JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Хронический глазной гипертензии индуцируется применения circumlimbal шва у крыс и мышей, ведущих к ухудшению функциональных и структурных клеток сетчатки ганглия, согласуется с глаукомой.

Аннотация

Шовный материал circumlimbal — это метод для стимулирования экспериментальной Глаукома у грызунов, хронически повышение внутриглазного давления (ВГД), хорошо известный фактор риска для глаукомы. Этот протокол демонстрируется пошаговое руководство по этой техникой в длинные Эванс крыс и мышей C57BL/6. Под общим наркозом «кошелек строка» шов применяется на конъюнктиве, вокруг экватора и за лимба глаза. Парень глаз служит необработанных элемента управления. На протяжении нашего исследования, который был в течение 8 недель для крыс и 12 недель для мышей, ВГД остается повышенным, как регулярно измеряется тонометрия отскок в сознательных животных без местной анестезией. В обоих видов зашивается глаза показал сравнительно функций соответствует преференциальных внутренний сетчатки дисфункции. Оптическая когерентная томография показала выборочного прореживания слой сетчатки нервных волокон. Гистология крысы сетчатки в поперечном сечении нашли уменьшить плотность клеток в слоя клеток ганглия, но никаких изменений в других клеточных слоев. Окрашивание retinae монтируется с плоским мыши с маркером конкретных клеток ганглия (RBPMS) подтвердил потери клеток ганглия. Шовный материал circumlimbal является простой, минимально инвазивных и экономически эффективный способ, чтобы побудить глазной гипертензии, что приводит к повреждения клеток ганглия крыс и мышей.

Введение

Животные модели обеспечивают важную платформу для лабораторных исследований сотовых обрабатывает базовый глаукомы патогенеза, а также оценки потенциальных терапевтических вмешательств. Были разработаны несколько индуцибельной модели для получения устойчивой внутриглазного давления (ВГД) высоте, наиболее важным фактором риска для глаукомы. Методы, которые были применены для повышения ВГД включают: гипертонический солевой раствор для инъекций в эписклеральные жил1, лазерная фотокоагуляция Трабекулярная сеть2 или послабляющие вен3и инъекций intracameral веществ, таких как Призрак красные кровяные клетки4, микрошарики5,6 и вязкоупругих агентов7. Каждый подход имеет свои преимущества и ограничения.

Хорошая модель для глаукомы должен имитировать процесс болезни, с минимальной сложности такие травмы, воспаления и СМИ помутнений. Эти осложнения часто связаны с процедурами, используется, чтобы вызвать повышение ВГД, а может посрамить интерпретации результатов. Например пункция передней камеры, даже когда не вводятся инородных веществ, было показано вызвать травмы и воспаление, которое не является представителем типичных Глаукомная изменения8,9. Помимо важности недопущения воспаления поддержание Оптическая прозрачность облегчает в vivo изображений и электрофизиологии контролировать прогрессирование болезни. Хотя неясно, в какой степени эти осложнения могут влиять на болезнь расследования, он может быть лучше, чтобы избежать проникновения в глаза во время индукции модель. Circumlimbal шов подход позволяет избежать проникновения земного шара и облегчает в vivo Продольная Оценка сетчатки структуры и функции. Что еще более важно эта модель отличается от предыдущих в его способности вернуть ВГД до исходных значений путем удаления швов при необходимости. IOP нормализации может быть полезным для изучения сотовой и молекулярных корреляты обратимые и необратимые ганглия клетки травмы10,11,12,,1314.

Эта статья сфокусирована на технику для модели индукции. Характеристика сетчатки травмы, вызванные этой модели у крыс и мышей можно найти в других местах более подробно15,16,,1718,19.

протокол

Все экспериментальные процедуры были проведены согласно Австралийский кодекс практики для ухода и использование животных для научных целей, установленных национального здравоохранения и медицинских исследований Совета в Австралии. Утверждения этики был получен из Комитета по этике Институт животного Говард Флори (утверждение № 13-044-UM и 13-068-UM для крыс и мышей, соответственно).

1. внутриглазного давления измерения сознательного крыс

  1. Установите тонометр отскок лабораторных крыс. Пеленать проснулся крыса в мягкой тканью, чтобы успокоить животное. Разоблачить головы и шеи. Аккуратно прижмите туловища в одной руке, с животного спиной опираясь против следователя грудь.
    Примечание: Актуальные анестезии не требуется.
  2. Используете другой довести отскок тонометр возле глаз крыса, так, что кончик зонда IOP находится примерно в 2-3 мм от и перпендикулярно к роговицы вершина. Используйте правую руку для измерения ВГД в правый глаз животного и левой рукой для левого глаза.
  3. Подождите несколько секунд для крыс, чтобы успокоить и нажмите один раз кнопку измерения. Наблюдать, что кончик зонда IOP мягко ударил роговицы вершина раз; и один раз слышать звуковой сигнал тонометр отскок.
    Примечание: Один сигнал тонометр подтверждает успешное измерение, которое может быть считано из ЖК-экрана. Двойной звуковой сигнал указывает на ошибку измерения. Ошибки измерения могут возникнуть от таких факторов, как неуместно Рабочее расстояние между зондом и роговицы, чрезмерное вращение ориентации тонометр, или зонд веко или не центральной части роговицы. Обратитесь к руководству тонометр отскок от производителя для более подробно о погрешности измерения.
  4. Повторите шаг 1.3 десять раз с интервалом 1-2 секунды, от этих измерений получают среднее значение IOP для этого момент. Сбросьте тонометр после прочтения 5тыс .
  5. Для последовательного мониторинга, измерения ВГД в то же время суток и в условиях последовательного освещения для сведения к минимуму изменения вследствие суточного цикла IOP20,21.

2. внутриглазного давления измерения в сознательных мышей

  1. Установите мышь отскок тонометр согласно инструкции производителя.
  2. Воздержаться от руки мышь, поместите курсор мыши на верхней части клетки гриль и осторожно потяните назад хвост.
    Примечание: Это заставит животного сцепление на металлический гриль с его передние ноги и попытка вывести себя вперед, который будет слегка растянуть свое тело.
    1. Используйте другой стороны понять дряблая кожа сразу за ушами. Зафиксируйте нижней части тела животного, держа хвост между безымянный палец и средний палец (или между мизинцем и ладони).
      Примечание: Не пытаться понять кожа слишком туго, чтобы избежать удушья и применение давления на глазах.
  3. Теперь свободной рукой (первоначально держа хвост) принести отскок тонометр возле глаз мыши, так, что кончик зонда IOP находится примерно в 2-3 мм от и перпендикулярно к роговицы вершина. Чтобы измерить с другой глаз, вращайте мышь так, что другой глаз теперь перед тонометр.
  4. Подождите, мыши, чтобы успокоить и нажмите один раз кнопку измерения. Наблюдать, что кончик зонда IOP мягко ударил роговицы вершина; одиночный звуковой сигнал, подтверждающий успешное измерения.
    Примечание: Двойной звуковой сигнал указывает на ошибку измерения. Это может помочь иметь второй экспериментатор чтения и документа IOP чтений, хотя первый экспериментатор занимает измерения.
  5. Повторите шаг 2.4 для получения десять успешных чтений для получения ВГД. Сбросьте тонометр после прочтения 5тыс . Разрешить интервал 1-2 секунды между чтений.
  6. Согласно последовательных измерения в крыс Измерьте мыши ВГД в то же время суток и в условиях последовательного освещения.

3. индукция повышение внутриглазного давления в наркотизированных крыс и мышей

  1. Очистите хирургические скамейке с 0,5% хлоргексидин в 70% этиловом спирте. Обложка скамейке с стерильных шторы. Автоклав все оборудование хирургическое заранее. Убедитесь, что все экспериментаторы носить соответствующие средства индивидуальной защиты (хирургические маски, халаты и стерилизованное перчатки).
  2. Чтобы побудить наркоз, место животного в камеру всасывание. Доставить 3-3,5% изофлюрановая с O2 со скоростью потока, 3 Л/мин.
    1. Поддержание анестезии с 1,5% изофлюрановая на 2 Л/мин доставлены через грызунов маска всей операции. Обеспечение достаточной глубины анестезии отсутствие рефлекс щепотку лапы.
    2. Избегайте угнетение дыхания, регулируя скорость потока, когда это необходимо для поддержания частоты дыхания на приблизительно 60 вдохов/мин.
  3. Случайно выберите один глаз, чтобы побудить глазной гипертензии, с контралатеральной глаз в качестве необработанных элемента управления. Привить одной капли 0,5% proxymetacaine глазной раствор для местной анестезией. Для очистки поверхности глаза, промойте глаз с 3 мл стерильным физиологическим.
  4. Обложка животное с стерильной, перфорированную хирургические пелерина, подвергая глаза, чтобы быть зашивается.
  5. Выполните шов кошелек строка бульбарной конъюнктивы во всем мире. У крыс ткать 7/0 швом нейлона параллельных и 2 мм кзади лимба (рис. 1). В мышей сместите швом нейлона 10/0 1 мм до лимба.
    1. Будьте осторожны, не проникают склеры. Внезапной зрачкового дилатация во время хирургической процедуры указывает, что склеры вероятно было проникнуть.
    2. Якорь шов на конъюнктиве, используя 5-6 опорных точек в крыс и 4-5 узловых точек на мышах.
    3. Избегайте прямого прессования на основных эписклеральные вен, резьбы шовный материал под конъюнктиву на пересечении этих вен.
      Примечание: Хотя мы рекомендуем избегать сжатия основных эписклеральные вен у крыс, это не делается регулярно мышей из-за низкой видимости этих вен в глазах мыши. Даже несмотря на то, что крупные вены прямо не сжимаются, вполне вероятно, что более мелкие суда в сплетение вен эписклеральные находятся под давлением, которое может быть фактором устойчивого повышения ВГД (см. обсуждение механизма повышения ВГД).
  6. Закрепите шовный материал кошелька строка, связывая slipknot, затем следуют второй простой узел (рис. 1). Чтобы избежать чрезмерно высокая послеоперационная IOP Спайк, имеют помощник измерения ВГД непосредственно перед второй узел крепления.
    1. Если ИП считается слишком высоким, настройте узел скольжения, частично освободив напряжения на одном конце шва (стрелка на рисунке 1A).
    2. После достижения желаемого IOP (в идеале 30-60 mmHg в 30-40 мм рт.ст, мышей или крыс), галстук от второй узел при сохранении постоянной силой тяги на том конце шва (стрелка в Рисунок 1).
    3. После второй узел был ужесточен, обрезать концы швов, чтобы свести к минимуму любое ощущение инородного тела. Контроль животного во время восстановления из общей анестезии.
      Примечание: Важно использовать slipknot когда связывая первый узел для обеспечения адекватного притока сжатие на глаз. После нескольких недель обычно отмечается, что концы стал встроенный в конъюнктиве.

4. Мониторинг ВГД

  1. Возьмите первый измерения ВГД на 2 минуты постоперационно под изофлюрановая наркозом. Впоследствии контролировать ВГД, когда грызунов сознание согласно вышеупомянутые шаги 1 и 2.
    Примечание: Контроль ВГД дважды во время в первый день (2 минут и 1 час), ежедневно в течение первой недели и один или два раза в неделю после.

5. опробование сетчатки структуры и функции

  1. В желаемой экспериментальной конечной точке (в этом случае после 8 недель крыс и мышей 12 недель), под общим наркозом, использовании внутрибрюшинной инъекции с кетамином/Ксилазина Измерьте сетчатки функция с dark-adapted сравнительно (ЭРГ), как описано более подробно в другом месте15,16,17.
    Примечание: Мы нашли надежного дисфункции клеток ганглия, сетчатки нервные волокна слой прореживания и ганглий мобильный потери для длительности между 8-12 недель. Другие успешно работают дольше IOP высота14,15.
  2. Сразу же после измерения Эрг Измерьте толщину слоя нервных волокон сетчатки (RNFL) и толщина сетчатки с помощью спектральной области оптической согласованности томография (SD-Окт) 16,18.
  3. В конце продольного исследования усыпить животных под глубокой анестезии.
    1. Вскрыть сетчатки для гистологии18, например иммуноокрашивания целом гора сетчатки с помощью специфического антитела клетки (РЦ) сетчатки ганглия как RNA-связывая протеин с несколькими сплайсинга антител (RBPMS) или мозг гомеобокс/ПОУ домена белка 3а (Brn3a)16,19,22.

Результаты

Следующие результаты в18 мышей и крыс16 ранее поступили и приводится здесь. Шовный материал circumlimbal производится аналогичная схема повышения ВГД у крыс и мышей (рис. 2). Краткий Спайк ВГД, до 58.1 ± 2,7 мм рт.ст, крыс и 38,7 ± 2,2 мм рт.ст, мы?...

Обсуждение

Шовный материал circumlimbal представляет новую модель хронического глазной гипертензии. Помимо исследований, из которых представитель результаты являются источником16,18эта модель животного использовался в ряде недавних исследований15,

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа финансируется национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии Грант проекта (1046203), Австралийский исследовательский совет будущее стипендий (FT130100338).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
normal salineBaxter International IncAHB1323Maintain corneal hydration during surgery
Chlorhexadine 0.5%Orion Laboratories27411, 80085Disinfection of surgical instrument
Isoflurane 99.9%Abbott Australasia Pty LtdCAS 26675-46-7Proprietory Name: Isoflo(TM) Inhalation anaaesthetic. Pharmaceutical-grade inhalation anesthetic mixed with oxygen gas for suture procedure
ocular lubricantAlcon Laboratories 1618611Proprietory Name: Genteal, ocular lubricant to keep the other eye moist
Needle holder (microsurgery)World Precision Instruments555419NTTo hold needle during ocular surgery
Proxymetacaine 0.5%Alcon Laboratories CAS 5875-06-9Topical ocular analgesia
Scissors (microsurgery)World Precision Instruments501232To cut excessive suture stump during ligation
Surgical drapeVital Medical SuppliesGM29-612EEEnsure sterile enviornment during surgery
Suture needle for rats (microsurgery)Ninbo medical needles1511098-0 nylon suture attached with round needle, cutting edge 3/8, dual-needle, suture length 30cm
Suture needle for mice (microsurgery)Ninbo medical needles16090510-0 nylon suture attached with round needle, cutting edge 3/8, dual-needle, suture length 30cm
Tweezers (microsurgery)World Precision Instruments500342Manipulate tissues during ocular surgery
rebound tonometerTONOLAB, iCare, Helsinki, FinlandTV02for intraocular pressure monitoring

Ссылки

  1. Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Experimental Eye Research. 64 (1), 85-96 (1997).
  2. Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. A laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension to characterize visual defects. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
  3. Chiu, K., Chang, R., So, K. F. Laser-induced chronic ocular hypertension model on SD rats. Journal of Visualized Experiments. (10), 549 (2007).
  4. Quigley, H. A., Addicks, E. M. Chronic experimental glaucoma in primates. I. Production of elevated intraocular pressure by anterior chamber injection of autologous ghost red blood cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 19 (2), 126-136 (1980).
  5. Bunker, S., et al. Experimental glaucoma induced by ocular injection of magnetic microspheres. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  6. Weber, A. J., Zelenak, D. Experimental glaucoma in the primate induced by latex microspheres. Journal of Neuroscience Methods. 111 (1), 39-48 (2001).
  7. Moreno, M. C., et al. A new experimental model of glaucoma in rats through intracameral injections of hyaluronic acid. Experimental Eye Research. 81 (1), 71-80 (2005).
  8. Hoyng, P. F., Verbey, N., Thorig, L., van Haeringen, N. J. Topical prostaglandins inhibit trauma-induced inflammation in the rabbit eye. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 27 (8), 1217-1225 (1986).
  9. Kezic, J. M., Chrysostomou, V., Trounce, I. A., McMenamin, P. G., Crowston, J. G. Effect of anterior chamber cannulation and acute IOP elevation on retinal macrophages in the adult mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (4), 3028-3036 (2013).
  10. Waisbourd, M., et al. Reversible structural and functional changes after intraocular pressure reduction in patients with glaucoma. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (6), 1159-1166 (2016).
  11. Foulsham, W. S., Fu, L., Tatham, A. J. Visual improvement following glaucoma surgery: a case report. BMC Ophthalmology. 14, 162 (2014).
  12. Anderson, A. J., Stainer, M. J. A control experiment for studies that show improved visual sensitivity with intraocular pressure lowering in glaucoma. Ophthalmology. 121 (10), 2028-2032 (2014).
  13. Ventura, L. M., Feuer, W. J., Porciatti, V. Progressive loss of retinal ganglion cell function is hindered with IOP-lowering treatment in early glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (2), 659-663 (2012).
  14. Zhao, D., et al. ARVO abstract number 3696 - B0043. annual meeting of Association for Research in Vision and Ophthalmology, Honolulu, Hawaii, USA. , (2018).
  15. Liu, H. H., et al. Chronic ocular hypertension induced by circumlimbal suture in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (5), 2811-2820 (2015).
  16. Zhao, D., et al. Characterization of the Circumlimbal Suture Model of Chronic IOP Elevation in Mice and Assessment of Changes in Gene Expression of Stretch Sensitive Channels. Frontiers in Neuroscience. 11, 41 (2017).
  17. Nguyen, C. T., et al. Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats. Journal of Visualized Experiments. (113), (2016).
  18. Van Koeverden, A. K., He, Z., Nguyen, C. T., Vingrys, A. J., Bui, B. V. Systemic hypertension is not protective against chronic IOP elevation in a rodent model. Scientific Reports. 8 (1), 7107 (2018).
  19. Rodriguez, A. R., de Sevilla Muller, L. P., Brecha, N. C. The RNA binding protein RBPMS is a selective marker of ganglion cells in the mammalian retina. Journal of Comparative Neurology. 522 (6), 1411-1443 (2014).
  20. Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Twenty-four-hour pattern of mouse intraocular pressure. Exp Eye Research. 77 (6), 681-686 (2003).
  21. Jia, L., Cepurna, W. O., Johnson, E. C., Morrison, J. C. Patterns of intraocular pressure elevation after aqueous humor outflow obstruction in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (6), 1380-1385 (2000).
  22. Nadal-Nicolas, F. M., Jimenez-Lopez, M., Sobrado-Calvo, P., Nieto-Lopez, L., Canovas-Martinez, I., Salinas-Navarro, M., Vidal-Sanz, M., Agudo, M. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3860-3868 (2009).
  23. Liu, H. H., Flanagan, J. G. A Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension Induced by Circumlimbal Suture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (1), 353-361 (2017).
  24. Liu, H. H., He, Z., Nguyen, C. T., Vingrys, A. J., Bui, B. V. Reversal of functional loss in a rat model of chronic intraocular pressure elevation. Ophthalmic & Physiological Optics. 37 (1), 71-81 (2017).
  25. Liu, H. H., Zhang, L., Shi, M., Chen, L., Flanagan, J. G. Comparison of laser and circumlimbal suture induced elevation of intraocular pressure in albino CD-1 mice. PLoS One. 12 (11), 0189094 (2017).
  26. Shen, H. H., et al. Intraocular Pressure Induced Retinal Changes Identified Using Synchrotron Infrared Microscopy. PLoS One. 11 (10), 0164035 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

140circumlimbal

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены