Méthode de préparation d'échantillons de microscope électronique de balayage et de transmission pour les appendices du bec de bois

Résumé

Afin d'observer l'ultrastructure de la sensibilité d'insecte, le protocole de préparation d'échantillon de balayage et de transmission d'électron (SEM et TEM, respectivement) ont été présentés dans l'étude. Tween 20 a été ajouté dans le fixatif pour éviter la déformation de l'échantillon dans LA microscopie de fluorescence DE SEM a été utile pour améliorer la précision de tranchage dans TEM.

Résumé

Ce rapport décrit les méthodes de préparation d'échantillon qui scannent et canalysent des observations de microscope électronique, démontrées en préparant des appendices du coléopter de bois, Chlorophorus caragana Xie et Wang (2012), pour les deux types de microscopie électronique. Le protocole de préparation de l'échantillon de microscopie électronique à balayage (SEM) était basé sur la fixation chimique de l'échantillon, la déshydratation dans une série de bains d'éthanol, le séchage et le revêtement par pulvérisation. En ajoutant Tween 20 (Polyoxyethylene sorbitan laurate) au fixatif et à la solution de lavage, la surface du corps d'insecte du scétis boisé a été lavée plus proprement dans SEM. La microscopie électronique de transmission de cette étude (TEM) comprenait une série d'étapes, y compris la fixation, la déshydratation de l'éthanol, l'intégration dans la résine, le positionnement à l'aide de la microscopie à fluorescence, la sectionnement et la coloration. Fixative avec Tween 20 permis pénétrer la paroi du corps d'insecte de colégon boisé plus facilement qu'il ne l'aurait été sans Tween 20, et par la suite de meilleurs tissus fixes et organes dans le corps, ainsi donné des observations électroniques de microscope de transmission claire des ultrastructures de sensilla d'insecte. L'étape suivante de cette préparation a été de déterminer les positions des insectes sensilla dans l'échantillon incorporé dans le bloc de résine en utilisant la microscopie de fluorescence pour augmenter la précision du positionnement sensilla cible. Cette précision de découpe améliorée.

Introduction

La microscopie électronique de balayage est un outil important dans beaucoup d'études de morphologie, que SEM montre des structures de surface^1,2. L'attrait de la microscopie électronique de transmission est qu'elle peut être utilisée pour étudier un large éventail de structures biologiques à l'échelle nanométrique, de l'architecture des cellules et de l'ultrastructure des organites à la structure des complexes macromoléculaires et des protéines. TEM montre les structures intérieures^3,4,5.

Le coleoptera est le plus grand groupe d'insectes, comprenant environ 182 familles et 350 000 espèces. La plupart des insectes coleopterans, en particulier le coléoptère du bois, se nourrissent de plantes, dont beaucoup sont d'importants ravageurs des forêts et des arbres fruitiers, causant des dommages dévastateurs aux arbres⁶. À l'heure actuelle, la population de prévention et de lutte des ravageurs basée sur la théorie de l'écologie chimique a reçu une attention croissante⁷. Des méthodes efficaces, peu toxiques et exemptes de pollution pour la phéromone sont devenues un moyen efficace⁸. L'étude de la morphologie sensilla et de l'ultrastructure des insectes est une partie importante de la recherche sur l'écologie chimique des insectes. La microscopie électronique de balayage et de transmission (SEM et TEM, respectivement) sont employées à grand effet pour étudier leur morphologie et anatomie interne. Cependant, pendant la préparation d'échantillons d'insectes pour la microscopie électronique (EM), l'objectivité et l'authenticité du site d'observation peuvent être affectées⁹. En général, la préparation de l'échantillon SEM des insectes nécessite le nettoyage, la fixation des tissus, la déshydratation, la métathèse, le séchage et le revêtement¹⁰. En raison de l'environnement complexe dans lequel vivent les bûcherons, la surface du corps a souvent divers polluants et leurs appendices ont souvent beaucoup de sensibilités fines ou de poils. En particulier, certains bûcherons ne sont pas disponibles dans l'élevage en laboratoire, qui a recueilli directement dans le champ, puis mis dans le liquide de fixation pour assurer la fraîcheur et ensuite lavé dans le laboratoire. Si l'échantillon est d'abord fixé puis lavé, il est évidemment beaucoup plus difficile d'enlever les débris parce que le glutaraldéhyde le fixe fortement à l'échantillon. Tween 20 est un surfactant^11,12,13,14, qui joue un rôle important dans le processus de lavage, y compris la réduction de la tension de surface de l'eau et l'amélioration de la mouillabilité de l'eau à la surface de la lessive. Dans cette étude, Tween 20 a été ajouté à la solution de fixation et pbS solution de nettoyage pour réduire la tension de surface du liquide, et d'empêcher la saleté de déposer sur la surface du corps du scétole boisant, ce qui a rendu la surface du corps plus propre dans SEM.

À l'aide de TEM, la sensilla sur différents organes d'insectes peut être tranchée pour révéler les structures claires à l'intérieur d'eux, fournissant ainsi une base pour analyser les fonctions sensilla. Lorsque l'insecte sujet, comme le scétis boisé, est grand, et sa paroi corporelle a un degré substantiel de sclérotisation, de sorte que le fixatif peut ne pas saturer entièrement les tissus des organes à l'intérieur du corps des insectes. Tween 20 peut améliorer la dispersion et la capacité de suspension de la saleté. Dans cette étude, Tween 20 a été ajouté au fixatif pour améliorer la pénétration du liquide fixatif dans la paroi du corps des insectes du scendis boisé, évitant la déformation et l'effondrement de l'épidermi^11,12,13. En outre, en utilisant la technologie de tranchage général, il est difficile de localiser avec précision différents types de sensilla, en particulier pour certains petits sensilla¹⁵. Basée sur la préparation traditionnelle de l'échantillon TEM, cette étude a combiné la microscopie à fluorescence et le SEM pour déterminer la position de l'insecte sensilla dans le bloc intégré, améliorant ainsi la précision des tranches.

Protocole

CAUTION : Consultez les fiches de données sur la sécurité des matériaux des réactifs avant de les utiliser. Plusieurs des produits chimiques utilisés lors de la préparation de l'échantillon sont toxiques, mutagènes, cancérigènes et/ou reprotoxiques. Utilisez de l'équipement de protection individuelle (gants, blouse de laboratoire, pantalon sépuldage et chaussures à boutfermé) et travaillez sous une hotte de fumée tout en manipulant l'échantillon.

1. Préparation et imagerie de l'échantillon SEM

1. Fixation et nettoyage d'échantillon
   1. Travailler dans une zone où C. caragana se produisent, attirer les adultes dans les pièges de champ appâtés avec des attractants de plantes, tels que l'isophorone¹⁶. Préserver les corps propres de C. caragana adulte en 0,1 mol L^-1 saline tamponnée par phosphate (PBS, pH 7,2), 2,5 % (wt/vol) glutaraldéhyde (Anhydrous EM Grad) et 0,06 % (vol/vol) Tween 20. Fixer l'échantillon à 4 oC au cours du week-end.
   2. Retirer les corps du liquide de conservation et rincer dans un tampon de phosphate. À l'aide d'un stéréomicroscope, retirez les appendices et nettoyez-les par ultrason (40 kHz) dans un salin à phosphate de 0,1 mol^-1 (pH 7,2) avec 0,06 % (vol/vol) Tween 20 (PBST). Après le nettoyage pendant 100 s, transférer l'échantillon au microscope pour vérifier s'il était propre. Dans des circonstances normales, nettoyer pendant 400 s pour s'assurer que l'échantillon était assez propre pour observer et non endommagé.
2. Exemple de déshydratation, de montage et de séchage
   1. Déshydratez les échantillons en utilisant des traitements successifs de 20 min dans 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 % et 100 % (tous vol/vol). Sous un stéréomicroscope, utiliser du ruban adhésif à double face de carbone pour fixer séparément 3 surfaces d'observation (ventrales et latérales dorsales) sur les talons. Notez que toutes les surfaces d'observation doivent être propres et exemptes de contamination. Placer l'étape de l'échantillon dans un plat de pétri contenant un dessiccant gel de silice pendant 48 h.
3. Sputter-coat et Sample Insertion
   1. À l'aide de l'instrument de pulvérisation d'ion Hitachi Koki (E-1010), tournez MAIN VALVE pour ouvrir la position, retirez le couvercle de la chambre d'échantillon et mettez l'échantillon dans la chambre. Mettez l'interrupteur POWER allumé, et la lumière READY était allumée. Définir le temps de pulvérisation en 45 secondes, et l'épaisseur du revêtement à 70,875 euros. Une fois que l'index mécanique de cadran de pompe est tombé au-dessous de 7, appuyez sur DISCHARGE et commencez à pulvériser du platine. À la fin de l'expérience, éteignez l'alimentation et prenez l'échantillon hors de la chambre. Épaisseur du film de pulvérisation: d KIVt ("d" est l'épaisseur du film dans l'unité de " ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' K" est une constante, selon le métal et le gaz pulés. Par exemple, K de l'air est de 0,07; "I" est l'unité mA de flux plasmatique; "V" est la tension appliquée dans l'unité de "KV". "t" est le temps en quelques secondes.
   2. Insérer le talon contenant l'échantillon sur le stade de SEM. Assurez-vous que l'étape de l'échantillon avec le talon de l'échantillon avait une hauteur suffisante pour permettre une bonne image. Ouvrez le logiciel SEM et sélectionnez une tension de fonctionnement souhaitée, à partir de 20 kV.

2. Préparation et imagerie d'échantillons TEM

1. Obtenir et fixer l'échantillon comme dans les étapes 1.1.1 et 1.1.2.
2. Nettoyage, fixation secondaire et déshydratation
   1. Retirer le C. caragana adulte du liquide de conservation. À l'aide d'un stéréomicroscope, retirer les appendices, laver les échantillons en PBST pendant 3 h, puis les corriger en tétroxide d'osmium de 1 % (wt/vol) dans le PBS pendant 1h à 25 oC. Déshydratez les échantillons en utilisant des traitements successifs de 20 min dans 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 % et 100 % (tout vol/vol) de l'éthanol à température ambiante.
3. Intégration et polymérisation de résine
   1. Intégrer les échantillons dans de la résine dans un moule plat en incorporation. L'échantillon se trouvait au bas de la plaque et a été placé le plus près possible du bord de la rainure encastrée. Placer l'étiquette dans le blanc puis couver la plaque contenant l'échantillon à 60 oC pendant 72 h. Retirez la capsule de l'incubateur et vérifiez que la résine s'était polymérisée.
4. Section de l'échantillon et coloration
   1. Une fois que l'échantillon s'est solidifié, placez chaque bloc de résine sous un microscope à fluorescence et photographiez-les sous la lumière bleue. Déplacez la source de lumière fluorescente du microscope pour qu'il irradie l'échantillon d'en haut. Activer la sensibilité dans le bloc de résine pour être clairement observée. Photographié et mesurer les distances pour cibler la sensilla (Figure 1).
   2. Se référer à l'image SEM des palpes (Figure 2A), et couper grossièrement le bloc de résine avec une lame de rasoir pour fermer le récepteur cible (Figure 2B).
   3. Ensuite, à l'aide de la microscopie à fluorescence à la lumière bleue, photographiez le bloc de résine grossièrement coupé, en ajustant la source de lumière d'en haut afin que la sensibilité soit observée clairement. La lumière verte excitée par la lumière bleue a créé une observation favorable. Lors de l'imagerie, le micromètre objectif (DIV 0.01mm) a été ajouté au stade du microscope à fluorescence, puis la distance de la cible a été mesurée par le logiciel ImageJ (U.S. National Institute of Health) (Figure 2C). La règle d'image a été faite par Adobe Photoshop CS5 (Adobe Systems, Inc., San Jose, CA, USA). Ensuite, pour le découpage de l'ultramicrotome, définir la distance de coupe, en utilisant des épaisseurs de tranches de 50-60 nm, jusqu'à ce que la position cible a été atteinte. Utilisez la microscopie à fluorescence pour identifier le récepteur cible.
   4. Montez les sections sur des grilles de cuivre enduites de Formvar, enduites de 100 mailles, doublement tachées d'acétate uranyl et de citrate de plomb.
      1. Tout d'abord, ajouter 3,75 g d'acétate uranyl à 50 ml de 50 % de méthanol. Grilles de taches avec une seringue filtrée (0,45 m) d'une solution saturée d'acétate uranyl à température ambiante pendant 10 min. Couvrir les sections pendant la coloration pour bloquer les précipités induits par la lumière. Rincer 2x à 50 % de méthanol; 2x eau dégazée filtrée.
      2. Deuxièmement, ajouter 0,02 g de citrate de plomb à 10 ml d'eau distillée dégazée dans le tube de centrifugeuse. Ajouter 0,1 ml d'hydroxyde de sodium de 10 N, sceller et secouer pour dissoudre. Grilles de tache avec une solution de citrate de plomb pendant 8 min. Centrifugeuse avant utilisation. La coloration doit être faite dans un environnement exempt de dioxyde de carbone pour empêcher la formation de précipitations de carbonate de plomb. Déposer des gouttes de tache sur des carrés de boîtes en plastique. Rincer à l'eau filtrée dégazée et sécher¹⁷. Observez-les via TEM fonctionnant à 80 kV.

Figure 1 : Un microscope fluorescent a photographié un bloc de résine enveloppant l'appendice du Chlorophorus caragana. (A) Bloc de résine d'Antenna; (B) Bloc de résine à la fin de l'ovipositeur. La flèche indiquait le bord du bloc de résine; le cercle pointillé indique la sensilla cible. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Procédures de la méthode précise de localisation sensilla. (A) Le 4ème sous-segment d'un palp maxillaire de Chlorophorus caragana, le cercle pointillé a montré la sensilla ciblée par SEM. (B) Le 4ème sous-segment d'un palp maxillaire de C. caragana vu par la microscopie de fluorescence. La flèche blanche a montré le bord grossièrement coupé du bloc de résine et le cercle pointillé a montré l'emplacement précis. (C) La distance marquée entre le bord du bloc de résine et l'emplacement de la cible maxillaire (28 m dans cet échantillon). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Résultats

En utilisant le nettoyage et la solution fixative avec Tween 20, une image SEM plus propre a été observée que celle sans Tween 20 (Figure 3). La solution de fixation de tween 20 a pénétré la solution de fixation de glutaraldéhyde dans le tissu. La structure de microtubule a été clairement vue. L'image TEM de la structure interne de l'échantillon a été floue sans Tween 20 (Figure 4).

Discussion

Dans cet article, nous avons présenté un schéma de préparation d'échantillon pour la microscopie électronique de balayage et de transmission pour le colégon laborieux. En utilisant l'appendice d'insecte comme sujet représentatif d'étude, nous avons démontré plusieurs améliorations au-dessus des méthodes traditionnelles de préparation d'échantillon.

L'huile liquide détachée de la surface solide est émulsionnée en petites gouttelettes, qui peuvent être bien dispersées et sus...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anatomical lens	Chongqing Auto Optical limited liability company	1425277
Carbon adhesive tape	SPI Supplies, Division of Structure Probes, Inc.	7311
Carbon tetrachloride	Sigma	56-23-5
Copper grids	GilderGrids	G300
Disodium hydrogen phosphate	Sinopharm group chemical reagent co., LTD	10039-32-4
Ethanol	J.T. Baker	64-17-5
Flat embedding molds	Hyde Venture (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.	70900
Fluorescence microscope	LEICA	DM2500
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	111-30-8	Anhydrous EM Grade
Isophorone	Sigma	78-59-1
Lead citrate	Sigma	512-26-5
Methanol	Sigma	67-56-1
Monobasic sodium phosphate	Its group chemical reagent co., LTD	7558-80-7
Objective micrometer	Olympus	0-001-034
Osmium tetroxide	Sigma	541-09-3
Petri dish	Aldrich	1998
Razor blade	Gillette
Resin	Spurr	ERL4221
Scalpel	Lianhui	GB/T19001-2008
SEM	Hitachi	S-3400
Silica gel desiccant	Suzhou Longhui Desiccant Co., Ltd.	112926-00-8
Small brush	Martol	G1220
Sodium hydroxide	Sigma	1310-73-2
Sputter ion instrument	Hitachi Koki Co. Ltd., Tokyo, Japan	E-1010
Stereo microscope	Leica	EZ4 HD
TEM	Hitachi	H-7500
Tween 20	Tianjin Damao Chemical Reagent	9005-64-5
Ultramicrotome	Leica	UC6
Ultrasonic cleaner	GT Sonic	GT-X1
Uranyl acetate	Sigma	6159-44-0