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요약

현장에서 교 잡 (ISH) 사용 하는 프로토콜 짧은 센스 oligonucleotides 마우스 뇌 섹션에 대체 이전 mRNA 접합 패턴을 감지 하는 설명 되어 있습니다.

초록

대안 접합 (AS)는 인간 유전자의 90% 이상에서 발생합니다. 양자 택일로 접합된 한 exon의 표현 패턴 셀 형식 관련 패션에서 자주 통제 된다. 패턴은 일반적으로 RT-PCR 및 RNA-seq 분석 식으로 RNA 샘플을 사용 하 여 셀의 인구에서 고립. 현장에서 시험의 특정 생물 학적 구조에 대 한 식 패턴으로는 RNA 제자리에서 교 잡 (ISH) exon 전용 프로브를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 그러나 양자 택일 exons는 일반적으로 너무 exon 전용 프로브 디자인 때문에,의 사용이 제한 되었습니다. 이 보고서에서 BaseScope, 짧은 센스 oligonucleotides RNA 분에를 사용 하 여 최근에 개발 된 기술을 사용 하 여 마우스 뇌 섹션에서 식 패턴으로 분석 설명 되어 있습니다. Exon 23a neurofibromatosis 유형 1 (Nf1)의 짧은 엑손-엑손 접합 프로브 마우스 뇌 섹션에 RNA 분 분석에 높은 특이성을 가진 강력한 교 잡 신호를 전시 설명 하기 위해 예제로 사용 됩니다. 더 중요 한 것은, exon 포함 및 건너뛰는 특정 프로브와 감지 신호 안정적으로 마우스 뇌의 다른 해 부 영역에 Nf1 exon 23a 식의 값에 접합 하는 퍼센트 계산을 사용할 수 있습니다. 실험 프로토콜 및 분석에 대 한 계산 방법 선물 된다. 결과 BaseScope 식 패턴에서 제자리에로 평가 하는 강력한 새로운 도구를 제공 합니다 나타냅니다.

서문

대안 접합 (AS)는 사전 mRNA 성숙 하는 동안 발생 하는 일반적인 과정입니다. 이 과정에서는 exon 차동 성숙한 mRNA에 포함 될 수 있습니다. 따라서, AS, 통해 한 유전자 생성할 수 있습니다 많은 mRNAs 다른 단백질 제품에 대 한 코드. 그것은 추정 인간 유전자의 92-94% 대체 접합1,2를 받 다. 비정상적인 대안 접합 패턴에서 결과 유전자 변이 루 경화 증, 암3,4, myotonic 영양 장애 등 질병의 많은 수에 연결 되었습니다. 따라서 조사 하 고 인간의 질병의 새로운 치료법을 찾을 하려고 대체 접합 규제 메커니즘 이해 결정적 이다.

마찬가지로 종종 셀 형식 관련 패션에서 통제 된다. 그것은 생물 학적 시스템에서 특정 유전자의 AS 식 패턴을 결정 하는 것이 중요입니다. 그러나,이 세포, 심장, 뇌 등의 다양 한 종류를 포함 하는 복잡 한 기관 공부 때 복잡 한 됩니다. 이 경우에, 분석 결과 시스템의 이상적인 선택 RNA 제자리에서 교 잡 (ISH) 티슈를 사용 하 여 특정 유전자의 AS 식 패턴 동시에 많은 세포 유형에서 검출 될 수 있다 그래서 섹션입니다. 실제로, exon 전용 프로브 대체 exon5,,67의 식 수준을 평가 하기 위해 사용 되었습니다. 그러나,이 방법은 아니다 적합 패턴 분석으로 다음과 같은 이유로. 첫째, 기존의 틱 방법 일반적으로 사용 하는 프로브 300 이상 혈압, 척추 내부 exons (하지 첫 번째 또는 마지막 exon)의 평균 크기는 170 뉴클레오티드8,9. 둘째, 내부 양자 택일 exon의 접합 패턴을 검사 하는 exon 전용 프로브를 사용 하는 경우 조사에 의해 감지만 mRNA isoform는 exon를 감지할 수 없습니다 없이 mRNA isoform 동안 exon를 포함 하 이다. 따라서, 양자 택일 exon (PSI) 값에 접합 %의 계산 복잡 하다. 또한, 기존의 형광 틱 종종 결합 분 immunostaining, 검출 효율 및 견고성을 감소 시키는. 예를 들어 스트레스 유발 조사 연구에서 isoform acetylcholinesterase (통증)의 스위칭 접합 mRNA, digoxigenin 분 탐침에 통합 했다 및 안티-digoxigenin 항 체를 사용 하 여 감지. 또는, biotin 표시 된 프로브는 알칼리 성 인산 가수분해 효소/streptavidin 공액 및 알칼리 성 인산 가수분해 효소10기판에 의해 검색 되었습니다. 어느 방법 탐지의 감도 증가 어떤 확대 전략을 사용 합니다. 결과적으로, 그것은 낮은 수준에서 표현 되는 mRNA 사본 검색 도전 이다. 따라서, 간단 하 고 더 강력한 분 분석 결과 시스템은 식 패턴에서 제자리에분석 필요 합니다.

BaseScope는 RNAscope, 잘 설립의 플랫폼에 따라 최근 개발 하 고 널리 이용 되는 분 분석 결과 시스템. 두 분석 결과 시스템 탐지11,12의 감도 증가 하는 특정 대상 증폭 기술을 사용 합니다. 어떻게 구별 하나에서 다른 짧은 BaseScope에 대 한 50 뉴클레오티드 및 RNAscope에 대 한 300-1000 뉴클레오티드는 대상 시퀀스의 길이입니다. 따라서, 디자인 조사 대상 엑손-엑손 접합 특정 대체 mRNA isoforms를 감지 하는 것이 가능 하다. 현재 연구에서 프로시저 neurofibromatosis 식 패턴 입력 1 (Nf1) exon 23a, 같은 실험실13,,1415 에 광범위 하 게 공부 하는 대안 exon 검사 설립 , 16 , 17, 마우스 뇌 섹션에서. 결과 BaseScope는 Nf1 exon 23a 제자리의 식 패턴을 공부 하는 이상적인 시스템을 보여 줍니다. 이 분석 결과 시스템 많은 양자 택일 exons의 표현 패턴 분석에 적응 될 수 있는, 그것은 다른 이름으로의 연구에 강력한 새로운 도구 대표

프로토콜

여기에 설명 된 쥐를 포함 하는 실험의 모든 케이스 서쪽 예비 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었습니다. 2016-0068 프로토콜의 제목 (PI: 화 루)은 "척추 개발에 대체 이전 mRNA 접합의 역할".

참고: 모든 장비, 시 약 및 공급이이 프로토콜에 사용 되는 정보 자료의 테이블에에서 포함 됩니다.

1. 준비 포 르 말린 고정된 파라핀 포함 (FFPE) 섹션

  1. 자 궁 경부 전위에 의해 1 CD1 마우스와 1 C57BL/6J 마우스를 안락사. 조심 스럽게 잘라 오픈 수술가 위, 집게와 두개골. 특 종으로 두뇌를 제거 합니다.
    참고: 5 개월 CD1 남성 생쥐와 3 개월 된 C57BL/6J 남성 마우스 사용 되었고 비슷한 결과 보였다.
    1. PBS와 뇌를 씻어. 전체 뇌 말린 솔루션 50 mL에 넣어 실 온 (RT)에서 10% 포 르 말린을 포함 하는 솔루션으로 30 h 전체 뇌를 해결.
    2. PBS를 고정 솔루션을 변경 하 고 하룻밤 4 ° c.에 PBS에 뇌를 품 어 탈수 하 고 크 실 렌 그리고 파라핀 표준 절차18를 사용 하 여 두뇌를 포함.
  2. 톰을 사용 하 여 포함 된 조직 5 µ m 섹션으로 잘라. 첫 번째, 그리고 리본으로 45 ° C 물 욕조에 파라핀 리본 RT 물 욕조에 넣어.
    1. 주름과 주름 리본에서 사라질 때 즉시 유리 슬라이드에 섹션을 탑재 합니다. 사용 하기 전에 60 ° C에서 1 시간에 대 한 실시간 빵 슬라이드에서 하룻밤 건조 슬라이드에 어.

2. 샘플 전처리

  1. 조직 단면도 deparaffinize 증기 두건에서 이러한 단계를 실시 합니다.
    1. 신선한 크 실 렌과 2 100% 에탄올의 250 mL의 250 mL로 두 세척 접시 (그림 1A)를 채우십시오. 다음 표 1에 표시 된 순서 및 보육 시간 세척 요리에서 랙 세척 세척 랙 (그림 1A) 장소에 조직 슬라이드를 삽입 합니다.
    2. 각 인큐베이션 기간 동안 리프트 세척 랙 아래로 3 회 이상 세척 접시에. 각 부 화 후 신속 하 게 밖으로 건조에서 조직 단면도 방지 하기 위해 다음 세척 접시에 세척 랙을 이동 합니다.
    3. 부 화 단계를 완료 한 후 세척 접시에서 슬라이드와 세척 선반을 제거 합니다. 랙 슬라이드는 완전히 건조 될 때까지 또는 5 분 동안 60 ° C 인큐베이터에 놓습니다.
  2. 소수 성 장벽 펜 조직 단면도 둘러싼 0.75 "x 0.75" 배리어를 그립니다. 공기 건조 3 분 실시간에 대 한 장벽
  3. 분할 영역을 pretreat
    1. 시 약 및 장비 준비
      1. 교 잡 오븐 (그림 1B)를 켜고 온도를 40 ° C 사용 하기 전에 30 분 설정.
      2. 증류수와 humidifying 종이 (그림 1E)를 완전히 습식 및 습도 제어 트레이 (그림 1D, 왼쪽)에 넣어. 교 잡 오븐에 습도 제어 트레이를 두십시오.
      3. 10 x 대상 검색 시 약 70 mL를 dH2O의 630 mL을 추가 하 여 신선한 1 x 대상 검색 시 약의 700 mL를 준비 합니다.
    2. 과산화 수소를 적용 합니다.
      1. 벤치에 deparaffinized 슬라이드를 넣어. 완전히 커버 조직 섹션에 과산화 수소의 5-8 방울을 추가 합니다. 실시간에서 10 분 동안 품 어
      2. 과산화 수소 솔루션을 한 번에 한 슬라이드를 제거 하는 흡수 성 종이의 조각에 슬라이드를 누릅니다. 즉시 세척 랙에 슬라이드를 삽입 하 고 세척 접시 가득 dH2오 랙 이동
      3. 대 한 증류수에 랙을 아래로 이동 하 여 슬라이드를 씻어 3-5 시간. 세척 접시 가득 신선한 증류수 세척 슬라이드 한 번 더 세척 랙을 이동 합니다.
    3. 대상 검색 수행
      1. 뜨거운 접시에 1000 mL 유리 비 커를 놓습니다. 비 커에 700 mL 신선한 1 x 대상 검색 시 약의 추가 호 일로 다룹니다. 포 일 덮개 (그림 1C)을 통해 비 커에 온도계를 넣습니다. 핫 플레이트를 켜고 높이 10-15 분에 대 한 설정.
      2. 검색 시 약의 온도 98 ° C에 도달 하면, 가벼운 종 기를 유지 하기 위해 낮은 높이에서 핫 플레이트의 온도 제어를 전환 합니다. 15 분 이상 끓여 야 하지 않습니다.
      3. 한편, 신중 하 게 포 일을 열고 검색 젠 내부 조각와 세척 선반을 넣어. 다시 비 커를 커버 하 고 15 분 동안 품 어.
      4. 세척 접시를 비 커에서 선반을 제거 하려면 사용 하 여 집게 dH2O와 15 린스 200ml 가득한 s.
      5. 포함 하는 100% 신선한 에탄올 세척 접시 랙 이동 그리고 앉아 3 분 슬라이드를 제거 하 고 10 분 동안 60 ° C 배양 기에서 그들을 건조.
    4. 프로 테아 제 III를 적용
      1. 얼룩 랙 (그림 1D, 오른쪽)에 슬라이드를 놓습니다. 조직 커버 프로 테아 제 3의 5 방울을 추가 합니다. 조심 스럽게 랙 습도 제어 트레이 (그림 1D, 왼쪽)에 넣고 40 ° C 교 잡 오븐으로 트레이 삽입. 30 분 동안 품 어.
      2. 슬라이드 랙 제거 하 고 다시 오븐에 트레이 넣어. 제거 초과 액체, 한 번에 한 슬라이드에 슬라이드를 누릅니다. 세척 랙에서 슬라이드를 삽입 하 고 장소 세척 접시에서 랙 가득 dH2오 이동에 대 한 슬라이드를 아래로 랙 3-5 시간.

3. 분 분석 결과

  1. 재료 준비
    1. 미리 따뜻한 워시 버퍼 워시 버퍼 x 1을 x dH2O 및 50의 60 mL 20 분 혼합 2.94 L에 40 ° C 인큐베이터에 워시 버퍼 x 50.
    2. DH2dH2오 믹스의 250 mL에 1 N 수산화 암모늄의 1.43 mL을 추가 하 여 수술 준비 0.02% (w/v) 암모니아 물 100 mL를 컨테이너에 잘 하는 길의 되며 100 mL를 추가 하 여 50% 되며 얼룩 솔루션을 준비 합니다.
    3. 프로브와 앰프 0-6 사용 하기 전에 RT 30 분 시 약. 40 ° C 교 잡 오븐에 습도 제어 트레이를 두십시오.
  2. 틱 절차
    참고: isoforms를 접합 하는 n f 1 의 식 검사 하 고 exon 23a, 3 다른 분 프로브 exon 23a 포함 isoform, 대상에 대 한 값 (PSI)에 접합 하는 백분율을 계산 하려면 exon 23a 제외 isoform 또는 두 isoforms는 사용된 (그림 2 ). 프로브 adjacently 컷된 직물 단면도에 사용 됩니다. 계산의 정확도 보장 하기 위해, 그것은 3 개의 직물 단면도 처리 됩니다 중요 한 교 잡, 증폭 및 신호 감지 단계에서 정확 하 게 동일.
    1. 교 잡 조사.
      1. 세척 선반에서 슬라이드를 제거 하 고 슬라이드에서 과잉 액체를 누릅니다. 얼룩 랙에서 슬라이드를 놓습니다.
      2. 연필을 사용 하 여 프로브 이름으로 슬라이드를. 3 다른 Nf1 프로브 (그림 2)와 함께 때 교배 수 세 adjacently 컷된 뇌 조직 슬라이드를 넣어. 슬라이드의 순서에서 다음 단계를 실시 합니다.
      3. 프로브는 조직 커버를 4 방울을 추가 합니다. 섹션 밖으로 건조 하지 않도록 하려면 한 번에 한 슬라이드를 할. 습도 제어 트레이에 얼룩 선반을 놓고 2 시간 동안 40 ° C 오븐에 삽입 합니다.
      4. 씻어 슬라이드 두 번 버퍼를 세척. 각 세척에 대 한 얼룩 요리 워시 버퍼 x 1의 200 mL와 함께 그것에 세척 선반을 배치. 한 번에 종이 타월 한 슬라이드에서 과잉 액체를 누르고 신속 하 게 세척 랙에 삽입 합니다. 대 한 접시에 아래로 슬라이드 랙 이동 실시간 2 분에 대 한 3-5 시간
      5. 두 번째 세척에 대 한 신선한 워시 버퍼를 사용 합니다.
    2. 신호의 증폭
      1. 슬라이드에서 초과 워시 버퍼 누르고 얼룩 선반에 넣어. 앰프는 조직 커버를 0 4 방울을 추가 합니다. 습도 제어 트레이에 얼룩 랙 하 고 40 ° c.에 30 분 동안 오븐에 넣고
      2. 씻어 슬라이드 두 번 설명한 것 처럼 버퍼를 세척.
      3. 1-6 다음 순서 및 조건 표 2의 앰프와 함께이 단계를 반복 합니다. 두 번 각 교 잡 단계 후 슬라이드를 씻어.
    3. 신호 검출
      1. 슬라이드에서 초과 워시 버퍼 누르고 얼룩 선반에 넣어. 빨리 레드의 120 µ L에 빨리 레드 B의 2 µ L를 추가 microcentrifuge 튜브에서 (1:60 비율). 잘 혼합 하 고 완벽 하 게 커버 조직 섹션에 추가.
        참고: 빨간색의 총 볼륨 수와 조직 섹션의 크기를 기반으로 하는 B 믹스 /. 0.75 "x 0.75" 지역, 120 µ L 충분 한 부분입니다. 5 분 이내 믹스를 사용 하 고 직접적인 햇빛 또는 자외선 믹스의 노출을 피하십시오.
      2. 트레이 닫습니다 및 폐기물 컨테이너 솔루션 실시간 제거에서 10 분 동안 품 어 및 즉시 세척 랙 슬라이드 삽입 선반을 두십시오는 수돗물 가득 세척 접시에. 다시 물으로 씻어 신선한 수돗물.
  3. 슬라이드 counterstaining
    1. 수도 물에서 세척 랙 제거 하 고 신속 하 게 여분의 물을 제거 하는 흡수 성 종이에 누릅니다. 50% 되며 솔루션 얼룩으로 선반을 넣고 즉시 여러 번 위아래로 랙 이동. 실시간에서 2 분 동안 품 어
    2. 슬라이드 랙 수돗물 접시에 다시 전송 합니다. 선반을 위와 아래로 이동 하 고 슬라이드 뇌 조직 유지 보라색 명확 하 게 될 때까지 신선한 수돗물을 변경 하 여 3-5 회 세척.
    3. 랙 0.02% 암모니아 물을 포함 하는 접시에 이동. 랙 아래로 2-3 회 때까지 이동 조직 푸른색. 슬라이드 3-5 번 얼룩 요리에 신선한 수돗물으로 씻는 다.
  4. 샘플의 설치
    1. 60 ° C 인큐베이터에 얼룩 요리에서 슬라이드 랙 이동 하 고 슬라이드 완전히 건조 될 때까지 적어도 15 분 동안 품 어.
    2. 슬라이드에 장착 매체의 40 µ L을 놓고 신중 하 게 조직 섹션 24 m m x 50 m m coverslip를 배치 합니다. 실시간에서 30 분 동안 공기 건조 슬라이드

4. 데이터 수집 및 분석

참고: 40 X 배율에서 이미지를 스캔 하는 슬라이드 스캐너를 사용 합니다.

  1. 긍정적이 고 부정적인 컨트롤
    1. 각 실험에 대 한 긍정적이 고 부정적인 컨트롤 (그림 3)을 포함 합니다. 좋은 긍정적인 제어 신호는 20-40 X 확대 punctate 점으로 표시 되어야 합니다.
    2. 사용 마우스-PPIB-1ZZ 긍정적인 제어로 (Mm). 이 프로브는 일반적인 내부 관리 유전자 PPIB 대상. 부정적인 통제에 대 한 모든 20 셀 배경 20 X 현미경 필드 얼룩을 표시 한 점을 허용 됩니다.
    3. DapB 1ZZ 프로브를 사용 하 여 부정적인 컨트롤. 이 조사 대상 세균 유전자 dapB. 이러한 제어 프로브 많은 분 분석 실험19에서 사용 되었습니다.
  2. 신호 검출 및 Nf1 exon 23a의 식 패턴으로의 분석
    1. 교 잡 신호는 punctate 점으로 표시는, 수동으로 점 들을 계산 합니다. 도트 수 특정 조사에 의해 감지 되는 성적 증명서의 수준으로 상관 된다. 참고 도트 수 또한 ImageJ 또는 SpotStudio 소프트웨어에 의해 분석 될 수 있다.
    2. 3 개의 프로브를 사용 하 여 교배 exon 23a 포함, 엑손 23a 부족 isoforms, 또는 총 Nf1 성적표 (그림 2). 3 개의 프로브를 동시에 사용할 수 없습니다, 3 개의 인접 한 뇌 조직 섹션 사용 하 여 각 프로브에 교배를.
      1. Exon 23a에 대 한 (PSI)에 접합 하는 %를 계산 하려면 셀과 몇몇 두뇌 지구에서 점 들의 수를 계산 합니다. 관심의 각 지역에 대해 그림 4에 표시 된 대로 여러 하위 영역에서 400 개 이상의 셀을 계산.
      2. 각 3 개의 프로브에 대 한 동일한 하위 영역에서 데이터를 수집 합니다. 셀 당 도트 수로 계산 하는 exon 23a 포함 프로브 PSI / (exon 23a 포함 프로브 + 프로브를 건너뛰는 exon23a 셀 당 도트 수로 셀 당 점의 수) x 100%.

결과

BaseScope 분 3 마우스 종자를 사용 하 여 실시 되었다: CD1 야생 타입 마우스, C57BL/6J 야생 타입 마우스 및 C57BL/6J 배경, 어떤 exon에 23a의 결과로 모든 셀 형식에 포함 되어 있는 n f 123aIN/23aIN 돌연변이 쥐 스플라이스 사이트 설계 변이14,15.

첫 번째 단계로 분 분석 결과 시스?...

토론

이 통신 마우스 뇌 섹션에서 식 패턴으로 검사 BaseScope RNA의 사용을 보고 합니다. 그것은 그 반대로 감각 엑손-엑손 접합 프로브 exon 포함 하 고 견고 하 게 하 고 특히 isoforms를 건너뛰는 50 뉴클레오티드 대상 보다 짧은 시연입니다. 또한, 결과 신호 대체 exon의 PSI를 계산 하기 위해 사용할 수 있습니다.

몇 가지 유사 절차에서 테스트 되었습니다. 예를 들어 냉동된 조직 단면도 cr...

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

이 작품은 미국 심 혼 협회 [H.L.에 특정 0365274B]에 의해 지원 되었다 국립 암 연구소 [Z.W. GI 포자 P50CA150964], 건강의 국가 학회 [사무실의 연구 인프라 공유 계측 그랜트 S10RR031845에 가벼운 현미경 검사 법 케이스 서쪽 예비 대학에서 시설 이미지], [X.G.]를 중국 장학금 위원회.
저자는 슬라이드 스캔 빛 현미경 이미징 핵심 그의 도움에 리처드 리를 감사 합니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Hybridization OvenAdvanced Cell Diagnostics241000ACD
Humidity Control Tray (with lid)Advanced Cell Diagnostics310012
Stain RackAdvanced Cell Diagnostics310017
Hot plateFisher Scientific1160049SH
Imperial III General Purpose IncubatorLab-Line302
Slide ScannerLeicaSCN400
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
Pretreatment kitAdvanced Cell Diagnostics322381
Hydrogen PeroxideAdvanced Cell Diagnostics2000899
Protease III*Advanced Cell Diagnostics2000901
10x Target RetrievalAdvanced Cell Diagnostics2002555
BaseScope Detection Reagent KitAdvanced Cell Diagnostics332910
AMP 0Advanced Cell Diagnostics2001814
AMP 1Advanced Cell Diagnostics2001815
AMP 2Advanced Cell Diagnostics2001816
AMP 3Advanced Cell Diagnostics2001817
AMP 4Advanced Cell Diagnostics16229B
AMP 5-REDAdvanced Cell Diagnostics16229C
AMP 6-REDAdvanced Cell Diagnostics2001820
Fast RED-AAdvanced Cell Diagnostics2001821
Fast RED-BAdvanced Cell Diagnostics16230F
50x Wash BufferAdvanced Cell Diagnostics310091
Negative Control Probe- Mouse DapB-1ZZAdvanced Cell Diagnostics701021
Positive Control Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZAdvanced Cell Diagnostics701081
Control slide-mouse 3T3 cell pelletAdvanced Cell Diagnostics310045
NameCompanyCatalog NumberComments
Other supplies
Humidifying PaperAdvanced Cell Diagnostics310015
Washing RackAmerican Master Tech Scientific9837976
Washing DishesAmerican Master Tech ScientificLWS20WH
Hydrophobic Barrier PenVector LaboratoryH-4000
Glass SlidesFisher Scientific12-550-15
Cover Glass, 24 mm x 50 mmFisher Scientific12--545-F
NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals
Ammonium hydroxideFisher Scientific002689
100% ethanol (EtOH)Decon Labs2805
formalde solutionFisher ScientificSF94-4
Hematoxylin IAmerican Master Tech Scientific17012359
Mounting MediumVector LabsH-5000
XyleneFisher Scientific173942

참고문헌

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