쥐와 쥐에 Circumlimbal 봉합에 의해 유도 된 녹 내장의 모델

요약

만성 안구 고혈압 쥐와 쥐, 일치 녹 내장 망막 신경 절 세포의 기능 및 구조 저하로 이어지는 circumlimbal 봉합을 적용 하 여 유도 된다.

초록

Circumlimbal 봉합 만성 안구 내부 압력 (IOP), 녹 내장에 대 한 잘 알려진 위험 요소를 높이기에 의해 설치류의 실험 녹 내장을 유발 하는 기술 이다. 이 프로토콜에서는 긴 에반스 쥐 및 C57BL/6 쥐에이 기술에 대 한 단계별 가이드를 보여 줍니다. 일반 마 취, "지갑-문자열" 봉합 결, 적도 주위와 눈의 limbus 뒤에 적용 됩니다. 동료 눈 치료 컨트롤 역할을 합니다. 우리의 연구는 쥐에 대 한 8 주와 12 주 마우스의 기간의 기간 동안 IOP 리바운드 tonometry 국 소 마 취 없이 의식이 있는 동물에 의해 정기적으로 측정 된 높은, 남아. 두 종에서 sutured 눈 보여주었다 electroretinogram 기능을 우선 내부 망막 장애와 일치. 광학 일관성 단층 촬영 망막 신경 섬유 층의 선택적 숱이 보였다. 조직학 발견 횡단면에 쥐 망막의 신경 절 세포 층에 세포 밀도 하지만 다른 세포 층에 변화가 감소. 신경 절 세포 특정 표시 (RBPMS)와 함께 평면 탑재 마우스 retinae의 얼룩 ganglion 셀 손실 확인. Circumlimbal 봉합은 간단한, 최소한 침략 적이 고 비용 효율적인 방법으로 쥐 및 쥐에서 신경 절 세포 상해에 이르게 눈의 고혈압을 유발 하.

서문

동물 모델 평가 잠재적인 치료 내정간섭으로 기본 녹 병, 잘을 처리 하는 세포의 실험실 조사에 대 한 중요 한 플랫폼을 제공 합니다. 여러 모델을 유도할 수 있는 지속적인된 intraocular 압력 (IOP) 상승, 녹 내장에 대 한 가장 중요 한 위험 요소를 생산 하기 위해 개발 되었습니다. IOP 상승에 적용 된 방법은 다음과 같습니다: episcleral에 고 식 염 수 주입 혈관¹, 레이저 photocoagulation 배수 채널² 의 또는 limbal 혈관³및 intracameral와 같은 물질의 주입 빨간 유령 혈⁴, microbeads^5,6 , 점 탄성 요원⁷. 각 방법의 장점과 한계는 있습니다.

녹 내장에 대 한 좋은 모델 외상, 염증 및 미디어 불투명도 등 최소한의 합병증과 질병 과정을 모방 해야 합니다. 이러한 합병증 IOP 상승, 유도 하는 데 사용 하는 절차와 자주 연결 되 고 결과의 해석을 혼동 수 있습니다. 예를 들어 paracentesis 앞쪽 챔버의 이물질은 도입 되지, 하는 경우에 표시 되었습니다 외상 및 염증의 전형적인 glaucomatous 변경^8,9은 아닙니다 원인. 염증 방지의 중요성 뿐만 아니라 vivo에서 이미징 및 질병의 진행을 모니터링 하는 생리학 용이 광학 선명도 유지. 이러한 합병증 질환 조사, 영향을 미칠 수 있지만 그것은 어느 정도까지 불분명 모델 유도 하는 동안 눈을 관통 하지 않도록 더 있을 수 있습니다. Circumlimbal 봉합 접근 세계의 침투를 방지 하 고 망막의 구조와 기능의 비보에 경도 평가 용이 하 게. 더 중요 한 것은,이 모델은 필요할 때 봉합의 제거에 의해 초기 계획 값을 IOP를 반환 에서 이전 그들에서 다릅니다. 되돌릴 수와 돌이킬 수 없는 신경 절의 분자 상호 세포 상해^{10,11,12,,1314}그리고 IOP 정규화 세포를 공부 하는 데 유용 수 있습니다.

이 문서는 모델 유도 대 한 기술에 초점을 맞추고. 쥐와 쥐에이 모델에 의해 유도 된 망막 상해의^{15,,1617,,1819}자세히 다른 곳에서 찾을 수 있습니다.

프로토콜

모든 실험 절차는 과학적 목적, 호주에서 국민 건강 및 의료 연구 위원회에 의해 설정에 대 한 관심과 동물의 사용에 대 한 호주 코드 연습에 따라 실시 했다. 하 워드 Florey 연구소 동물 윤리 위원회에서 윤리 승인을 얻은 (승인 번호 13-044-UM 그리고 13-068-음 쥐와 생쥐, 각각).

1. 안 구내 압력 측정 의식 쥐에

1. 실험실 리바운드 tonometer 쥐 설정으로 설정 합니다. 진정 동물을 부드러운 헝겊 조각에 깨어 쥐 swaddle 머리와 목 노출. 탐정의 가슴에 대하여 휴식 하는 동물의 다시 몸통 한 손에 부드럽게 잡으십시오.
   참고: 국 소 마 취는 필요 하지 않습니다.
2. 사용 하 여 다른 손을가지고 쥐의 눈 근처 리바운드 tonometer IOP 프로브 팁은 약 2-3 m m에서 및 수직 각 막 정점에. 오른손을 사용 하 여 동물의 오른쪽 눈과 왼쪽된 눈에 대 한 왼손에 IOP를 측정.
3. 진정 하 고 측정 한 번 하는 쥐에 대 한 몇 초 동안 기다립니다. IOP 프로브 팁 부드럽게 명 중 각 막 정점 한번; 관찰 그리고 리바운드 tonometer 비프음을 한 번 듣고.
   참고: 단일 비프음은 tonometer의 성공적인 측정, LCD 화면에서 읽을 수 있는 확인 합니다. 이중 비프음 측정 오류를 나타냅니다. 측정 오류 조사 및 각 막, tonometer, 또는 눈 꺼 풀 또는 각 막의 중앙이 아닌 일부 눈에 띄는 조사 방향에 과도 한 기울기 사이의 부적절 한 작동 거리 같은 요인에서 발생할 수 있습니다. 측정 오류에 관한 더 세부 사항에 대 한 제조 업체에서 리바운드 tonometer 설명서를 참조 하십시오.
4. 10 번에 1-2 초의 간격 1.3 단계를 반복, 이러한 측정에서 그 시간 지점에 대 한 평균 IOP 값을 파생. 5^번째 읽기 후에 tonometer를 다시 설정 합니다.
5. 직렬 모니터링, IOP 하루의 고 일주 IOP 사이클^20,21인 변화를 최소화 하기 위해 일관 된 조명 조건 하에서 같은 시간에 측정 합니다.

2. 의식이 쥐 안 구내 압력 측정

1. 제조업체의 지시에 따라 마우스 설정에 리바운드 tonometer를 설정 합니다.
2. 손으로 마우스를 억제, 그릴 케이지 위에 마우스 놓고 살짝 꼬리를 뒤로 당겨.
   참고:이 동물 그것의 몸을 스트레칭 약간 앞 다리와 시도 자체를 앞으로, 금속 그릴에 그립을 자극할 것 이다.
   1. 다른 손을 사용 하 여 즉시 귀 뒤에 느슨한 피부를 파악. 테일 링 손가락과 가운데 손가락 사이 (또는 작은 손가락과 손바닥 사이)를 개최 하 여 동물의 체를 보안 합니다.
      참고: 질 식과 눈에 적용 압력을 피하기 위해 너무 꽉 피부를 파악 하지 않으려고.
3. 지금 무료 손 (처음 들고 꼬리), IOP 프로브 팁은 약 2-3 m m 및 수직 각 막 정점에 마우스의 눈 근처 리바운드 tonometer가지고. 다른 눈을 측정 하는 다른 눈 이제는 tonometer 앞 마우스를 회전 합니다.
4. 진정 하 고 측정의 단추 한 번 마우스를 기다립니다. IOP 프로브 팁 부드럽게 칠 각 막 정점; 관찰 단일 경고음이 시스템이 성공 측정을 확인.
   참고: 이중 비프음 측정 오류를 나타냅니다. 그것을 두 번째 실험 읽기 및 문서 IOP 읽기 첫 번째 실험은 측정 하는 동안 도움이 됩니다.
5. 2.4 파생 된 IOP 10 성공적인 읽기를 반복 합니다. 5^번째 읽기 후에 tonometer를 다시 설정 합니다. 읽기 1-2 초 간격을 허용 한다.
6. 쥐에서 직렬 측정에 의하여 오늘의 하 고 일관 된 조명 조건 하에서 동시에 마우스 IOP를 측정 합니다.

3. 마 취 쥐 및 쥐에 안구 내부 압력 상승의 유도

1. 70% 에탄올에 0.5% 액체와 수술 도구를 청소 합니다. 무 균 커튼으로 벤치를 커버. 오토 클레이 브 모든 수술 장비 사전. 적절 한 개인 보호 장비 (스 쿠와 멸 균된 장갑, 가운)을 착용 하는 모든 경험을 확인 하십시오.
2. 전신 마 취 유도, 유도 챔버에서 동물을 배치 합니다. 3 L/min의 유량에 O₂ 와 3-3.5 %isoflurane 제공 합니다.
   1. 1.5 %2 L/min 전달 통해 수술 내내 설치류 얼굴 마스크에서 isoflurane와 마 취를 유지 합니다. 발 핀치 반사의 부재에 의해 마 취의 충분 한 깊이 확인 합니다.
   2. 때 약 60 호흡/분 호흡 속도 유지 하기 위해 필요한 유량을 조정 하 여 호흡을 하지 마십시오.
3. 치료 컨트롤 역할을 contralateral 눈으로, 눈의 고혈압을 유발 하는 눈 하나를 임의로 선택 합니다. 국 소 마 취에 대 한 0.5 %proxymetacaine 안과 솔루션의 한 방울을 주는. 눈 표면을 청소, 살 균 정상적인 염 분의 3 mL와 함께 눈을 씻어 하십시오.
4. 커버는 살 균, fenestrated 수술 드 레이프, 봉합 될에 눈을 노출 된 동물.
5. 전세계 안구 결 막에 지갑 문자열 봉합을 수행 합니다. 쥐, 7/0 나일론 봉합 병렬 및 2mm 후부 limbus (그림 1) 짜 다. 쥐, 장소 10/0 나일론 봉합 1 m m는 limbus를 후부.
   1. 알아서 하지 여 sclera에 침투. 수술 하는 동안 갑자기 동 공 팽창이 나타냅니다는 sclera 침투 가능성이 있다.
   2. 5-6 앵커 포인트 쥐, 및 쥐에 4-5 앵커 포인트를 사용 하 여 결 막에 봉합 앵커.
   3. 이러한 정 맥의 교차점에 결 막 아래 봉합을 스레딩 하 여 주요 episcleral 혈관에 직접 압축을 하지 마십시오.
      참고: 쥐에 있는 주요 episcleral 정 맥의 압축을 피하는 것이 좋습니다, 하는 동안이 수행 되지 않습니다 정기적으로 쥐 마우스 눈에서 이러한 혈관의 낮은 가시성 때문에. 주요 정 맥 직접 압축 되지 않는다 하더라도 그것은 episcleral 정 맥 총에 작은 혈관 압력, 기여 지속적인된 IOP 상승 하는 요인이 될 수 있는 가능성이 (IOP 상승의 메커니즘에 대 한 논의 참조 하십시오).
6. 두 번째 간단한 매듭 (그림 1)에 의해 다음 매듭을 매 서 지갑 문자열 봉합 고정. 지나치게 높은 수술 후 IOP 스파이크를 방지 하려면 조 두 번째 매듭을 체결 직전 IOP를 측정할 수가 있다.
   1. IOP 너무 높게 되 면 부분적으로 봉합 ( 그림 1A화살표)의 한쪽 끝에 긴장을 방출 하 여 슬립 매듭을 조정 합니다.
   2. 후 원하는 IOP 이루어집니다 (이상적으로 30-60 mmHg 쥐 또는 쥐에 30-40 mmHg), 봉합 ( 그림 1화살표)의 끝에는 연속 당기는 힘을 유지 하면서 두 번째 매듭에서 넥타이.
   3. 두 번째 후 매듭 강화 되었습니다, 그리고 어떤 외국 몸 센 세이 션을 최소화 하기 위해 봉합의 끝을 잘라. 전신 마 취에서 회복 하는 동안 동물을 모니터링 합니다.
      참고: 그것은 눈에 적절 한 내부 압축 되도록 때 첫 매듭을 매는 매듭을 사용 하는 것이 중요입니다. 몇 주 후 끝 결 막에 포함 되 고 일반적으로 주의 된다.

4. 모니터링 IOP

1. Post-operatively isoflurane 마 취 아래 2 분에서 첫 번째 IOP 측정을 가져가 라. 설치류는 앞서 언급 한 1 단계와 2 단계에 의하여 의식 회복 하는 때 그 후, IOP를 모니터링 합니다.
   참고: 매일 첫 주에 한 번 또는 두 번 주당 그 후 두 번 (2 분, 1 시간), 첫 번째 하루 동안 IOP를 모니터링 합니다.

5. 시 금 망막 구조와 기능

1. 설명 된 대로 측정 dark-adapted electroretinogram (에) 망막 기능을 원하는 실험 끝 지점에서 (이 경우에 8 주 쥐 및 쥐에 있는 12 주 후), 케 타 민/xylazine와 복 주입을 사용 하 여 일반 마 취, 자세히 다른^15,,1617.
   참고: 우리가 발견 강력한 신경 절 세포 기능 장애, 망막 신경 섬유 층 숱이 고 신경 절의 세포 손실 8 ~ 12 주 사이의 기간에 대 한. 다른 사람 성공적으로 IOP 상승^14,15의 긴 기간을 고용 했다.
2. 직후에 측정, 망막 신경 섬유 층 (RNFL)의 두께 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 (SD-10 월) ^16,18를 사용 하 여 전체 망막 두께 측정 합니다.
3. 종 적 연구의 끝에, 깊은 마 취 동물 안락사.
   1. 해 부 조직학¹⁸, 다중 접합 항 체 (RBPMS) 또는 뇌 특정 homeobox/POU 도메인 RNA 의무적인 단백질 등 망막 신경 절 세포 (RGC) 특정 항 체를 사용 하 여 전체 마운트 망막의 예를 들어 immunostaining에 대 한 망막 단백질 3A (Brn3a)^16,,1922.

결과

쥐¹⁸ 및 마우스¹⁶ 다음 결과 이전에 보고 된 고 여기 요약 된다. Circumlimbal 봉합 사 생산 IOP 상승 쥐와 생쥐 (그림 2)에서 비슷한 패턴. 간단한 IOP 스파이크, 최대 58.1 ± 2.7 mmHg 쥐에서와 쥐, 38.7 ± 2.2 mmHg 봉합 수술 후 즉시 발견 되었다. 쥐, IOP 크기 3와 24 시간, 각각¹⁵에 44 ± 6 mmHg 그리고 32 ± 2 mm Hg, 수 ?...

토론

Circumlimbal 봉합 만성 눈의 고혈압의 새로운 모델입니다. 연구는 대표적인 결과 공급된^16,18, 뿐만 아니라이 동물 모델은 최근 연구^{15,,2324,25의 수에 이용 되어 ,26}. 이러한 이전 보고서에 걸쳐 비교는 방법은 모델 유도 동안 IOP 상승, ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
normal saline	Baxter International Inc	AHB1323	Maintain corneal hydration during surgery
Chlorhexadine 0.5%	Orion Laboratories	27411, 80085	Disinfection of surgical instrument
Isoflurane 99.9%	Abbott Australasia Pty Ltd	CAS 26675-46-7	Proprietory Name: Isoflo(TM) Inhalation anaaesthetic. Pharmaceutical-grade inhalation anesthetic mixed with oxygen gas for suture procedure
ocular lubricant	Alcon Laboratories	1618611	Proprietory Name: Genteal, ocular lubricant to keep the other eye moist
Needle holder (microsurgery)	World Precision Instruments	555419NT	To hold needle during ocular surgery
Proxymetacaine 0.5%	Alcon Laboratories	CAS 5875-06-9	Topical ocular analgesia
Scissors (microsurgery)	World Precision Instruments	501232	To cut excessive suture stump during ligation
Surgical drape	Vital Medical Supplies	GM29-612EE	Ensure sterile enviornment during surgery
Suture needle for rats (microsurgery)	Ninbo medical needles	151109	8-0 nylon suture attached with round needle, cutting edge 3/8, dual-needle, suture length 30cm
Suture needle for mice (microsurgery)	Ninbo medical needles	160905	10-0 nylon suture attached with round needle, cutting edge 3/8, dual-needle, suture length 30cm
Tweezers (microsurgery)	World Precision Instruments	500342	Manipulate tissues during ocular surgery
rebound tonometer	TONOLAB, iCare, Helsinki, Finland	TV02	for intraocular pressure monitoring