Un modèle de glaucome induit par la Suture Circumlimbal chez le rat et la souris

Résumé

Hypertension oculaire chronique est induite en appliquant une suture de circumlimbal chez les rats et les souris, conduisant à une détérioration fonctionnelle et structurelle des cellules ganglionnaires rétiniennes conformes de glaucome.

Résumé

La suture de circumlimbal est une technique permettant d’induire expérimental glaucome chez les rongeurs en élevant chroniquement la pression intraoculaire (PIO), un facteur de risque connu de glaucome. Ce protocole montre un guide étape par étape sur cette technique en Long Evans rats et les souris C57BL/6. Sous anesthésie générale, une « » suture en bourse est appliquée sur la conjonctive, autour de l’Équateur et derrière le limbe de le œil. Le œil collègue sert un témoin non traité. Pendant toute la durée de notre étude, qui a été une période de 8 semaines pour les rats et 12 semaines pour les souris, le IOP est demeurée élevée, mesurée régulièrement par tonométrie de rebond chez des animaux conscients sans anesthésie topique. Chez les deux espèces, les yeux suturées a montré électrorétinogramme fonctionnalités compatibles avec dysfonctionnement rétinien intérieur préférentiel. Tomographie par cohérence optique a montré sélectif amincissement de la couche des fibres nerveuses rétiniennes. Histologie de la rétine de rat en coupe transversale trouvé réduit la densité des cellules dans la couche de cellules ganglionnaires, mais aucun changement dans les autres couches cellulaires. La coloration des rétines souris plat monté avec un marqueur spécifique de la cellule de ganglion (RBPMS), a confirmé la perte de cellules ganglionnaires. La suture de circumlimbal est un simple, minimalement invasive et économique moyen d’induire l’hypertension oculaire qui conduit à des lésions des cellules ganglionnaires chez les rats et les souris.

Introduction

Modèles animaux fournissent qu'une plate-forme importante pour l’étude de systèmes cellulaires en laboratoire processus sous-jacent pathogenèse de glaucome, ainsi que d’évaluer les interventions thérapeutiques possibles. Plusieurs modèles inductibles ont été développés pour produire l’élévation soutenue de la pression intraoculaire (PIO), le plus important facteur de risque de glaucome. Les méthodes qui ont été appliqués pour élever IOP comprennent : une injection saline hypertonique dans épiscléral¹, photocoagulation laser du trabéculum² ou des veines limbique³et intracameral injection de substances telles que les veines fantôme rouge globules⁴, microbilles^5,6 et viscoélastique agents⁷. Chaque approche a ses avantages et ses limites.

Un bon modèle pour le glaucome devrait imiter le processus de la maladie, avec complication minime comme des opacités traumatisme, inflammation et médias. Ces complications sont souvent associées avec les procédures utilisées pour induire l’élévation des IOP et peuvent confondre interprétation des résultats. Par exemple, ponction de la chambre antérieure, même lorsque les substances étrangères ne sont pas introduites, s’est avérée causer un traumatisme et une inflammation qui n’est pas représentative du changement glaucomateuse typique^8,9. En plus de l’importance d’éviter l’inflammation, maintenant clarté optique facilite l’imagerie in vivo et électrophysiologie pour surveiller la progression de la maladie. Même si on ne sait pas dans quelle mesure ces complications peuvent affecter les enquêtes de la maladie, il peut être préférable d’éviter de pénétrer dans le œil durant l’induction modèle. L’approche de suture circumlimbal évite la pénétration du globe et facilite en vivo une évaluation longitudinale de structure rétinienne et la fonction. Plus important encore, ce modèle diffère des précédents dans sa capacité à retourner IOP aux valeurs de base par l’enlèvement de la suture au besoin. Normalisation de l’IOP peut-être être utile pour étudier le cellulaire et moléculaires corrélats du ganglion réversible et irréversible cellulaire blessure^{10,11,12,13,14}.

Cet article se concentre sur la technique d’induction de modèle. Caractérisation de la lésion rétinienne induite par ce modèle chez les rats et les souris se trouvent plus en détail ailleurs^{15,16,17,18,19}.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été menées selon le Code de pratique australienne pour le soin et l’utilisation des animaux à des fins scientifiques, défini par la National Health and Medical Research Council en Australie. Approbation éthique a été obtenue de la Commission d’éthique de l’Animal Institut Howard Florey (agrément n° 13-044-UM et 13-068-UM pour les rats et les souris, respectivement).

1. mesure de la pression intraoculaire chez le rat éveillé

1. Régler le tonomètre de rebond du laboratoire à la rat. Emmailloter le rat éveillé dans un morceau de chiffon doux pour calmer l’animal. Exposer la tête et du cou. Doucement, maintenir le torse dans une main, avec le dos de l’animal au repos contre la poitrine de l’enquêteur.
   Remarque : Anesthésie topique n’est pas nécessaire.
2. Utilisez l’autre main pour apporter le tonomètre de rebond près oeil de rat, alors que la pointe de la sonde de l’IOP est environ 2-3 mm loin d’et perpendiculaire à l’apex cornéen. Utiliser la main droite pour mesurer le IOP dans le œil droit de l’animal et la main gauche pour le œil gauche.
3. Attendez quelques secondes pour le rat pour calmer et appuyez une fois sur le bouton de mesure. Observer que l’extrémité de la sonde IOP frapper doucement l’apex cornéen une fois ; et d’entendre le bip du tonomètre rebond une fois.
   Remarque : Un seul bip du tonomètre confirme mesure réussie, ce qui peut être lu à partir de l’écran LCD. Un double bip indique une erreur de mesure. Erreurs de mesure peuvent découlent de facteurs tels que la distance de travail inapproprié entre la sonde et la cornée, une inclinaison excessive dans l’orientation du tonomètre, ou la sonde, suppression de la paupière ou une partie non centrale de la cornée. Consulter le manuel du tonomètre rebond du fabricant pour plus de détails au sujet des erreurs de mesure.
4. Répétez l’étape 1.3 dix fois à intervalle de 1-2 seconde, ces mesures de dériver une valeur moyenne de la PIO pour ce point dans le temps. Réinitialiser le tonomètre après la lecture de^th 5.
5. Pour la série surveillance, mesurer IOP en même temps de la journée et sous un éclairage uniforme pour réduire au minimum la variation due à la diurne IOP cycle^20,21.

2. mesure de la pression intraoculaire chez des souris conscientes

1. Réglez le tonomètre de rebond à la souris selon les instructions du fabricant.
2. Pour empêcher la souris à la main, placez votre souris sur un gril de cage et tirer doucement vers l’arrière sur la queue.
   Remarque : Cela va amener l’animal pour une adhérence sur la grille métallique avec ses pattes avant et essayer de se tirer vers l’avant, qui s’étire un peu son corps.
   1. Utilisez l’autre main pour saisir la peau lâche immédiatement derrière les oreilles. Fixez le bas du corps de l’animal en tenant la queue entre l’annulaire et le majeur (ou entre le petit doigt et votre paume).
      NOTE : Essayez de ne pas saisir la peau trop serrée, afin d’éviter l’asphyxie et exerçant une pression sur les yeux.
3. Avec la main libre maintenant (initialement tenant la queue), apporter le tonomètre de rebond près de œil de la souris, afin que la pointe de la sonde de l’IOP est environ 2-3 mm d’et perpendiculaire à l’apex cornéen. Pour mesurer l’autre œil, faire pivoter la souris alors que l’autre oeil est maintenant devant le tonomètre.
4. Attendez que la souris calmer et appuyez une fois sur le bouton de mesure. Observer que l’extrémité de la sonde IOP frapper doucement l’apex cornéen ; avec un seul bip confirmant la mesure réussie.
   Remarque : Un double bip indique une erreur de mesure. Il peut aider à avoir une deuxième lecture de l’expérimentateur et document les lectures de IOP alors que le premier expérimentateur prend les mesures.
5. Répétez l’étape 2.4 pour obtenir dix lectures réussies pour dériver un IOP. Réinitialiser le tonomètre après la lecture de^th 5. Laissez un intervalle de 1 à 2 secondes entre les lectures.
6. Selon la série mesure chez les rats, mesurer souris IOP en même temps de la journée et sous un éclairage uniforme.

3. induction d’élévation de la pression intraoculaire chez des Rats anesthésiés et souris

1. Nettoyer le banc chirurgical avec chlorhexidine 0,5 % dans l’éthanol à 70 %. Couvrir le banc avec draps stériles. Autoclave tout équipement chirurgical au préalable. S’assurer que tous les expérimentateurs portent des équipement de protection individuelle (masques chirurgicaux, peignoirs et gants stérilisés).
2. Pour induire l’anesthésie générale, placer l’animal dans une chambre à induction. Fournir 3 à 3,5 % isoflurane avec O₂ à un débit de 3 L/min.
   1. Maintenir l’anesthésie à l’isoflurane de 1,5 % à 2 L/min livré via un masque rongeurs tout au long de la chirurgie. Assurer une profondeur suffisante de l’anesthésie en l’absence d’un réflexe de pincée de patte.
   2. Éviter une dépression respiratoire en ajustant le débit lorsque cela est nécessaire pour maintenir le taux respiratoire après environ 60 respirations/min.
3. Choisir au hasard un œil pour induire une hypertension oculaire, à le œil controlatéral pour servir un témoin non traité. Instiller une goutte de solution ophtalmique proxymetacaine à 0,5 % pour l’anesthésie topique. Pour nettoyer la surface oculaire, rincer le œil avec 3 mL de sérum physiologique stérile.
4. Couvrir l’animal avec un drapé chirurgical stérile, fenêtré, exposant le œil pour être suturés.
5. Effectuer une suture en bourse sur la conjonctive bulbaire dans le monde entier. Chez le rat, tissent la suture nylon parallèle de 7/0 et 2 mm postérieur à la limbe (Figure 1). Chez les souris, placer le fil de nylon de 10/0 à 1 mm postérieur à la limbe.
   1. Prendre soin de ne pas pour pénétrer la sclère. Une dilatation pupillaire soudaine pendant l’intervention chirurgicale indique la sclérotique a probablement été pénétrée.
   2. Ancre la suture sur la conjonctive à l’aide de 5 à 6 points d’ancrage chez les rats et 4-5 points d’ancrage chez les souris.
   3. Éviter une compression directe sur les nervures principales épiscléral en enfilant la suture sous la conjonctive au croisement de ces veines.
      Remarque : Alors que nous recommandons d’éviter la compression de la veine épiscléral majeur chez les rats, pas systématiquement cela chez les souris en raison de la faible visibilité de ces veines dans les yeux de la souris. Même si les nervures principales ne sont pas compressées directement, il est probable que les petits navires dans le plexus de veine d’épiscléral sont sous pression, qui peut être un facteur contribuant à l’élévation des IOP soutenue (voir Discussion pour mécanisme d’élévation des IOP).
6. Fixez la suture en bourse en attachant un nœud coulant puis suivi d’un deuxième noeud simple (Figure 1). Pour éviter un pic IOP post-chirurgicale excessivement élevé, ont un assistant mesurer le IOP immédiatement avant de fixer le deuxième nœud.
   1. Si l’IOP est jugé trop élevé, ajustez le noeud de glissement en libérant partiellement la tension à une extrémité de la suture (flèche dans la Figure 1A).
   2. Après le IOP désirée est obtenue (idéalement de 30 à 60 mmHg chez les rats ou 30-40 mmHg chez les souris), cravate sur le deuxième nœud tout en maintenant une force de traction continue sur cette extrémité de la suture (flèche dans la Figure 1A).
   3. Après le deuxième noeud a été resserré, couper les extrémités du fil de suture afin de minimiser toute sensation de corps étranger. Surveiller l’animal au cours de la récupération de l’anesthésie générale.
      Remarque : Il est important de spécifier le slipknot pour attacher le noeud premier d’assurer adéquate compression vers l’intérieur sur le œil. Après plusieurs semaines, on constate généralement que les extrémités sont incrustent dans la conjonctive.

4. surveillance IOP

1. Prendre la première mesure de la PIO à 2 minutes après une opération sous anesthésie isoflurane. Par la suite, surveiller l’IOP lorsque le rongeur a repris conscience selon les étapes susmentionnées 1 et 2.
   NOTE : Surveiller la PIO deux fois au cours de la première journée (2 minutes et 1 heure), tous les jours durant la première semaine et une ou deux fois par semaine par la suite.

5. analyse de fonction et la Structure rétinienne

1. À l’expérimental point final (dans ce cas après 8 semaines chez les rats et souris de 12 semaines), sous anesthésie générale avec une injection intrapéritonéale de kétamine/xylazine, mesurer la fonction rétinienne avec l’obscurité électrorétinogramme (ERG) tel que décrit plus en détail ailleurs^15,16,17.
   NOTE : Nous avons trouvé robustes dysfonction des cellules ganglionnaires, amincissement de la couche de la fibre nerveuses rétiniennes et ganglion cell perte pour des durées entre 8 et 12 semaines. D’autres ont utilisé avec succès des périodes plus longues de IOP altitude^14,15.
2. Immédiatement après la mesure de l’ERG, mesurer l’épaisseur de la couche des fibres nerveuses rétiniennes (CFNR) et épaisseur rétinienne totale utilisant le domaine spectral optique cohérence tomographie par SD- ^16,18.
3. À la fin de l’étude longitudinale, euthanasier les animaux sous anesthésie profonde.
   1. Disséquer la rétine pour histologie¹⁸, par exemple l’immunomarquage de rétine entier-Montez à l’aide d’un anticorps spécifique de cellule (RGC) ganglionnaires rétiniennes comme la protéine de liaison à l’ARN avec plusieurs anticorps épissage (RBPMS) ou domaine homéotique/POU cerveau-spécifique protéine 3 a (Brn3a)^16,19,22.

Résultats

Les résultats suivants dans les rats et les souris^{18 16} ont été rapportées et sont résumés ci-dessous. La suture circumlimbal produit un schéma similaire de l’élévation des IOP chez les rats et les souris (Figure 2). Un bref pic IOP, jusqu'à 58,1 ± 2,7 mmHg chez les rats et 38,7 ± 2,2 mm Hg chez la souris, a été constaté immédiatement après l’intervention de la suture. Chez le rat, grandeur ...

Discussion

La suture de circumlimbal est un nouveau modèle d’hypertension oculaire chronique. Outre les études dont les résultats représentatifs sont d’origine^16,18, ce modèle animal a été utilisé dans un certain nombre de récentes études^{15,23,24,25 ,26}. Comparaison entre ces rapports précédents ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
normal saline	Baxter International Inc	AHB1323	Maintain corneal hydration during surgery
Chlorhexadine 0.5%	Orion Laboratories	27411, 80085	Disinfection of surgical instrument
Isoflurane 99.9%	Abbott Australasia Pty Ltd	CAS 26675-46-7	Proprietory Name: Isoflo(TM) Inhalation anaaesthetic. Pharmaceutical-grade inhalation anesthetic mixed with oxygen gas for suture procedure
ocular lubricant	Alcon Laboratories	1618611	Proprietory Name: Genteal, ocular lubricant to keep the other eye moist
Needle holder (microsurgery)	World Precision Instruments	555419NT	To hold needle during ocular surgery
Proxymetacaine 0.5%	Alcon Laboratories	CAS 5875-06-9	Topical ocular analgesia
Scissors (microsurgery)	World Precision Instruments	501232	To cut excessive suture stump during ligation
Surgical drape	Vital Medical Supplies	GM29-612EE	Ensure sterile enviornment during surgery
Suture needle for rats (microsurgery)	Ninbo medical needles	151109	8-0 nylon suture attached with round needle, cutting edge 3/8, dual-needle, suture length 30cm
Suture needle for mice (microsurgery)	Ninbo medical needles	160905	10-0 nylon suture attached with round needle, cutting edge 3/8, dual-needle, suture length 30cm
Tweezers (microsurgery)	World Precision Instruments	500342	Manipulate tissues during ocular surgery
rebound tonometer	TONOLAB, iCare, Helsinki, Finland	TV02	for intraocular pressure monitoring