagy. Estas limitações têm solicitado o desenvolvimento de técnicas de deteção de novela mitophagy. Tendo em conta a crescente relevância da mitophagy em um amplo espectro de doenças humanas, apresentamos várias técnicas de deteção de mitophagy robusta que podem ser útil para pesquisadores. Podemos cobrir técnicas tanto in vitro e in vivo e recomenda combinar várias técnicas para verificar alterações de mitophagy.

Protocolo

Animais (ratos machos e fêmeas) nascidos e criados em instalações animais credenciadas, em conformidade e aprovação do Comité de uso e cuidado do Animal de NIH. Métodos de eutanásia devem ser coerentes com todas as regulamentações nacionais e institucionais.

1. detecção de Mitophagy em células humanas

1. Deteção de mitophagy usando mt-Keima do plasmídeo
   Nota: A proteína Keima, fundida a um sinal de mitocôndrias, simplificado como mt-Keima, revelou-se útil para em vivo deteção de mitophagy. MT-Keima é uma proteína fluorescente ratiometric sensíveis ao pH que apresenta fluorescência verde (excitação 458 nm) em condições básicas ou neutras e fluorescência vermelha (nm de excitação 561) em condições ácidas. Mitocôndrias saudáveis prosperam em condições básicas ou neutras (pH 7-8) e são indicadas por fluorescência verde quando transfected com mt-Keima. Quando mitocôndrias submeter-se mitophagy e se fundem com os lisossomos ácidos, o pH cai para 4,5 e mitocôndrias contendo mt-Keima apresentam fluorescência vermelha^6,13,14. Importante, mt-Keima é resistente às proteases lisossomais, permitindo avaliação de mitophagy durante períodos mais longos. O protocolo abaixo é projetado para placas 6-boas.
   1. Dia 1: Use células humanas primárias (por exemplo, fibroblastos) ou imortalizadas células humanas (por exemplo, células células Hela ou U2OS). Semente aproximadamente 0.3-1 × 10⁶ células/poço (dependendo da taxa de crescimento de célula para permitir que as células alcançar a confluência de 70% no dia seguinte) em uma placa de 6. Manter as células em meio de cultura celular completa (suplementado com 10% médio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco FBS e 1% misturaram solução de penicilina-estreptomicina) e incubá-los numa incubadora de cultura de célula a 37 ° C (20% O₂, 5% CO₂ ). Adicione 1 mL meio de cultura de célula completa/poço em uma placa de 6.
      Nota: Gene nocaute/superexpressão ou drogas tratamentos podem ser feitos a este estágio⁶.
   2. Dia 2: Mix mt-Keima Plasmideo DNA⁶ e reagente de Transfeccao de DNA (a mistura para um poço de uma placa de 6).
      1. Dilua a 15 µ l de reagente de transfeccao um DNA com 150 µ l de meio livre de soro, de acordo com o protocolo do fabricante.
      2. Dilua o µ g de 2-5 mt-Keima do ADN do plasmídeo com 150 µ l de meio livre de soro.
      3. Adicionar plasmídeo diluídos mt-Keima ao reagente de Transfeccao de DNA diluído, vórtice para 10 s e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.
         Nota: A otimização das condições de Transfeccao de DNA pode ser necessária dependendo do tamanho da placa (ver protocolos dos fabricantes para obter detalhes).
      4. Adicione a mistura de reagente de transfeccao/DNA gota a gota para células e, em seguida, agitar as placas suavemente durante 5-10 s até que a solução é completamente misturada.
   3. Dia 3: Altere os meios de comunicação, substituindo o meio de contendo reagente de Transfeccao de DNA com meio de cultura fresco célula completa (1 mL/poço).
   4. Dia 4: Imagem de células usando microscopia confocal⁶. Usar dois canais de imagem: canal verde (excitação 458 nm, emissão 695-570 nm) para visualizar as mitocôndrias normais e canal vermelho (excitação 561 nm, emissão 695-570 nm) para visualizar as mitocôndrias que estão passando por mitophagy. Aleatoriamente 20 áreas sob magnificação de x 40 para cobrir um total de 100-200 células em cada poço da imagem.
   5. Realizar análise de dados. Calcular o índice de"mitophagy" (percentual de mitocôndrias, passando por mitophagy), usando o software de análise de imagem para quantificar a quantidade de fluorescência em ambos os canais vermelho e verdes: tomar a relação da fluorescência fluorescência verde + vermelha, vermelha e Multiplique por 100⁶.
      Nota: Alternativas para transfeccao incluem o uso de linhas de célula HeLa mt-Keima expressado estàvel¹⁴. Uma vez que as células HeLa não expressam Parkin, Parkin deve ser expressos estàvel para estudar mitophagy Parkin-dependente nesta linha de celular.
2. Deteção de mitophagy usando o colocalization entre o subunit da citocromo C oxidase II (COXII) e luz2
   Nota: COXII é uma proteína da membrana mitocondrial interna com genoma codificado. O índice de' mitophagy' é igual a relação de COXII colocalized com luz2, expressado como uma percentagem do montante total de COXII.
   1. Semente de células HeLa (ou outras células de interesse mencionado na etapa 1.1.1) em um slide de câmara 4-poço (1-5 × 10⁴ células em meio de cultura de célula completa 1ml/poço) em uma célula cultura incubadora a 37 ° C (20% O₂, 5% CO₂) durante a noite.
   2. Adicione 3,0 µ l de carbonila 10mm cianeto - 4-(trifluorometoxi) phenylhydrazone (FCCP) e incube a incubadora de cultura celular (passo 1.2.1) para 3h.
      Nota: Outras drogas que afetam o mitophagy podem ser usadas.
   3. Remover o meio de cultura usando uma pipeta de 1 mL, lavar as células duas vezes com 1 mL/bem de frio (0-4 ° C) 1X PBS. Deixe a solução descansar por 10-30 s antes da próxima lavagem. Em seguida adicione paraformaldeído de 3,7% de 0,5 mL (PFA) em 1X PBS a cada poço e incubar durante 10 min no gelo para consertar as células.
      Cuidado: PFA é toxina. Trabalho em uma coifa quando usando PFA.
   4. Descartar a solução PFA usando uma pipeta de 1 mL, lavar as células duas vezes com frio 1 X PBS (1 mL/poço; deixar solução para 10 s antes da próxima lavagem) e permeabilize as células com 1ml/bem de 0,25% de detergente (em 1X PBS) por 10 min no gelo.
   5. Descartar o buffer de permeabilizing, lave suavemente as células duas vezes com frio 1X PBS e descarte (Deixe a solução descansar por 10 s entre lavagens). Bloquear as células com 1ml/bem de 5% FBS em 1X PBS durante a noite a 4 ° C. Cobrir as câmaras para evitar a perda de umidade.
   6. Preparar 0,5 mL/bem de uma solução de anticorpo misturado com anticorpo COXII (mouse, diluição de 1: 250) e anticorpo luz2 (coelho, diluição 01:20-01:50) em PBS 1x com 5% FBS e loja no gelo para 0,5-1 h.
   7. Pegue o slide 4-bem câmara do quarto frio e descartar a solução de bloqueio com uma pipeta de 1 mL. Lave delicadamente as células duas vezes com 1 mL/bem de frio 1X PBS e descarte (Deixe a solução descansar por 10 s entre lavagens), em seguida, adicionar 0,5 mL/bem de solução anticorpo misto. Incube a 37 ° C por 1h em uma coqueteleira com velocidade baixa.
   8. Descartar a primeira solução de anticorpo, utilizando uma pipeta de 1ml e delicadamente lavar as células três vezes com 1ml/bem de frio 1X PBS e descarte. Deixe a solução senta-se para 10 s antes da próxima lavagem. Adicionar 1 mL/poço de fluorescentes anticorpos secundários (por exemplo, cabra anticoelho com nm de comprimento de onda 568 de proteína fluorescente vermelha (RFP) para luz2; e anti-rato cabra com comprimento de onda 488 nm da proteína verde fluorescente (GFP) para COXII) na diluição de 1: 250 com 5% FBS em 1X PBS. Cobrir o slide de câmara 4-bem com papel alumínio e incubar a 37 ° C por 1h em uma coqueteleira com velocidade baixa.
   9. Descarte a segunda solução de anticorpo com uma pipeta de 1 mL. Lave delicadamente as células seis vezes com 1ml/bem de frio 1X PBS. Deixe a solução descansar por 1 minuto antes da próxima lavagem.
   10. Monte as células com 50 µ l/poço de meio de montagem antidesgaste com DAPI e adicionar lamínulas.
   11. As células sob um microscópio confocal com 66 x ampliação e imersão óleo de imagem (telha varreduras / mosaicos podem ser usados para aumentar o número de células, fotografada pelo software). Use as mesmas configurações como o tempo de exposição do canal, ganho digital, offset digital, etc. ao longo de toda imagem processos (ver instruções de software para obter detalhes)¹⁵.
   12. Software de análise de colocalization de uso para analisar quantitativamente pelo menos 20 imagens aleatórias de 100 células¹⁵. Use a função "Bezier fechado" para selecionar células individuais inteiras. Compare do colocalization de Pearson de GFP de RFP, ponderada ou giram, para determinar os níveis de mitophagy em células analisadas. Manter valores para mira horizontal e vertical de software de análise o colocalization em toda a análise. Para definir com precisão esses mira, preparar dois conjuntos extras de células e rotular um COXII e o outro luz2. Em seguida, defina a mira diretamente acima da distribuição de pixel para cada canal¹⁵ (ver instruções de software para obter detalhes).
3. Um alto throughput de medição para a seleção de mitophagy de imagem
   Nota: Executar telas de alta taxa de transferência de compostos mitophagy de indução ou inibição mitophagy de grandes bibliotecas de compostos é tecnicamente exigente. Uma técnica de imagem baseada no colocalization de mitocôndrias com autophagosomes é uma alternativa mais simples, mas altamente sensível para mitophagy¹⁶de triagem.
   1. Dia 1: Semente de células (por exemplo, fibroblastos humanos primários, 5.000 células/100 mL célula meios de cultura/poço) em uma placa de 96 poços (consulte a etapa 1.1.1).
   2. Dia 2: Tratar as células a partir do segundo dia com FCCP ou outros compostos de interesse para o tempo de incubação designado (ver passo 1.2.2).
   3. Siga os passos 1.2.2-1.2.9 usando os anticorpos primários para COXII (mouse, diluição de 1: 250 com 5% FBS em 1X PBS) e LC3B (coelho, 1: 100-diluição de 1: 200 com 5% FBS em 1X PBS). Alternativamente, os anticorpos primários para COXII e luz2 podem ser usados.
   4. As células usando um leitor fluorescente¹⁶da imagem. Recolha imagens em campos colocados aleatoriamente e com um mínimo 500 células/poço.
   5. Analise os dados usando um analisador personalizado célula protocolo n º¹⁶.

2. detecção de Mitophagy em c. elegans

Nota: O nemátodo c. elegans fornece uma plataforma para ensaio mitophagy no nível de organismos. Duas linhagens podem ser usadas para monitorar mitophagy: (1) as mitocôndrias-alvo Rosella (mtRosella) ou mitophagy (2) receptor DCT-1 fundido com GFP juntamente com marcador autophagosomal IgG-1 fundido com Discosoma SP. proteína fluorescente vermelha (DsRed)^{5, 17}.

1. Mitophagy monitoramento usando Rosella biosensor
   Nota: Rosella é um biossensor molecular que combina uma diferenciação de pH DsRed fundida a uma variante GFP sensíveis ao pH. O biosensor Rosella aproveita as diferenças de pH entre a lisossoma ácida (pH ~ 4,5) e outros compartimentos celulares. Este biosensor tem sido usado para monitorar com sucesso mitophagy em Saccharomyces cerevisiae e várias linhas de células de mamíferos, tais como HeLa, HEK293 e HCT116^18,19. Nós adaptado a este repórter dual-fluorescente versátil e gerado transgénicos c. elegans nematoides expressando mitocôndrias-alvo Rosella (mtRosella) em células de músculo do corpo-parede. Mitophagy indução é indicada por uma reduzida proporção GFP/DsRed de fluorescência mtRosella.
   1. Dia 1: Escolha L4 larvas de vermes expressando mitocôndrias-alvo Rosella (mtRosella) em células de músculo de corpo-parede em uma placa de mídia de crescimento de nematódeo (NGM) inoculado com Escherichia coli (OP50) usando um microscópio de dissecação⁵. Coloque 10-20 vermes/placa em pelo menos três pratos de 3,5 cm. Incube os nematoides à temperatura de 20 ° C⁵padrão.
      Nota: Consulte a referência para a anatomia do worm, incluindo identificação de larvas de L4²⁰e a maneira de fazer uma escolha que é usada para transferir vermes de um local para outro²¹.
   2. Dia 5: Sincronizar nematoides selecionando 15-20 L4 transgénicas larvas e transferi-los para fresco OP50 semeado placa NGM. Use pelo menos cinco placas por condição experimental.
   3. Dia 7: Prepare placas de veículos por drogas que afetam o mitophagy de interesse ou controlos positivos.
      1. Mate as bactérias Escherichia coli (OP50) semeadas, expondo placas NGM por 15 min com 222 µW/cm² (intensidade) da luz UV para garantir que mitophagy de indução compostos não são metabolizados por bactérias. As placas devem ser expostas com 2.000 J/m².
         Nota: Segundos de exposição necessária = 2.000/((intensity in µW/cm²) * 100).
      2. Adicione compound(s) de interesse para o topo das placas NGM semeados. Adicione uma quantidade equivalente de compostos veículo (solvente utilizado para dissolver compostos, tais como dimetilsulfóxido (DMSO)) para as placas do veículo como controlo negativo. Para o controlo positivo de indução de mitophagy, uma toxicidade mitocondrial, o paraquat (concentração final de 8 mM) foi usado. Adicione uma solução contendo 10 µ l de 8 M estoque de paraquat com 190 µ l de DDQ₂O na parte superior da placa de ágar para o grupo de tratamento. Para o grupo de veículo, adicione uma solução contendo 10 µ l de DMSO com 190 µ l de DDQ₂O na parte superior da placa de ágar.
         Nota: A solução de trabalho-o paraquat pode ser mantida durante 1 mês a 4 ° C.
      3. Agite suavemente as placas até o medicamento ou veículo reveste toda a superfície. Permitir que as placas secar com as tampas fechadas à temperatura ambiente pelo menos 1h antes de transferir os vermes.
         Nota: Placas de drogas também podem ser preparadas pela adição de drogas em NGM o líquido antes que ela se solidifica.
   4. Dia 7: Transferi 10-20 de 2 dias de idade adultos animais transgénicos preparados na etapa 2.1.2 para placas contendo ou o paraquat, compound(s) de interesse, ou veículo (DMSO). Incube os animais transgénicos a 20 ° C durante 2 dias.
   5. Dia 9: Prepare as almofadas de agarose 2% (ver Material complementar). Em seguida, adicione uma gota (10 µ l) de 20mm levamisole na M9 por pad. Imobilize os animais transgénicos para a imagem latente, colocando-os no drop-M9-levamisole. Coloque delicadamente uma lamela em cima.
   6. Capture animais transgénicos único usando uma câmera acoplada a um microscópio de epifluorescência. Adquira imagens fluorescentes de nemátodos toda transgênicas expressando mtRosella em células musculares de corpo-parede de ampliação 10 X⁵. Salve as imagens coletadas.
   7. Processe as imagens adquiridas com software ImageJ. Analise as células de músculo de parede corporal localizadas na cabeça do verme para evitar autofluorescência no tecido intestinal. Medir a área média pixels de intensidade total e valor para cada imagem fluorescente somente da região da cabeça de cada animal. Para analisar a área específica de interesse:
      1. Selecione 'dividir o canal' sob o menu drop-down 'imagem' e 'cor' para converter imagens.
      2. Utilize a ferramenta 'seleção à mão livre' para capturar a área fluorescente de interesse.
      3. Selecione o comando de 'medida' sob o menu drop-down 'analisar' e executar análise de intensidade do pixel.
      4. Intensidade do pixel deve ser normalizada, dividindo a intensidade pela área total analisada. Após a normalização, calcule a GFP a DsRed relação²².
   8. Usar a análise estatística, software para qualquer conduta estudante t-teste (comparação entre os dois grupos) ou ANOVA (comparação entre vários grupos) para a análise estatística com p < 0,05 como significativo^5,17 .
2. Avaliar mitophagy usando co localização entre DCT-1 e IgG-1
   Nota: DCT-1 é uma proteína de membrana mitocondrial externa que atua como um receptor de mitophagy em resposta ao estresse condições, semelhantes ao seu putativo orthologues BNIP3 e BNIP3L/NIX em mamíferos⁵. Assim, mitophagy iniciação é avaliada pela localização co entre DCT-1 mitophagy do receptor e autophagosomal da membrana LGG-1 (homólogo dos mamíferos LC3).
   1. Dia 1: Pick L4 larvas de animais transgénicos, expressando tanto DCT-1::GFP e DsRed::LGG-1 em corpo-parede muscular células⁵ para um OP50 semearam placa NGM. Coloque a placa de 5-10 minhocas/3.5 cm e use pelo menos três pratos. Incubar os nematódeos a 20 ° C.
      Nota: Os transgenes estão localizadas em plasmídeos separados e não estão integrados no genoma. Buscar nematoides carregando tanto rol-6(su1006) e p_myo-2 marcadores de contransformation GFP. Apenas vermes transgênicos com ambos os marcadores contransformation expressam tanto DCT-1::GFP e DsRed::LGG-1 em células musculares de corpo-parede.
   2. Siga os passos de 2.1.2-2.1.5.
   3. Células de músculo do corpo-parede simples imagem usando uma câmera acoplada a um microscópio confocal^5,23. Detectar as bordas das células de músculo de corpo inteiro-parede e tome z-pilha imagens abaixo dos 63 ampliação de x. Maior ampliação também pode ser usada.
   4. Abrir e processar imagens adquiridas com o software confocal. Iniciação de mitophagy é indicada pela localização co do receptor para o marcador de autophagosomal (DsRed::LGG-1) mitophagy (DCT-1::GFP). Manualmente medir eventos localização co em cada pilha de corpo-parede muscular célula⁵. É essencial para manter todas as configurações de microscópio e câmera (lente e lupa, filtros, tempo de exposição, resolução, a intensidade do laser, ganho, etc.) consistente ao longo de experiências. Devem notar-se todas as configurações.
   5. Usar a análise estatística, software para qualquer conduta estudante t-teste (comparação entre os dois grupos) ou ANOVA (comparação entre vários grupos) para a análise estatística com p < 0,05 como significativo^5,17 . Para comparações bidirecionais de uso do aluno t-teste (p < 0,05 é considerado significativo). Para comparações múltiplas, usar a análise de variância de fator único (ANOVA), corrigida pelo teste post hoc de Bonferroni. Recomendamos analisar pelo menos 50-70 animais ou células de músculo de corpo-parede de 30-50 para cada condição experimental. Repita a experiência pelo menos três vezes.

3. detecção de Mitophagy em ratos

Nota: Métodos anteriores para detectar mitophagy em ratos foram pesados, insensível e difícil de quantificar. Um modelo de mouse transgênicas expressando a forma mitocondrial-alvo do repórter fluorescente Keima (mt-Keima) agora pode ser utilizado para avaliar os níveis de mitophagy em uma ampla gama de condições fisiológicas e fisiopatológicas.

1. Eutanásia em ratos usando um protocolo aprovado pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização¹⁴.
2. Prenda o mouse (lado ventral para cima), para a plataforma de trabalho usando pinos nos membros. Fazer uma incisão no abdômen inferior usando uma tesoura de microcirurgia e fórceps para expor o fígado²⁴. Corte um pedaço de fígado (por exemplo, um pedaço de lobo direito em 1 × 1 × 1 cm) usando uma tesoura de microcirurgia e fórceps.
   Nota: A detecção de mitophagy em ratos é complicada e exige conhecimento sobre anatomia de rato e rato altamente hábil manipulação e cirurgia de rato. Este protocolo fornece etapas básicas, chaves sobre esse método, e um método mais detalhado está disponível²⁴.
3. Coloque a amostra de fígado em uma placa de metal no gelo para esfriar rapidamente o tecido. Mantenha o tecido na placa de metal fria e processar o mais rápido possível. Idealmente, use dentro de 1h de dissecação.
4. Levante a amostra de fígado usando fórceps curvo e enxágue com 5 mL de PBS 1x gelada.
5. Transferi o fígado para uma placa de Petri (Ø 100 mm) no gelo usando o fim de colher de uma espátula.
6. Seções de corte a amostra de fígado à mão em 0,5-1 mm espessura usando lâminas de borda única.
7. Transferi com cuidado as secções de tecido para um prato fundo de vidro usando fórceps de microcirurgia.
8. Defina cuidadosamente a seção de fígado com fórceps para achatar na parte inferior.
9. Cobrir o fígado em fatias com 3-5 gotas de frio 1X PBS.
   Nota: DAPI coloração é recomendado para identificar a região de interesse em determinados tecidos (por exemplo, cérebro)²⁴. Para validar a localização co do sinal vermelho mt-Keima com o lisossoma, corantes lisossomais, tais como o dextran cascata azul e lysosensor, podem ser usado²⁴.
10. As seções de tecido sob microscopia confocal através de de duas excitações sequencial²⁴da imagem. Conjunto de dois canais de imagem: "verde" canal mt-Keima (excitação 458 nm, emissão 695-570 nm gama) e "vermelho" mt-Keima (excitação 561 nm, emissão 695-570 nm gama). Manter as configurações de imagem entre condições experimentais. Para tratamento de imagens mais eficiente, analise dois animais de uma só vez.

Resultados

Deteção de Mitophagy em células humanas:

Usando o procedimento aqui apresentado, as células HeLa humanas foram transfected com mt-Keima do plasmídeo. Células saudáveis demonstraram uma bem organizada rede mitocondrial (GFP, 488 nm) com alguns casos de mitophagy (RFP, 561 nm). No entanto, as células pré-tratados com um desacoplador mitocondrial Compararia (30 µM para 3h) exibiu um profundo aumento na incidência de mitopha...

Discussão

Medição de mitophagy é tecnicamente exigente. Aqui, apresentamos várias técnicas robustas que permitem ambos detecção qualitativa de mitophagy e quantificação dos níveis de mitophagy nos modelos experimentais de laboratório mais comuns.

Para adquirir dados replicáveis, um projeto experimental com pelo menos três repetições biológicas é necessário. Todos os pesquisadores envolvidos em experimentação e análise devem ficar cego para identidades de grupo experimental. Além di...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
mt-Keima mouse	Jackson Laboratory
Lipofectamine 2000 DNA transfection reagent	Thermofisher	#11668027
Opti-MEM medium (Gibco)	Thermofisher	#31985062	serum-free medium
mtKemia plasmid: pCHAC-mt-mKeima	addgene	#72342
COXII antibody (mouse)	abcam	#ab110258
LAMP2 antibody (rabbit)	NOVUS	#CD107b
goat-anti-rabbit with wavelength 568 nm of red fluorescent protein (RFP)	Thermofisher	#Z25306	Alexa Fluor 568 dye
goat-anti-mouse with wavelength 488 nm of green fluorescent protein (GFP)	Thermofisher	#Z25002	Alexa Fluor 488 dye
prolong gold antifade with DAPI	Invitrogen	#P36931
6-well plate	SIGMA Corning Costar	#CLS3516
4-well chamber slide	THermofisher, Nunc Lab-Tek	#171080
Nunc F 96-well plate	Thermofisher	#152038
LC3B antibody rabbit	NOVUS	#NB100-2220
DNA antibody	Progen Biotechnik	#anti-DNA mouse monoclonal, AC-30-10
DAPI	Thermofisher	#D1306	antifade mounting medium with DAPI
IN Cell analyzer (fluorescent reader )	GE Healthcare Life Sciences	#IN Cell analyzer 2200
Eclipse TE-2000e confocal microscope	Nikon	#TE-2000e
Colocalization software	Volocity	#Volocity 6.3	alternative Zeiss ZEN 2012 software
IN Cell Investigator Software	GE Healthcare Life Sciences	#28408974
cell culture medium	Thermofisher	#DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermofisher	#15140122
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	#12003C-1000ML
Cell culture Incubator	Thermofisher	#Thermo Forma 3110 CO2 Water Jacketed Incubator
epifluorescence microscope	Zeiss		Zeiss Axio Imager Z2
camera	Olympus		Olympus DP71
confocal microscope	Zeiss		Zeiss Axio Observer Z1
confocal software	Zeiss		ZEN 2012
image analysis software	Image J	colocalization analysis, etc	https://imagej.nih.gov/ij/
statistical analysis software	GraphPad Software Inc., San Diego, USA		GraphPad Prism software package
material to make a worm pick	Surepure Chemetals	#4655	The pick is made of 30 gauge 90% platinum 10% iridium wire
IR: N2;Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella]	Material inquiry to Tavernarakis Nektarios		Maintain transgenic animals at 20 °C
IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1]	Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 TOMM-20::Rosella	Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
pdct-1 DCT-1::GFP	Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 DsRed::LGG-1	Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
Paraquat solution	see supplementary data for preparation
M9 buffer	see supplementary data for preparation
M9-levamisole buffer	see supplementary data for preparation
Glass Microscope Slides and Coverslips	Fisher Scientific	#B9992000
Surgical forceps	STERIS Animal Health	19 Piece Canine Spay Pack Economy
Surgical scissors	STERIS Animal Health	19 Piece Canine Spay Pack Economy
1x PBS	Thermofisher	#AM9625	10x PBS needs to be diluted to 1x PBS by using ddH2O
shaker	Fisher Scientific	#11-676-178	Thermo Scientific MaxQ HP Tabletop Orbital Small Open Air Platform Shaker Package A
2% agarose pad	see supplementary data for preparation
Vibroslice blades	World precision instruments	#BLADES-2	single-edge blade
metal plate	MSC	#78803988	0.012 in thick x 6 in wide x 12 in long, 430 Stainless Steel Sheet
Triton X-100			detergent
Methyl viologen dichloride hydrate	Sigma-Aldrich	#856177	paraquat
Incubator for nematodes	AQUALYTIC		Incubator to maintain 20 °C
Dissecting stereomicroscope	Olympus	SMZ645
Confocal microscope	Zeiss	AxioObserver Z1	For nematodes (step 2)
epifluorescence microscope	Zeiss	AxioImager Z2	For nematodes (step 2)
UV crosslinker	Vilber Lourmat	BIO-LINK – BLX-E365	UV light source; 356 nm