생체 외에서 그리고 Vivo에서 인간 세포, C. 선 충, 쥐에서 Mitophagy의 검출

요약

Mitophagy, 개간 손상 된 미토 콘 드리 아의 과정은 미토 콘 드 리아 항상성 및 건강 유지 관리를 위해 필요 합니다. 이 문서는 최신 mitophagy의 일부 인간 세포, 꼬마 선 충, 및 마우스 감지 방법을 선물 한다.

초록

미토 콘 드리 아 셀의 강국입니다 그리고 ATP의 형태로 세포 에너지를 생산. 미토 콘 드 리아 기능 장애는 생물학적 노화 및 질환 대사 질환, 조기 노화 증후군, Alzheimer의 질병 (광고) 및 파 킨 슨 병 (PD)와 같은 신경 퇴행 성 질환 등의 다양 한에 기여 한다. 미토 콘 드리 아 건강의 유지 보수는 미토 콘 드리 아 속 mitophagy 통해 역 기능 mitochondria의 효율적 허가에 따라 다릅니다. 정확 하 게 감지 하 autophagy/mitophagy, 특히 동물 모델 실험 방법 개발에 도전 있다. Mitophagy의 분자 메커니즘의 이해로 최근 진행은 소설 mitophagy 탐지 기술 개발을 활성화 하 고 있다. 여기, 인간의 세포, 꼬마 선 충 mitophagy 모니터 여러 다양 한 기법 소개 (예를 들어, 윈저 DCT-1 / 하는지 1 긴장), 마우스 (mt Keima). 간 종 평가 포함 하 여 이러한 mitophagy 탐지 기술의 조합 mitophagy 측정의 정확도 개선 하 고 mitophagy 건강과 질병에서의 역할의 더 나은 이해로 이어질.

서문

Mitophagy은 미토 콘 드리 아 유지 보수를 위해 필수적 이다. 미토 콘 드리 아 여러 세포 신호 경로 교차 하 고 보편적인 하위 세포 세포 세포 에너지 생산과 세포 물질 대사, 칼슘 항상성^1,2,3, 에 대 한 책임은 ⁴. 미토 콘 드리 아 끊임없이 경험 반응성 산소 종 (선생님)와 미토 콘 드리 아 이용과 같은 내 인 성 및 외 인 근원에서 과제 각각, "세"와 역 기능 mitochondria의 세대 이끌어 내는. 손상 된 미토 콘 드리 아의 축적 유해한 ROS의 양을 증가 하는 동안 ATP 생산의 효율성을 감소 하 고 대사 질환, 광고, 같은 나이 관련 된 질병에 연결 되었다 PD^1,5,6 . 유도 미토 콘 드리 아 세포 역 기능을 방지 하기 위해 셀 필요가 특히 미토 콘 드리 아를 손상 인식 하 고 효율적으로 세포 과정을 통해 그들을 제거 미토 콘 드 리아 autophagy를 (mitophagy) 불린다. 이 mitophagy 건강에서의 중요성을 설명 하 고 질병 검색 mitophagy 정확 하 고 효율적인 방법에 대 한 필요성을 보여줍니다 모두 생체 외에서 그리고 vivo에서.

Mitophagy는 많은 단백질과 단백질 단지^5,,78와 관련 된 여러 단계 프로세스입니다. 간단 하 게, 손상 된 mitochondrion 처음 인식 이며^9,10플라즈마 멤브레인, 바인딩과 그물, 골 단지, 핵, 또는 mitochondrion 자체에서 발생 한 수 있습니다 더블 membraned phagophore에 의해 잠겼습니다. 구형 phagophore elongates 및 결국 미토 콘 드리 아 autophagosome (mitophagosome) 구성 안에 미토 콘 드리 아를 봉인. mitophagosome 다음 성능 저하, 형성 하는 autolysosome는 손상된 mitochondrion 저하 및 재활용^7,8은 리소좀으로 퓨즈. 또한 mitophagy에 관련 된 주요 autophagic 단백질 포함: Autophagy 관련 7 (ATG7) 및 Beclin1 (개시), Microtubule-Associated 단백질 1A/1B-라이트 3 (LC3-II) ( C. elegans에서 하는지-1)과 p62 체인 (phagophore의 구성 요소), 그리고 관련 된 lysosomal 막 당단백질 2 (LAMP2)^6,7. 또한, PTEN 유도 상 상속 키 니 아 제 1 (핑크-1), Parkin1, 핵 점 단백질 52 kDa (NDP52), optineurin, BCL2 상호 작용 단백질 3 처럼 (닉스/BNIP3L) (DCT-1 C. 선 충)를 포함 하 여 mitophagy에 고유한 여러 가지 필수적인 단백질은 다른 사람의 사이에서^5,6,11.

Autophagy의 수준에서 변화를 감지 하는 일반적인 방법은 LC3-II/LC3-나의 LC3-II/말라 비율입니다. 그러나,이 메서드는 일반적인,이 비율 증가 증가 개시 또는 리소좀¹²mitophagosome의 장애인된 융합 반영 수 있습니다. 또 다른 방법은 없는 autophagy 마커 (예를 들어, LC3)와 미토 콘 드리 아 단백질 (예를 들어, Translocase의 외부 미토 콘 드리 아 막 20 (TOMM20, proteasomes에 의해 타락 될 수 있는)) 사이 colocalization를 평가 하는 것입니다. 그러나,이 수만 총 mitophagy 수준에서 변경 내용을 나타내고는 단계를 구별할 수 없습니다 어떤 막힘에 발생 합니다. 이 mitophagosomes의 축적을 병렬로 lysosomal 억제제 (예를 들어, E64d + Pepstatin A, EP에 게 불리는)를 사용 하 여 명백 하 게 될 수 있습니다. Mitophagosomes EP와 치료 다음과의 수와 초기에 mitophagosomes의 수의 차이 mitophagy를 나타낼 수 있습니다. 이러한 제한에는 소설 mitophagy 탐지 기술의 개발 라는 메시지가 있다. 인간의 질병의 넓은 스펙트럼에 mitophagy의 증가 관련성에 비추어 우리 연구원에 대 한 도움이 될 수 있습니다 몇 가지 강력한 mitophagy 탐지 기법 제시. 우리는 생체 외에서 그리고 vivo에서 기술을 커버 하 고 mitophagy의 변경 사항을 확인 하려면 여러 기술을 결합 하는 것이 좋습니다.

프로토콜

동물 (남성 및 여성 쥐)는 태어나 고 NIH 동물 관리 및 사용 위원회의 승인에 따라 공인된 동물 시설에서 사육 했다. 안락사 메서드는 모든 국가 및 기관의 규정에 일치 해야 합니다.

1입니다. 인간의 세포에 Mitophagy의 탐지

1. Mt Keima 플라스 미드를 사용 하 여 mitophagy의 검출
   참고: mt-Keima, 서 간체 미토 콘 드리 아 대상 신호 융합 Keima 단백질 mitophagy 검색 비보에 유용한 입증 했다. mt Keima 녹색 형광 (여기 458 nm) 기본 또는 중립 조건 및 산 성 조건에서 빨간색 형광 (여기 561 nm) 전시 비율 pH에 민감한 형광 단백질 이다. 건강 한 미토 콘 드리 아 기본 또는 중립 조건 (pH 7-8)에 번 창 하 고 산 Keima와 페 때 녹색 형광으로 표시 됩니다. 미토 콘 드리 아 mitophagy 받을 때 산 성 리소좀과 융합, pH 4.5 고 산 Keima를 포함 하는 미토 콘 드리 아 전시회 빨간 형광^6,,1314. 중요 한 것은, 산 Keima은 오랜 동안 mitophagy의 평가 사용 하는 lysosomal 프로 테아 제. 프로토콜 아래 6 잘 플레이트 설계 되었습니다.
   1. 주 1: 기본 인간 세포 (예를들면, 섬유 아 세포) 또는 불멸 하 게 인간의 세포 (예를들면, Hela 세포 또는 U2OS 셀)를 사용 합니다. 씨 약 0.3-1 × 10⁶ 6 잘 플레이트 (다음날에 70 %confluency 도달 하는 셀 수 있도록 셀 성장 율)에 따라 셀/잘. 완전 한 세포 배양 매체에서 세포를 유지 (Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 중간 보충 10 %FBS, 및 1% 혼합 페니실린 스의 솔루션), 고 37 ° C에서 셀 문화 인큐베이터에서 품 어 (20% O₂, 5 %CO₂ ). 6 잘 플레이트 1 mL 완전 한 세포 배양 매체/잘 추가 합니다.
      참고: 유전자 overexpression/최저 또는 마약 치료가 단계⁶에서 할 수 있습니다.
   2. 주 2: 믹스 mt Keima 플라스 미드 DNA⁶ DNA transfection 시 약 (6-잘 접시의 한 잘 혼합).
      1. 15 µ L DNA transfection 시 약의 제조 업체의 프로토콜에 따라 혈 청 자유로운 매체의 150 µ L로 희석.
      2. 혈 청 무료 매체의 150 µ L로 산 Keima 플라스 미드 DNA의 2-5 µ g을 희석.
      3. 희석된 DNA transfection 시 약, 10에 대 한 소용돌이 희석된 산-Keima 플라스 미드를 추가 s, 그리고 실 온에서 10 분 동안 품 어.
         참고: DNA transfection 조건의 최적화 접시 크기에 따라 필요할 수 있습니다 (자세한 내용은 제조업체의 프로토콜 참조).
      4. 셀에 dropwise DNA/transfection 시 혼합물을 추가 다음 솔루션은 완전히 혼합 때까지 부드럽게 5-10 s에 대 한 번호판을 흔들어.
   3. 제 3 일: 신선한 완전 한 세포 배양 매체 (1 mL/잘)와 DNA transfection 시 약 포함 된 매체를 대체 하 여 미디어를 변경 합니다.
   4. 제 4 일: 이미지 confocal 현미경 검사 법⁶을 사용 하 여 셀. 두 개의 영상 채널을 사용 하 여: 녹색 채널 (여기 458 nm, 방출 570-695 nm) 시각화 정상적인 미토 콘 드리 아와 빨강 채널 (여기 561 nm, 방출 570-695 nm) 미토 콘 드리 아를 시각화 하는 mitophagy를 겪고 있다. 무작위로 20 지역에 모든 잘 100-200 셀의 총 커버 40 x 확대 이미지.
   5. 데이터 분석을 수행 합니다. "Mitophagy 색인"을 계산 (미토 콘 드리 아 mitophagy 진행의 백분율), 빨강 및 녹색 채널에 형광의 양을 계량 하 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여: 빨강 + 녹색 형광을 붉은 형광의 비율을가지고 100을 곱하면⁶.
      참고: 대안 transfection 안정적으로 표현 하는 산-Keima 헬러 세포 라인¹⁴를 사용 하 여 포함 됩니다. 헬러 세포 Parkin 표현 하지 않습니다, 때문이 셀 라인에서 Parkin 종속 mitophagy 공부 하 Parkin은 안정적으로 표현 해야 합니다.
2. 시 토 크롬 C 산화 효소 소 단위 II (COXII)와 LAMP2 사이 colocalization를 사용 하 여 mitophagy의 검출
   참고: COXII는 미토 콘 드리 아 게놈 인코딩 내부 막 단백질 이다. 'Mitophagy 인덱스' COXII COXII의 총 금액의 비율로 표시 하는 LAMP2와 colocalized의 비율을 같게 한다.
   1. 헬러 세포 (또는 단계 1.1.1에서에서 언급 하는 관심사의 다른 세포) 씨 4-잘 챔버 슬라이드 (1 mL 완전 한 세포 배양 매체/잘에서 1-5 × 10⁴ 셀) 셀에서에 문화 인큐베이터 (20% O₂, 5% CO₂) 37 ° C에서 하룻밤.
   2. 추가 10 m m 카보닐기의 3.0 µ L-4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) 시아 나 이드 및 3 h의 셀 문화 인큐베이터 (1.2.1 단계)에서 품 어.
      참고: mitophagy에 영향을 미치는 다른 약물 사용할 수 있습니다.
   3. 문화 매체 1 mL 피 펫을 사용 하 여 제거, 셀을 두 번 1 mL/추위의 잘 세척 (0-4 ° C) 1 x PBS. 솔루션 다음 세척 하기 전에 10-30 s 동안 앉아 보자. 다음 각 우물에 1 x PBS에 0.5 mL 3.7 %paraformaldehyde (PFA)를 추가 하 고 셀을 해결 하기 위해 얼음에 10 분 동안 품 어.
      주의: PFA 독 소입니다. PFA 사용할 때 증기 두건에서 작동 합니다.
   4. PFA 솔루션 1 mL 피 펫을 사용 하 여, 셀 감기 1 두 번 씻어 X PBS (1 mL/음; 게 솔루션 10 앉아 다음 세척 하기 전에 s), 1 mL/얼음에 10 분 (1 x PBS)에 0.25% 세제의 세포를 permeabilize 고.
   5. Permeabilizing 버퍼, PBS와 폐기 감기 1로 두 번 셀을 부드럽게 씻어 (하자 10 앉아 솔루션의 세척 사이). 1 mL/5% FBS 1 x PBS에 하룻밤에 4 ° c.의 세포를 차단 수 분 손실을 방지 하기 위해 챔버를 커버.
   6. 0.5-1 COXII 항 체 (마우스, 1: 250 희석)와 LAMP2 항 체 (토끼, 1시 20분-1시 50분 희석) 5 %FBS와 얼음에 저장소 1 x PBS에 혼합된 항 체 솔루션의 0.5 mL/잘 준비 h.
   7. 차가운 방에서 4-잘 챔버 슬라이드 밖으로가 고 1 mL 피 펫과 차단 솔루션을 삭제. 부드럽게 씻어 두 번 1 mL/PBS와 폐기 감기 1의 셀 (하자 10 앉아 솔루션의 세척 사이), 다음 0.5 mL를 추가/잘 혼합된 항 체 솔루션의. 낮은 속도로 통에 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어.
   8. 1 mL 피 펫을 사용 하 여 첫 번째 항 체 솔루션을 삭제 하 고 부드럽게 셀 세 번 1 mL/감기 1 x PBS의 잘 세척 하 고 삭제. 하자 솔루션 10 앉아 다음 세척 하기 전에 s. 1: 250 5% 희석에서 1 mL/잘 형광 이차 항 체 (예, 빨간 형광 단백질 LAMP2;에 대 한 (RFP)의 파장 568 nm와 염소 안티 토끼와 염소 안티 마우스 COXII에 대 한 녹색 형광 단백질 (GFP)의 파장 488 nm)의 추가 FBS 1 x PBS에. 알루미늄 호 일 4-잘 챔버 슬라이드 커버 하 고 낮은 속도로 통에 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어.
   9. 두 번째 항 체 솔루션 1 mL 피 펫을 삭제 합니다. 부드럽게 셀 6 번 1 mL/감기 1 x PBS의 잘 씻는 다. 솔루션 다음 세척 하기 전에 1 분 동안 앉아 보자.
   10. 50 µ L/잘 DAPI와 함께 antifade 장착 매체의 셀을 탑재 하 고 커버 전표를 추가 합니다.
   11. 이미지 확대 및 침수 기름 x 66 confocal 현미경 세포 (타일 검사 / 모자이크 소프트웨어 이미지가 포함 된 셀의 수를 증가 하는 데 사용할 수 있습니다). 채널 노출 시간, 디지털 이득, 디지털 오프셋, 등 모든 이미징 프로세스 (자세한 내용은 참조 소프트웨어 지침)¹⁵에 걸쳐 동일한 설정을 사용 합니다.
   12. 100의 20 임의의 이미지를 양적 분석을 사용 하 여 colocalization 분석 소프트웨어¹⁵세포. "닫힌 베 지 어" 함수를 사용 하 여 전체 개별 셀을 선택 합니다. RFP, 가중치 또는 unweighted, 분석된 셀에 mitophagy 수준을 결정 하에 GFP의 피어슨의 colocalization 계수를 비교 합니다. 분석을 통해 colocalization 분석 소프트웨어의 수평 및 수직 십자선에 대 한 값을 유지 합니다. 이러한 십자선을 정확 하 게 설정 하려면 셀의 두 개의 추가 세트를 준비 하 고 한 COXII 및 다른 LAMP2. 그런 다음, 각 채널¹⁵ 픽셀 분포 바로 위에 십자선 설정 (자세한 내용은 소프트웨어 지침 참조).
3. 높은 처리량 측정 mitophagy 심사에 대 한 이미징
   참고: 큰 화합물 라이브러리에서 mitophagy 유도 또는 억제 하는 mitophagy 화합물의 높은 처리량 화면 수행은 기술적으로 요구. 미토 콘 드리 아 autophagosomes와 colocalization에 기반 하는 이미징 기술을 mitophagy¹⁶심사에 대 한 더 간단한, 그러나 매우 중요 한 대안 이다.
   1. 제 1 일: 96 잘 접시의 세포 (예를들면, 5000 셀/100 mL 셀 문화 미디어/잘에서 인간의 기본 fibroblasts) 씨앗 (1.1.1 단계 참조).
   2. 주 2: 지정 된 보육 시간에 대 한 두 번째 날 FCCP 또는 관심의 다른 화합물에서에서 세포 치료 (1.2.2 단계 참조).
   3. 따라 단계 1.2.2-1.2.9 COXII에 대 한 1 차 항 체를 사용 하 여 (마우스, 5%와 1: 250 희석 1 x PBS에서 FBS) 및 LC3B (토끼, 1: 100-5%와 1: 200 희석 1 x PBS에서 FBS). 또는, COXII 및 LAMP2에 대 한 1 차 항 체를 사용할 수 있습니다.
   4. ¹⁶형광 판독기 사용 하 여 셀을 이미지. 최소 500 세포/잘와 무작위로 배치 필드에 이미지를 수집 합니다.
   5. ¹⁶셀 분석기 사용자 지정 프로토콜 사용 하 여 데이터를 분석 합니다.

2. C. 선 충 에 Mitophagy의 탐지

참고: 선 충 류 선 충 C. organismal 수준에서 mitophagy를 시험 하는 플랫폼을 제공 합니다. 2 개의 긴장 mitophagy를 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다: (1) 미토 콘 드리 아-타겟 윈저 (mtRosella) 또는 (2) mitophagy 수용 체 DCT-1 하는지-1 융합 Discosoma sp. 빨간 형광 성 단백질 (DsRed)^5, autophagosomal 표식 함께 GFP 융합 ¹⁷.

1. 윈저 바이오 센서를 사용 하 여 모니터링 Mitophagy
   참고: 윈저 pH에 민감한 GFP 변형 융합 pH을 구분 하지 않는 DsRed를 결합 하 여 분자 바이오 센서 이다. 윈저 바이오 센서 산 성 리소좀 (pH 4.5 ~)와 다른 세포질 구획의 pH 차이의 활용. 이 바이오 센서는 Saccharomyces cerevisiae 에 헬러, HEK293, 및 HCT116^18,19등 여러 포유류 세포 라인 mitophagy 성공적으로 모니터링 하는 데 사용 되었습니다. 우리는이 다재 다능 한 듀얼-형광 기자 적응 하 고 유전자 변형 C. 선 충 을 생성 체 벽 근육 세포에서 미토 콘 드리 아 표적으로 윈저 (mtRosella)를 표현 하는 선 충. Mitophagy 유도 mtRosella 형광의 감소 GFP/DsRed 비율에 의해 표시 됩니다.
   1. 제 1 일: L4와 대장균 (OP50) 해 부 현미경⁵를 사용 하 여 시드 선 충 류 성장 미디어 (NGM) 접시에 시체 벽 근육 세포에서 미토 콘 드리 아 표적으로 윈저 (mtRosella)를 표현 하는 벌레의 애벌레를 선택 합니다. 적어도 3 개의 3.5 cm 접시에 10-20 벌레/접시를 놓습니다. 20 ° C⁵의 표준 온도에서 선 충을 품 어.
      주: 웜 해부학, 포함 한 L4 애벌레²⁰, 및 한 위치에서 다른²¹벌레를 전송 하는 데 사용 되는 선택을 하는 방법에 대 한 참조를 참조 하십시오.
   2. 주 5: 15-20 L4 유전자 변형 애벌레를 선택 하 여 선 충을 동기화 하 고 신선한에 전송 OP50 시드 NGM 접시. 실험 조건 당 적어도 5 접시를 사용 합니다.
   3. 제 7 일: 관심이 나 긍정적인 컨트롤의 mitophagy에 영향을 미치는 약물에 대 한 차량 번호판을 준비 합니다.
      1. Mitophagy 유도 화합물 박테리아에 의해 대사 되지는 되도록 자외선의 222 µW/cm² (강도)와 15 분 동안 NGM 번호판을 노출 하 여 시드 대장균 (OP50) 박테리아를 죽 일. 접시 2000 J/m²으로 노출 되어야 합니다.
         참고: 초 노출 필요 = 2000/((intensity in µW/cm²) * 100).
      2. 시드 NGM 접시 위쪽에 관심의 compound(s)를 추가 합니다. 부정적인 통제로 차량 번호판 복합 차량 (화합물, 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 등을 분해 하는 데 사용 되는 용 매)의 상응 하는 금액을 추가 합니다. Mitophagy 유도, 미토 콘 드리 아 toxicant의 긍정적인 통제 파라콰트 (8mm 최종 농도) 사용 되었습니다. DdH₂O 치료 그룹에 대 한 천 배지 위에 190 µ L로 8 M 파라콰트 주식의 10 µ L을 포함 하는 솔루션을 추가 합니다. 차량 그룹 ddH₂O 한 천 배지 위에 190 µ L와 DMSO의 10 µ L을 포함 하는 솔루션을 추가 합니다.
         참고: 파라콰트 작업 솔루션 수 있습니다 1 개월에 보관 4 ° c.
      3. 부드럽게 마약까지 번호판을 소용돌이 또는 차량 코트 전체 표면. 벌레를 전송 하기 전에 적어도 1 시간에 대 한 실 온에서 닫힌 뚜껑 건조 격판덮개를 허용 한다.
         참고: 마약 판 또한 그것 고형화 하기 전에 액체 NGM에 약물을 추가 하 여 준비 될 수 있습니다.
   4. 제 7 일: 10-20 2-하루-오래 된 성인 유전자 변형 동물 단계 2.1.2 파라콰트, 관심, 또는 차량 (DMSO)의 compound(s)를 포함 하는 접시에서에서 준비의 전송. 2 일 동안 20 ° C에서 유전자 변형 동물을 품 어.
   5. 주 9: 2 %agarose 패드 ( 보충 자료참조)를 준비 합니다. 다음 패드 당 M9에 20mm levamisole의 1 방울 (10 µ L)를 추가 합니다. M9 levamisole 드롭에서 그들을 배치 하 여 이미지에 대 한 유전자 변형 동물을 무력화. 부드럽게 위에 coverslip 장소.
   6. 단일 유전자 변형 동물 epifluorescence 현미경에 부착 된 카메라를 사용 하 여 캡처. 10 X 배율⁵체 벽 근육 세포에서 mtRosella을 표현 하는 전체 유전자 변형 선 충의 형광 이미지를 취득 합니다. 수집 된 이미지를 저장 합니다.
   7. ImageJ 소프트웨어 인수 이미지를 처리 합니다. 장 조직에서 autofluorescence을 피하기 위해 벌레의 머리에 있는 체 벽 근육 세포를 분석 합니다. 각 동물의 머리 영역의 형광 각 이미지에 대 한 평균 픽셀 강도 값과 전체 영역을 측정 합니다. 관심의 특정 영역을 분석:
      1. 이미지를 변환 하는 '이미지'와 '색상' 드롭 다운 메뉴에서 '분할 채널'을 선택 합니다.
      2. 형광 관심 영역을 잡으려고 '자유 선택' 도구를 사용 합니다.
      3. '분석' 드롭다운 메뉴에서 '측정' 명령을 선택 하 고 픽셀 강도 분석을 수행.
      4. 픽셀 강도 분석 전체 면적에 의해 강도 나누어 정규화 한다. 정규화, 시 DsRed 비율²²에 GFP를 계산 합니다.
   8. 통계 분석을 소프트웨어 실시 학생 t를 사용 하 여-테스트 (두 그룹 간의 비교) 또는 중요 한^{5,17 p < 0.05와 통계 분석 ANOVA (여러 그룹 간의 비교)} .
2. DCT-1과 1 하는지 사이의 공동 지역화를 사용 하 여 mitophagy를 평가
   참고: DCT-1 조건, 포유류⁵에 그것의 상 상속 orthologues BNIP3와 닉스/BNIP3L와 비슷한 스트레스에 대 한 응답 mitophagy 수용 체로 작동 하는 외부 미토 콘 드리 아 막 단백질 이다. 따라서, mitophagy 개시는 DCT-1 mitophagy 수용 체 및 autophagosomal 막 단백질 하는지-1 (체 포유류 LC3) 사이 공동 지역화에 의해 평가 됩니다.
   1. 제 1 일: 몸 벽 근육 세포⁵ 는 OP50에 DCT-1::GFP 및 DsRed::LGG-1을 표현 하는 유전자 변형 동물의 선택 L4 애벌레 시드 NGM 접시. 5-10 웜/3.5 c m 플레이트, 배치 하 고 적어도 3 개의 격판덮개를 사용 하 여. 20 ° c.에 선 충을 품 어
      참고:에서 transgenes는 별도 플라스 미드에 있으며 게놈에 통합 되지 않습니다. Rol-6(su1006) 및 p_{묘 2} GFP contransformation 마커를 운반 하는 선 충을 선택. 만 두 contransformation 마커 유전자 변형 웜 DCT-1::GFP 및 DsRed::LGG-1 몸 벽 근육 세포에 표현 한다.
   2. 2.1.2-2.1.5에서 단계를 따릅니다.
   3. Confocal 현미경^5,23에 연결 된 카메라를 사용 하 여 이미지 단일 몸 벽 근육 세포. 걸릴 z-스택 이미지 아래 63 x 확대 및 전체 몸 벽 근육 셀의 테두리를 검색 합니다. 높은 확대도 사용할 수 있습니다.
   4. 열고 이미지 confocal 소프트웨어와 함께 인수를 처리 합니다. Mitophagy의 autophagosomal 표시 (DsRed::LGG-1)에 mitophagy 수용 체 (DCT-1::GFP)의 공동 지역화 하 여 표시 됩니다. 수동으로 각 스택에 몸 벽 근육 세포⁵의 공동 지역화 이벤트 측정 합니다. 모든 현미경 및 카메라 설정 (렌즈, 돋보기, 필터, 노출 시간, 해상도, 레이저 강도, 이득, 등)을 실험을 통해 일관성 유지에 필수적 이다. 모든 설정은 유의 하십시오.
   5. 통계 분석을 소프트웨어 실시 학생 t를 사용 하 여-테스트 (두 그룹 간의 비교) 또는 중요 한^{5,17 p < 0.05와 통계 분석 ANOVA (여러 그룹 간의 비교)} . 학생의 t를 사용 하는 양방향 비교-테스트 (p < 0.05 중요 한 여겨진다). 여러 비교에 대 한 특별 게시물 Bonferroni 테스트에 의해 수정 단일 요소 (ANOVA) 분산 분석을 사용 합니다. 적어도 50-70 동물 또는 각 실험 조건에 대해 30-50 체 벽 근육 세포를 분석 하는 것이 좋습니다. 실험 3 번 이상 반복 합니다.

3입니다. 쥐에서 Mitophagy의 탐지

참고: 쥐에서 mitophagy를 검색 하기 위해 이전 방법, 구분, 복잡 하 고 계량 하기 어려운 했다. 표현 대상으로 미토 콘 드 리아 형태의 형광 기자 Keima 유전자 변형 마우스 모델 (mt Keima) 지금 다양 한 생리 및 병 태 생리 조건에서에서 mitophagy의 수준을 평가에 활용할 수 있습니다.

1. ¹⁴기관 동물 관리 및 사용 위원회 의해 승인 하는 프로토콜을 사용 하 여 마우스를 안락사
2. 마우스 (복 부 쪽)는 사지에 핀을 사용 하 여 작업 플랫폼을 확보. 간²⁴노출 미세가 위와 집게를 사용 하 여 더 낮은 복 부에 절 개를 확인 합니다. 간 (예를 들어, 1 × 1 × 1 cm에서 오른쪽 엽의 조각)의 조각을 잘라 미세가 위와 집게를 사용 하 여.
   참고: 쥐에서 mitophagy의 검색 복잡 이며 마우스 해부학 및 고도로 숙련 된 마우스 처리와 마우스 수술 지식이 필요 합니다. 이 프로토콜은이 방법에 기본 핵심 단계를 제공 합니다 그리고 더 자세한 방법은 사용할 수²⁴.
3. 얼음을 빠르게 조직에 금속 접시에 간 샘플을 놓습니다. 차가운 금속 접시에 조직을 유지 하 고 최대한 신속 하 게 처리. 최적으로, 해 부의 1 시간 이내 사용 합니다.
4. 곡선된 집게를 사용 하 여 간 샘플 들어올린 얼음 1 x PBS의 5 mL로 씻어.
5. 주걱의 스푼 끝을 사용 하 여 얼음에 간 페 트리 접시 (Ø 100 m m) 전송.
6. 잘라 간 샘플 손으로 0.5-1 m m 두꺼운 부분 단일에 지 블레이드를 사용 하 여.
7. 신중 하 게 유리 하단 접시 미세 집게를 사용 하 여 조직 단면도 전송 합니다.
8. 조심 스럽게 바닥에 평평 하 게 집게와 간 섹션을 설정 합니다.
9. 감기 1 x PBS의 3-5 방울과 슬라이스 간 커버.
   참고: DAPI 얼룩 특정 조직 (예를 들어, 뇌)²⁴에 관심 영역을 식별 하려면 것이 좋습니다. 붉은 산-Keima 신호는 리소좀과의 공동 지역화의 유효성을 검사 하려면 dextran 캐스케이드 블루 등 lysosensor, lysosomal 염료 사용된²⁴일 수 있다.
10. 두 개의 순차적 업무가²⁴통해 confocal 현미경 검사 법에서 조직 섹션 이미지. 두 개의 영상 채널 설정: "녹색" mt Keima 채널 (여기 458 nm, 방출 570-695 nm 범위)와 "레드" mt-Keima (여기 561 nm, 방출 570-695 nm 범위). 실험 조건 사이 영상 설정을 유지 합니다. 더 효율적인 이미징에 대 한 한 번에 두 동물을 분석 합니다.

결과

인간 세포에 Mitophagy의 검출:

여기에 제시 된 절차를 사용 하 여, 인간 헬러 세포 mt Keima 플라스 미드와 페 했다. 건강 한 세포는 잘 조직 된 미토 콘 드 리아 네트워크 시연 (GFP, 488 nm)와 mitophagy의 몇 가지 부각 (RFP, 561 nm). 그러나, 세포는 미토 콘 드리 아 uncoupler FCCP와 청소용 (3 h 30 µ M) mitophagy 발생 (그림 1A)에?...

토론

Mitophagy의 정확한 측정은 기술적으로 요구 하 고 있다. 여기, 우리는 mitophagy의 질적 모두 검출 및 정량화의 가장 일반적인 실험실 실험 모델 mitophagy 수준에 대 한 허용 하는 여러 가지 강력한 기법 제시.

복제할 데이터를 얻기 위해 적어도 3 개의 생물 학적 반복 된 실험 설계는 필요 하다. 실험 및 분석에 관련 된 모든 연구 실험 그룹 id에 멀게 합니다. 또한, 필드 이미징 선택 되...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
mt-Keima mouse	Jackson Laboratory
Lipofectamine 2000 DNA transfection reagent	Thermofisher	#11668027
Opti-MEM medium (Gibco)	Thermofisher	#31985062	serum-free medium
mtKemia plasmid: pCHAC-mt-mKeima	addgene	#72342
COXII antibody (mouse)	abcam	#ab110258
LAMP2 antibody (rabbit)	NOVUS	#CD107b
goat-anti-rabbit with wavelength 568 nm of red fluorescent protein (RFP)	Thermofisher	#Z25306	Alexa Fluor 568 dye
goat-anti-mouse with wavelength 488 nm of green fluorescent protein (GFP)	Thermofisher	#Z25002	Alexa Fluor 488 dye
prolong gold antifade with DAPI	Invitrogen	#P36931
6-well plate	SIGMA Corning Costar	#CLS3516
4-well chamber slide	THermofisher, Nunc Lab-Tek	#171080
Nunc F 96-well plate	Thermofisher	#152038
LC3B antibody rabbit	NOVUS	#NB100-2220
DNA antibody	Progen Biotechnik	#anti-DNA mouse monoclonal, AC-30-10
DAPI	Thermofisher	#D1306	antifade mounting medium with DAPI
IN Cell analyzer (fluorescent reader )	GE Healthcare Life Sciences	#IN Cell analyzer 2200
Eclipse TE-2000e confocal microscope	Nikon	#TE-2000e
Colocalization software	Volocity	#Volocity 6.3	alternative Zeiss ZEN 2012 software
IN Cell Investigator Software	GE Healthcare Life Sciences	#28408974
cell culture medium	Thermofisher	#DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermofisher	#15140122
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	#12003C-1000ML
Cell culture Incubator	Thermofisher	#Thermo Forma 3110 CO2 Water Jacketed Incubator
epifluorescence microscope	Zeiss		Zeiss Axio Imager Z2
camera	Olympus		Olympus DP71
confocal microscope	Zeiss		Zeiss Axio Observer Z1
confocal software	Zeiss		ZEN 2012
image analysis software	Image J	colocalization analysis, etc	https://imagej.nih.gov/ij/
statistical analysis software	GraphPad Software Inc., San Diego, USA		GraphPad Prism software package
material to make a worm pick	Surepure Chemetals	#4655	The pick is made of 30 gauge 90% platinum 10% iridium wire
IR: N2;Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella]	Material inquiry to Tavernarakis Nektarios		Maintain transgenic animals at 20 °C
IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1]	Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 TOMM-20::Rosella	Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
pdct-1 DCT-1::GFP	Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 DsRed::LGG-1	Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
Paraquat solution	see supplementary data for preparation
M9 buffer	see supplementary data for preparation
M9-levamisole buffer	see supplementary data for preparation
Glass Microscope Slides and Coverslips	Fisher Scientific	#B9992000
Surgical forceps	STERIS Animal Health	19 Piece Canine Spay Pack Economy
Surgical scissors	STERIS Animal Health	19 Piece Canine Spay Pack Economy
1x PBS	Thermofisher	#AM9625	10x PBS needs to be diluted to 1x PBS by using ddH2O
shaker	Fisher Scientific	#11-676-178	Thermo Scientific MaxQ HP Tabletop Orbital Small Open Air Platform Shaker Package A
2% agarose pad	see supplementary data for preparation
Vibroslice blades	World precision instruments	#BLADES-2	single-edge blade
metal plate	MSC	#78803988	0.012 in thick x 6 in wide x 12 in long, 430 Stainless Steel Sheet
Triton X-100			detergent
Methyl viologen dichloride hydrate	Sigma-Aldrich	#856177	paraquat
Incubator for nematodes	AQUALYTIC		Incubator to maintain 20 °C
Dissecting stereomicroscope	Olympus	SMZ645
Confocal microscope	Zeiss	AxioObserver Z1	For nematodes (step 2)
epifluorescence microscope	Zeiss	AxioImager Z2	For nematodes (step 2)
UV crosslinker	Vilber Lourmat	BIO-LINK – BLX-E365	UV light source; 356 nm