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  • Résumé
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  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Un protocole in situ (ISH) de l’hybridation qui utilise courts oligonucléotides antisens pour détecter les modes épissage alternatif pré-ARNm dans les sections de cerveau de souris est décrite.

Résumé

Épissage alternatif (AS) se produit dans plus de 90 % des gènes humains. Le modèle d’expression d’un exon épissé alternativement est souvent réglementé de manière spécifique au type de cellule. COMME expression patterns sont généralement analysés par RT-PCR et RNA-seq en utilisant des échantillons d’ARN isolé d’une population de cellules. In situ examen de comme modèles d’expression d’une structure biologique particulière peut être effectué par RNA in situ hybridation (ISH) à l’aide de sondes spécifiques exon. Toutefois, cet usage particulier de l’ISH a été limité, car l’alternatives exons sont généralement trop courtes pour la conception des sondes spécifiques exon. Dans ce rapport, l’utilisation de BaseScope, une technologie récemment développée qui emploie courts oligonucléotides antisens dans RNA ISH, est décrite pour analyser comme modèles d’expression dans les sections de cerveau de souris. Exon 23 a de la neurofibromatose de type 1 (Nf1) est utilisé comme un exemple pour illustrer que sondes jonction exon-exon courte pièce signaux d’hybridation robuste avec une spécificité élevée dans l’analyse des ARN ISH sur des coupes de cerveau de souris. Plus important encore, signaux détectés avec des sondes spécifiques inclusion et sautant exon peuvent servir à calculer fiablement le pourcentage épissé dans les valeurs de Nf1 exon 23 a expression dans différentes zones anatomiques d’un cerveau de souris. Le protocole expérimental et la méthode de calcul pour analyse sont présentés. Les résultats indiquent que BaseScope fournit un nouvel outil puissant pour évaluer en tant qu’expression patterns in situ.

Introduction

Épissage alternatif (AS) est un processus commun qui se produit au cours de la maturation de l’ARN pré-messager. Dans ce processus, un exon peut figurer différemment dans l’ARNm mature. Ainsi, par le biais de AS, un gène peut générer plusieurs ARNm ce code pour produits protéiques différents. Il est estimé que 92 à 94 % des gènes humains subissent une variante épissage1,2. Épissage des patrons d’anormale alternatif résulte de mutations génétiques ont été liées à un grand nombre de maladies, y compris la sclérose latérale amyotrophique, la dystrophie myotonique et cancer3,4. Il est donc crucial d’enquêter et de mieux comprendre les mécanismes de régulation épissage alternatifs pour tenter de trouver de nouveaux traitements des maladies humaines.

COMME est souvent réglementé de manière spécifique au type de cellule. Il est important de déterminer le modèle AS d’expression d’un gène spécifique dans un système biologique donné. Toutefois, cela se complique quand un organe complexe qui contient de nombreux types de cellules, comme le cerveau ou le cœur, est étudié. Dans ce cas, un choix idéal de système de dosage est RNA in situ hybridation (ISH) à l’aide de tissus des sections pour le modèle AS d’expression d’un gène spécifique peut être détecté dans de nombreux types de cellules en même temps. En effet, des sondes exon-spécifiques ont été utilisés pour évaluer le niveau d’expression d’un autre exon5,6,7. Toutefois, cette approche n’est pas bien adaptée pour que l’analyse des habitudes pour les raisons suivantes. Tout d’abord, les classiques méthodes ISH utilisent généralement des sondes de plus de 300 bp, alors que la taille moyenne des vertébrés exons internes (pas premier ou le dernier exon) est 170 nucléotides8,9. Deuxièmement, lorsqu’une sonde exon spécifique est utilisée pour examiner le modèle d’épissage d’un exon alternatif interne, l’isoforme d’ARNm uniquement détecté par la sonde est celle qui contient l’exon, tandis que l’isoforme ARNm sans l’exon ne peuvent pas être détecté. Ainsi, le calcul du pourcentage épissé en valeur (lb/po2) pour l’autre exon est compliqué. En outre, ISH fluorescent conventionnel combine souvent ISH immunomarquage, ce qui réduit l’efficacité de la détection et la robustesse. Par exemple, dans une étude qui a enquêté sur le stress induit par l’épissage isoforme de commutation de l’acétylcholinestérase (AChE) mRNA, digoxigénine fut incorporée à la sonde de l’ISH et détectés en utilisant des anticorps anti-digoxigénine. Par ailleurs, sonde marquée à la biotine a été détectée par un conjugué à la phosphatase alcaline/streptavidine et un substrat de la phosphatase alcaline10. Aucune méthode utilise toute stratégie d’amplification pour augmenter la sensibilité de détection. En conséquence, il est difficile de détecter des transcriptions d’ARNm qui sont expriment à de faibles niveaux. Ainsi, un système de dosage ISH plus simple et plus robuste est nécessaire pour analyser comme expression patterns in situ.

BaseScope a été récemment développé basé sur la plate-forme de RNAscope, un bien établi et largement utilisé le système d’essai ISH. Les deux systèmes de dosage emploient une technologie d’amplification spécifique à la cible qui augmente la sensibilité de détection11,12. Ce qui distingue une de l’autre est la longueur de la séquence cible, qui est aussi courte que 50 nucléotides pour BaseScope et 300 – 1 000 nucléotides pour RNAscope. Ainsi, il est possible aux sondes de conception qui ciblent les jonctions exon-exon pour détecter des isoformes de mRNA alternatives spécifiques. Dans cette étude, une procédure a été créée pour examiner comme modèles d’expression de la neurofibromatose de type 1 (Nf1) exon 23 a, un autre exon largement étudié dans le même laboratoire13,14,15 , 16 , 17, dans les sections de cerveau de souris. Les résultats démontrent que le BaseScope est un système idéal pour étudier les profils d’expression de Nf1 exon 23 bis in situ. Comme ce système de dosage peut être adapté à analyser comme modèles d’expression de nombreuses alternatives exons, il représente un nouvel outil puissant dans les études d’As.

Protocole

Tous des expériences décrites ici qui impliquent des souris ont été approuvés par le Comité de l’emploi et de Case Western Reserve University Institutional Animal Care. Le titre du protocole 2016-0068 (PI : Hua Lou) est le « Rôle de l’épissage alternatif pré-ARNm dans le développement des vertébrés ».

NOTE : Information de tous les équipements, les réactifs et les fournitures utilisées dans le présent protocole est incluse dans la Table des matières.

1. préparer le formol fixe paraffine encastré (FFIP) Sections

  1. Euthanasier 1 souris CD1 et 1 souris C57BL/6J par dislocation cervicale. Découpez soigneusement ouvert le crâne avec des ciseaux chirurgicaux et des forceps. Enlever le cerveau avec une boule.
    NOTE : souris mâles de 5 mois CD1 et des souris mâles C57BL/6J 3 mois ont été utilisés et ont montré des résultats similaires.
    1. Laver le cerveau avec du PBS. Difficulté tout le cerveau avec une solution contenant 10 % de formol à température ambiante (RT) pour 30 h en mettant tout le cerveau dans 50 mL de la solution de formol.
    2. Changer la solution de fixation pour PBS et incuber le cerveau dans du PBS pendant une nuit à 4 ° C. Déshydrater et incorporer le cerveau avec xylène et de paraffine à l’aide de procédures standard18.
  2. Utiliser un microtome pour couper le tissu embarqué en 5 sections µm. Mettre le ruban de la paraffine dans un bain d’eau RT tout d’abord, puis dans un bain d’eau de 45 ° C pour répandre le ruban.
    1. Quand les rides et les plis dans le ruban disparaissent, immédiatement monter sections sur lames de verre. L’air secs diapositives nuit à diapositives RT. cuire au four pendant 1 h à 60 ° C avant utilisation.

2. prétraitement de l’échantillon

  1. Déparaffiner des sections de tissu. Effectuer ces étapes sous une hotte.
    1. Remplir deux plats de lavage (Figure 1 a) avec 250 mL de xylène frais et deux avec 250 mL d’éthanol à 100 %. Insérer les lames de tissu dans un panier de lavage (Figure 1 a) et placez le lavage des grilles dans les plats de lavage suivant le temps d’incubation et l’ordre indiqué dans le tableau 1.
    2. Pendant chaque incubation, soulevez le panier de lavage haut et en bas plus de 3 fois dans le plat de lavage. Après chaque incubation, se déplacer rapidement le panier de lavage dans le prochain plat de lavage afin d’éviter les coupes de tissus ne se dessèchent pas.
    3. Après avoir terminé les étapes de l’incubation, enlever le panier de lavage avec diapositives le lave vaisselle. Placer la grille dans une étuve à 60 ° C pendant 5 min ou jusqu'à ce que les lames soient complètement secs.
  2. Dessiner une barrière 0,75 '' x 0,75 '' entourant la section de tissu avec un stylo de barrière hydrophobe. Sécher à l’air la barrière pendant 3 min à température ambiante.
  3. Prétraitez les tranches
    1. Préparer des réactifs et équipements
      1. Allumez le four d’hybridation (Figure 1 b) et régler la température à 40 ° C 30 min avant utilisation.
      2. Mouiller le papier humidification (Figure 1E) avec de l’eau distillée complètement et le mettre dans le bac de contrôle d’humidité (Figure 1, à gauche). Garder le plateau de contrôle d’humidité dans le four de l’hybridation.
      3. Préparer 700 mL de réactifs de récupération frais 1 x cible en ajoutant 630 mL de dH2O à 70 mL x 10 cible récupération réactifs.
    2. Appliquer l’eau oxygénée.
      1. Placez les diapositives déparaffinées sur le banc. Ajoutez 5 à 8 gouttes de peroxyde d’hydrogène à une section pour couvrir complètement le tissu. Incuber pendant 10 min à température ambiante.
      2. Tapez sur diapositives sur un morceau de papier absorbant pour enlever la solution de peroxyde d’hydrogène, une diapositive à la fois. Insérer la diapositive dans un rack de laver immédiatement et de déplacer la grille dans un plat à laver rempli de dH2O.
      3. Laver les diapositives en déplaçant le panier monte et descend dans l’eau distillée pendant 3 à 5 fois. Déplacer le panier de lavage pour un lavage plat rempli d’eau distillée fraîche et diapositives de lavage une fois de plus.
    3. Effectuer la récupération de la cible
      1. Placer un bécher de verre de 1 000 mL sur une plaque chauffante. Ajouter 700 mL de frais 1 x objectif récupération réactifs dans le bol et le couvrir avec une feuille. Insérer un thermomètre dans le bécher dans le film protecteur (Figure 1). Tourner sur la plaque chauffante et régler à température élevée pendant 10 à 15 min.
      2. Lorsque la température des réactifs d’extraction atteint 98 ° C, passer le contrôle de la température de la plaque chauffante de haut en bas pour maintenir une ébullition douce pour. Ne pas faire bouillir plus de 15 min.
      3. Pendant ce temps, ouvrir la feuille et mettre le panier de lavage avec des tranches à l’intérieur de la régente de récupération. Couvrir le bécher à nouveau et laisser incuber pendant 15 min.
      4. Utilisation de forceps pour enlever la grille du bécher dans un plat à laver remplie avec 200 mL de dH2O et rincer pendant 15 s.
      5. Déplacer la grille dans un plat de lavage contenant 100 % d’éthanol frais et laisser reposer 3 min. Retirer les lames et faites-les sécher dans une étuve à 60 ° C pendant 10 min.
    4. Appliquer la protéase III
      1. Placer les lames sur la grille de la tache (Figure 1, droit). Ajouter 5 gouttes de protéase III pour couvrir le tissu. Soigneusement, mettre le panier dans la barre de contrôle de l’humidité (Figure 1, à gauche) et insérez le plateau dans le four de l’hybridation de 40 ° C. Incuber pendant 30 minutes.
      2. Enlever la grille coulissante et remettre le plateau dans le four. Cliquez sur les diapositives pour enlever l’excès de liquide, une diapositive à la fois. Insérer la diapositive dans un panier de lavage et place la grille dans un plat de lavage remplie de dH2O. passez le panier haut et bas pour laver les diapositives pour les 3 - 5 fois.

3. ISH Assay

  1. Préparer les matériaux
    1. Réchauffez 50 x tampon de lavage dans une étuve à 40 ° C pendant 20 min. Mix 2,94 L de dH2O et 60 mL de 50 x tampon de lavage à faire 1 x tampon de lavage.
    2. Préparer une solution 50 % coloration hématoxyline en ajoutant 100 mL de l’hématoxyline Gill, j’ai à 100 mL de dH2O. Prepare 0,02 % (p/v) de l’eau ammoniaque en ajoutant 1,43 mL 1 N d’hydroxyde d’ammonium dans 250 mL de dH2O. Mix bien dans un récipient.
    3. Mettre les sondes et les AMP 0 – 6 réactifs à RT 30 min avant utilisation. Garder le plateau de contrôle d’humidité dans le four de l’hybridation de 40 ° C.
  2. Procédure de l’ISH
    Remarque : Pour examiner l’expression de la Nf1 isoformes d’épissage et calculer le pourcentage épissé en valeur (PSI) pour les exon 23 a, trois différentes sondes de ISH qui ciblent l’exon 23 a-inclus isoforme, exon 23 a-exclu isoforme ou deux isoformes sont utilisés (Figure 2 ). Les sondes sont utilisées sur des sections de tissu côté coupé. Afin d’assurer l’exactitude du calcul, il est essentiel que les sections de trois tissus sont traitées exactement de la même dans les étapes de détection de signaux, amplification et l’hybridation.
    1. Sonde d’hybridation.
      1. Retirer le panier de lavage de la glisse et touchez le liquide en excès de la glisse. Déposer les lames dans le panier de la tache.
      2. Utiliser un crayon pour marquer les lames avec le nom de la sonde. Mettre les trois lames de tissu de cerveau adjacente coupe être hybridée avec trois différentes sondes de Nf1 (Figure 2) ensemble. Réalisez les étapes suivantes dans l’ordre des diapositives.
      3. Ajouter 4 gouttes de sonde pour couvrir le tissu. Celui-ci glissière à la fois pour éviter que les sections se dessèchent. Placez la grille de tache dans la barre de contrôle d’humidité et insérez-le dans le four à 40 ° C pendant 2 h.
      4. Laver les lames deux fois avec le tampon de lavage. Pour chaque lavage, remplir le plat de coloration avec 200 mL de 1 x tampon de lavage et placez un panier de lavage en elle. Tapez sur le liquide en excès sur une une diapositive serviette de papier à la fois et insérer rapidement dans le panier de lavage. La grille coulissante Monter et descendre dans le plat pour 3 à 5 fois pendant 2 min à température ambiante.
      5. Pour le deuxième lavage, utilisez le tampon de lavage douce.
    2. Amplification du signal.
      1. Appuyez sur le tampon de lavage excessif de la glisse et placez-les dans le panier de la tache. Ajouter 4 gouttes de AMP 0 pour couvrir le tissu. Placez la grille de tache dans la barre de contrôle d’humidité et placez-le dans le four pendant 30 min à 40 ° C.
      2. Laver les lames deux fois avec le tampon de lavage tel que décrit ci-dessus.
      3. Répétez cette étape avec AMP 1 à 6 suivant l’ordre et la condition du tableau 2. Laver les lames deux fois après chaque étape de l’hybridation.
    3. Détection de signal
      1. Appuyez sur le tampon de lavage excessif de la glisse et placez-les dans tache rack. Ajouter 2 µL de Fast Red B à 120 µL de Fast Red (un ratio de 1/60) dans un tube de microcentrifuge. Bien mélanger et ajouter pour couvrir entièrement la section de tissu.
        Remarque : Le volume total de rouge A / B mix est basé sur le nombre et la taille des sections de tissu. Une zone de 0,75 '' x 0,75 '', 120 µL est suffisante pour une section. Utiliser le mélange de moins de 5 min et éviter l’exposition du mélange aux rayons directs du soleil ou lumière UV.
      2. Fermer le tiroir et incuber pendant 10 min à RT. supprimer la solution d’un conteneur à déchets et immédiatement insérer les diapositives dans un rack de lavage et placez la grille dans un plat de lavage rempli avec l’eau du robinet. Rincer à nouveau à l’eau fraîche.
  3. Contre-coloration des diapositives
    1. Enlever le panier de lavage l’eau du robinet puis appuyez rapidement sur du papier absorbant pour enlever l’eau d’appoint. Placer la grille dans un hématoxyline 50 % solution de coloration et immédiatement déplacer le panier et descendre plusieurs fois. Incuber pendant 2 min à température ambiante.
    2. Transfert de la grille coulissante dans le plat de l’eau du robinet. Lavez 3 à 5 fois en déplaçant le support haut et en bas et changer l’eau fraîche du robinet jusqu'à ce que les lames deviennent claires, tandis que les tissus cérébraux restent pourpres.
    3. Déplacer la grille d’un plat contenant de l’eau ammoniaque 0,02 %. Le rack monter et descendre 2 à 3 fois jusqu'à ce que les tissus deviennent bleus. Laver les diapositives 3 à 5 fois avec l’eau douce dans un plat de coloration.
  4. Montage des échantillons
    1. Passer la grille coulissante de la coloration plat à une étuve à 60 ° C et incuber pendant au moins 15 minutes, jusqu'à ce que les lames soient complètement secs.
    2. Déposer 40 µL de milieu de montage sur la lame et placer soigneusement un lamelle couvre-objet 24 x 50 mm sur la mèche de tissu. Air secs diapositives pendant 30 min à température ambiante.

4. collecte des données et l’analyse

Remarque : Utiliser un scanner de diapositives à numériser les images à un grossissement de 40 X.

  1. Témoins positifs et négatifs
    1. Pour chaque expérience, incluent des contrôles positifs et négatifs (Figure 3). Comme un bon témoin positif, signal devrait être visible sous forme de points ponctuées au grossissement X 20-40.
    2. Utilisation de la souris (Mm) - CRTAP - 1ZZ comme témoin positif. Cette sonde cible un gène de ménage commun CRTAP. Contrôle négatif, un point pour chaque 20 cellules affichant le fond de coloration par champ de microscope 20 X est acceptable.
    3. Utiliser la sonde DapB-1ZZ comme témoin négatif. Cette sonde s’adresse la dapB gène bactérien. Ces sondes de contrôle ont été utilisés dans beaucoup de tests ISH19.
  2. Détection du signal et analyse de comme modèles d’expression de Nf1 exon 23 a
    1. Comme les signaux d’hybridation sont indiqués comme points ponctuées, compter les points manuellement. Le nombre de points est corrélé avec le niveau de la transcription qui est détecté par une sonde spécifique. Notez que le nombre de points peut également être analysé par les logiciels ImageJ ou SpotStudio.
    2. Utilisez trois sondes d’hybridation exon contenant 23 a, exon 23 a-manque isoformes ou transcriptions de Nf1 totales (Figure 2). Comme les trois sondes ne peuvent pas être utilisés simultanément, utilisez trois sections de tissu de cerveau adjacent se pour hybrider à chaque sonde.
      1. Pour calculer le pourcentage (PSI) de combiner ainsi pour exon 23 a, compter le nombre de cellules et de points dans plusieurs régions du cerveau. Pour chacune des régions d’intérêt compte plus de 400 cellules de plusieurs sous-régions comme il est indiqué dans la Figure 4.
      2. Collecter les données des mêmes sous-régions pour chacune des trois sondes. Calculer PSI en nombre de points par la cellule avec la sonde d’inclusion exon 23 a / (nombre de points par la cellule avec la sonde d’inclusion exon 23 a + le nombre de point par la cellule avec l’exon23a sonde à sauter) x 100 %.

Résultats

BaseScope ISH a été réalisée à l’aide de trois souches de souris : souris de type sauvage CD1, souris de type sauvage C57BL/6J et souris mutantes Nf123aIN/23aIN dans le fond de C57BL/6J, dans quel exon 23 bis est inclus dans tous les types de cellules à la suite de site d’épissage d’ingénierie les mutations14,15.

Dans un premier temps,...

Discussion

Cette communication rend l’utilisation de BaseScope ARN ISH pour examiner comme modèles d’expression dans les sections de cerveau de souris. Il est démontré que la jonction anti-sens exon-exon sondes plus courte que 50 nucléotides peuvent cibler inclusion exon et sauter les isoformes solidement et plus précisément. En outre, les signaux qui en résulte peuvent être utilisés pour calculer les PSI d’un exon alternatif.

Quelques variantes ont été testées dans la procédure. Par e...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par l’American Heart Association [subvention 0365274B à H.L.], National Cancer Institute [GI SPORE P50CA150964 à Z.W.], National Institutes of Health [Bureau de recherche Infrastructure partagée Instrumentation Grant S10RR031845 à la microscopie photonique Imaging Facility à Case Western Reserve University] et China Scholarship Council [à X.G.].
Les auteurs remercient Richard Lee dans la lumière microscopie Imaging Core pour son aide avec la numérisation de diapositives.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Hybridization OvenAdvanced Cell Diagnostics241000ACD
Humidity Control Tray (with lid)Advanced Cell Diagnostics310012
Stain RackAdvanced Cell Diagnostics310017
Hot plateFisher Scientific1160049SH
Imperial III General Purpose IncubatorLab-Line302
Slide ScannerLeicaSCN400
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
Pretreatment kitAdvanced Cell Diagnostics322381
Hydrogen PeroxideAdvanced Cell Diagnostics2000899
Protease III*Advanced Cell Diagnostics2000901
10x Target RetrievalAdvanced Cell Diagnostics2002555
BaseScope Detection Reagent KitAdvanced Cell Diagnostics332910
AMP 0Advanced Cell Diagnostics2001814
AMP 1Advanced Cell Diagnostics2001815
AMP 2Advanced Cell Diagnostics2001816
AMP 3Advanced Cell Diagnostics2001817
AMP 4Advanced Cell Diagnostics16229B
AMP 5-REDAdvanced Cell Diagnostics16229C
AMP 6-REDAdvanced Cell Diagnostics2001820
Fast RED-AAdvanced Cell Diagnostics2001821
Fast RED-BAdvanced Cell Diagnostics16230F
50x Wash BufferAdvanced Cell Diagnostics310091
Negative Control Probe- Mouse DapB-1ZZAdvanced Cell Diagnostics701021
Positive Control Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZAdvanced Cell Diagnostics701081
Control slide-mouse 3T3 cell pelletAdvanced Cell Diagnostics310045
NameCompanyCatalog NumberComments
Other supplies
Humidifying PaperAdvanced Cell Diagnostics310015
Washing RackAmerican Master Tech Scientific9837976
Washing DishesAmerican Master Tech ScientificLWS20WH
Hydrophobic Barrier PenVector LaboratoryH-4000
Glass SlidesFisher Scientific12-550-15
Cover Glass, 24 mm x 50 mmFisher Scientific12--545-F
NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals
Ammonium hydroxideFisher Scientific002689
100% ethanol (EtOH)Decon Labs2805
formalde solutionFisher ScientificSF94-4
Hematoxylin IAmerican Master Tech Scientific17012359
Mounting MediumVector LabsH-5000
XyleneFisher Scientific173942

Références

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