Método de preparação de amostras de microscópio eletrônico de varredura e transmissão para os apêndices do Besouro Woodboring

Resumo

Para observar a ultraestrutura da sensilla de insetos, foi apresentado o protocolo de preparação de amostras de varredura e transmissão (SEM e TEM), respectivamente) no estudo. O Tween 20 foi adicionado ao fixativo para evitar a deformação amostral na microscopia de fluorescência SEM. Foi útil para melhorar a precisão do corte na TEM.

Resumo

Este relatório descreveu métodos de preparação de amostras que escaneiam e transmissam observações de microscópio eletrônico, demonstrados preparando apêndices do besouro lenhador, Chlorophorus caragana Xie & Wang (2012), para ambos os tipos de microscopia eletrônica. O protocolo de preparação de amostras de microscopia eletrônica de varredura (SEM) foi baseado na fixação química da amostra, desidratação em uma série de banhos de etanol, secagem e revestimento de sputter. Adicionando Tween 20 (Polioxyetileno sorbitan laurate) à solução fixa e de lavagem, a superfície do corpo de insetos de besouro lenhador foi lavada de forma mais limpa em SEM. A preparação de amostras de microscopia eletrônica de transmissão deste estudo (TEM) envolveu uma série de etapas, incluindo fixação, desidratação do etanol, incorporação de resina, posicionamento utilizando microscopia de fluorescência, secção e coloração. Fixante com Interpolado 20 habilitado penetrar a parede corporal do inseto de besouro lenhado mais facilmente do que teria sido sem Tween 20, e posteriormente melhores tecidos fixos e órgãos no corpo, resultando assim em observações claras de microscópio eletrônico de transmissão de ultraestruturas de insetos sensilla. O próximo passo desta preparação foi determinar as posições de sensilla de insetos na amostra embutida no bloco de resina usando microscopia de fluorescência para aumentar a precisão do posicionamento da sensilla alvo. Isso melhorou a precisão do corte.

Introdução

A microscopia eletrônica de digitalização é uma ferramenta importante em muitos estudos de morfologia, que o SEM mostra estruturas superficiais^1,2. O apelo da microscopia eletrônica de transmissão é que ele possa ser usado para estudar uma ampla gama de estruturas biológicas na escala de nanômetros, desde a arquitetura das células e a ultraestrutura das organelas, até a estrutura de complexos e proteínas macromoleculares. Tem mostra estruturas internas^3,4,5.

Coleoptera é o maior grupo de insetos, incluindo cerca de 182 famílias e 350.000 espécies. A maioria dos insetos coleopteranos, em particular besouro samadeirado, se alimentam de plantas, muitas das quais são pragas importantes de florestas e árvores frutíferas, causando danos devastadores às árvores⁶. Atualmente, a prevenção e controle da população de pragas baseadas na teoria da ecologia química têm recebido cada vez mais atenção⁷. Métodos eficientes, baixotóxicos e livres de feromôona tornaram-se uma maneira eficaz⁸. Estudar a morfologia sensilla e a ultraestrutura dos insetos é uma parte importante da pesquisa de ecologia química de insetos. A microscopia eletrônica de digitalização e transmissão (SEM e TEM, respectivamente) é usada para grande efeito para estudar sua morfologia e anatomia interna. No entanto, durante a preparação de amostras de insetos para microscopia eletrônica (EM), a objetividade e autenticidade do local de observação podem ser afetadas⁹. Em geral, a preparação de amostras sem de insetos requer limpeza, fixação tecidual, desidratação, metatese, secagem e revestimento de sputter¹⁰. Devido ao ambiente complexo em que vive o besouro lenhador, a superfície corporal muitas vezes tem vários poluentes e seus apêndices muitas vezes têm muitas sensilla ou cerdas longas finas. Em particular, alguns lenhadores não estão disponíveis a partir da captação laboratorial, que coletou diretamente no campo, e depois colocado em fluido de fixação para garantir o frescor e, posteriormente, lavado em laboratório. Se a amostra for primeiro fixae e depois lavada, obviamente é muito mais difícil remover detritos porque glutaraldehyde a fixa fortemente na amostra. O Tween 20 é um surfactante^11,12,13,14, que desempenha um papel importante no processo de lavagem, incluindo a redução da tensão superficial da água e a melhoria da umidade da água na superfície da lavanderia. Neste estudo, tween 20 foi adicionado à solução de fixação e solução de limpeza PBS para reduzir a tensão superficial do líquido, e impedir que a sujeira depositasse na superfície corporal do besouro lenhador, o que fez a superfície do corpo mais limpa no SEM.

Usando tem, sensilla em diferentes órgãos de insetos pode ser fatiado para revelar as estruturas claras dentro deles, fornecendo assim uma base para analisar funções sensilla. Quando o inseto sujeito, como o besouro lenhador, é grande, e sua parede corporal tem um grau substancial de esclerotização, de modo que o fixativo pode não saturar totalmente os tecidos dos órgãos dentro do corpo do inseto. O Tween 20 pode aumentar a capacidade de dispersão e suspensão da sujeira. Neste estudo, Tween 20 foi adicionado ao fixativo para aumentar a penetração fixa do fluido na parede corporal do inseto de besouro lenhador, evitando a deformação e o colapso da epidermi^11,12,13. Além disso, usando tecnologia geral de fatiamento, é difícil localizar com precisão diferentes tipos de sensilla, em particular para alguma pequena sensilla¹⁵. Com base na preparação tradicional da amostra TEM, este estudo combinou microscopia de fluorescência e SEM para determinar a posição de sensilla de insetos no bloco embarcado, melhorando assim a precisão do corte.

Protocolo

ATENÇÃO: Consulte as folhas de dados de segurança do material dos reagentes antes de usá-los. Vários dos produtos químicos usados durante a preparação da amostra são tóxicos, mutagênicos, cancerígenos e/ou reprotóxicos. Use equipamentos de proteção individual (luvas, jaleco, calças de comprimento completo e sapatos fechados) e trabalhe um capô de fume enquanto manuseia a amostra.

1. Preparação e imagem de amostras sem

1. Fixação e Limpeza de Amostras
   1. Trabalhando em uma área onde ocorre C. caragana, atraia adultos em armadilhas de campo iscas com atrativos vegetais, como isofhorona¹⁶. Preservar corpos limpos de C. caragana adulto em 0,1 mol L^-1 sorofia tampão de fosfato (PBS, pH 7.2), 2,5% (wt/vol) glutaraldeído (Anhydrous EM Grad) e 0,06% (vol/vol) Tween 20. Conserte a amostra a 4 °C no fim de semana.
   2. Remova os corpos do líquido de preservação e enxágue em tampão de fosfato. Usando um estereótipo, remova os apêndices e limpe-os ultrassonicamente (40 kHz) em um salino l -1 mol^{L -1} tampão de fosfato (pH 7.2) com 0,06% (vol/vol) Tween 20 (PBST). Depois de limpar por 100 s, transfira a amostra para o microscópio para verificar se estava limpa. Em circunstâncias normais, limpa por 400 anos para garantir que a amostra estava limpa o suficiente para observar e não danificar.
2. Desidratação amostral, montagem e secagem
   1. Desidratar as amostras utilizando 20 tratamentos sucessivos em 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% e 100% (todos vol/vol) etanol. um estereótipo, use fita adesiva de dois lados de carbono para corrigir separadamente 3 superfícies de observação (ventral dorsal e lateral) em stubs. Observe que todas as superfícies de visualização devem ser mantidas limpas e livres de contaminação. Coloque o estágio da amostra em uma placa de petri contendo um dessiccante gel de sílica por 48 h.
3. Sputter-coat e inserção de amostra
   1. Usando o instrumento de sputtering de íons Hitachi Koki (E-1010), gire a VÁLVULA PRINCIPAL para a posição ABERTA, remova a tampa da câmara de amostra e coloque a amostra na câmara. Coloque o interruptor de alimentação ligado, e a luz READY estava acesa. Definir o tempo de sputtering em 45 segundos, e espessura de revestimento como 70.875 Å. Uma vez que o índice de discagem a vácuo da bomba mecânica caiu abaixo de 7, pressione o DISCHARGE e comece a pulverizar a platina. No final do experimento, desligue a fonte de alimentação e tire a amostra da câmara. Espessura do filme spray: d = KIVt ("d" é a espessura do filme na unidade de " Å "; " K" é uma constante, dependendo do metal e gás sputtered. Por exemplo, K de ar é 0,07; "Eu" é o mA unitário do fluxo de plasma; "V" é a tensão aplicada na unidade do "KV". "t" é tempo em segundos.
   2. Insira o stub contendo a amostra no estágio do SEM. Certifique-se de que o estágio da amostra com o stub amostral tenha altura suficiente para permitir uma boa imagem. Abra o software SEM e selecione uma tensão operacional desejada, começando em 20 kV.

2. TEM Preparação e Imagem de Amostras

1. Obtenha e fixe a amostra como nas etapas 1.1.1 e 1.1.2.
2. Limpeza, Fixação Secundária e Desidratação
   1. Remova o adulto C. caragana do líquido de preservação. Usando um estereótipo, remova os apêndices, lave as amostras no PBST por 3 h e, em seguida, pós-fixá-las em 1% (wt/vol) tetróxido de osmio em PBS por 1h a 25 °C. Desidratar as amostras utilizando 20 tratamentos sucessivos em 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% e 100% (todos vol/vol) etanol em temperatura ambiente.
3. Incorporação e Polimerização de resina
   1. Incorpore as amostras em resina em moldes de incorporação plana. A amostra estava na parte inferior da placa e foi colocada o mais perto possível da borda do sulco recesso. Coloque o rótulo em branco e incuba a placa contendo a amostra a 60 °C por 72 h. Remova a cápsula da incubadora e verifique se a resina havia polimerizado.
4. Secagem e Coloração de Amostras
   1. Uma vez que certifique-se de que a amostra foi solidificada, coloque cada bloco de resina um microscópio de fluorescência e fotografe-as luz azul. Mova a fonte de luz fluorescente do microscópio para que ele irradiasse a amostra de cima. Permitir que a sensilla no bloco de resina seja claramente observada. Fotografar e medir distâncias para atingir a sensilla (Figura 1).
   2. Consulte a imagem SEM das palps(Figura 2A),e corte aproximadamente o bloco de resina com uma lâmina de barbear para fechar o receptor alvo(Figura 2B).
   3. Em seguida, usando microscopia de fluorescência de luz azul, fotografe o bloco de resina aproximadamente cortado, ajustando a fonte de luz de cima para que a sensilla fosse observada claramente. A luz verde animada pela luz azul criou uma observação favorável. Ao ser imagem, o micrometro objetivo (DIV 0,01mm) foi adicionado ao estágio do microscópio de fluorescência, e então a distância do alvo foi medida pelo software ImageJ (Instituto Nacional de Saúde dos EUA) (Figura 2C). A régua de imagem foi feita pelo Adobe Photoshop CS5 (Adobe Systems, Inc., San Jose, CA, USA). Em seguida, para o corte ultramicrotome, defina a distância de corte, utilizando espessuras de fatia de 50-60 nm, até que a posição alvo fosse atingida. Use microscopia de fluorescência para identificar o receptor alvo.
   4. Monte as seções em grades de cobre de 100 malhas revestidas de Formvar, manchadas duas vezes com acetato de uranyl e citrato de chumbo.
      1. Em primeiro lugar, adicione 3,75 g de acetato uranyl a 50 mL de 50 % de metanol. Redes de manchas com uma seringa filtrada (0,45 μm) de uma solução saturada de acetato de uranyl em temperatura ambiente por 10 min. Seções de cobertura durante a coloração para bloquear precipitados induzidos pela luz. Enxágüe 2x em 50 % de metanol; 2x água desgaseada filtrada filtrada.
      2. Em segundo lugar, adicione citrate de chumbo de 0,02 g a 10 mL de água destilada desgaseada no tubo de centrífuga. Adicione 0,1 mL de hidróxido de sódio de 10 N, vedae e agite para dissolver. Redes de manchas com uma solução de citrato de chumbo por 8 min. Centrífuga antes do uso. A coloração deve ser feita em um ambiente livre de dióxido de carbono para evitar a formação de precipitados de carbonato de chumbo. Coloque gotas de mancha em praças de placas de petri de plástico. Enxágüe em água filtrada degasegasee e seca¹⁷. Observe-os via TEM operando a 80 kV.

Figura 1: Um microscópio fluorescente fotografou um bloco de resina envolvendo o apêndice da caragana clorofóbica. (A) Bloco de resina de antena; (B) Bloco de resina no final do ovipositor. A seta indicou a borda do bloco de resina; círculo pontilhado indica o alvo sensilla. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figura 2: Procedimentos do método preciso de localização sensilla. (A) O 4º subsegmento de uma palp maxilar de Clorofóbico caragana, o círculo pontilhado mostrou a sensilla alvo de SEM. (B) O 4º subsegmento de uma palp maxilar de C. caragana vista pela microscopia de fluorescência. A seta branca mostrou a borda aproximadamente cortada do bloco de resina e o círculo pontilhado mostrou a localização precisa. (C) A distância acentuada da borda do bloco de resina até o local alvo da palp maxilada (28 μm nesta amostra). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Resultados

Utilizando a solução de limpeza e fixação com tween 20, observou-se imagem SEM mais limpa do que a sem Tween 20 (Figura 3). A solução de fixação de interpolação 20 penetrou na solução de fixação de glutaraldeído no tecido. A estrutura de microtúbulos foi claramente vista. A imagem TEM da estrutura interna da amostra foi borrada sem Tween 20 (Figura 4).

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Discussão

Neste artigo, apresentamos um esquema de preparação de amostras para digitalização e microscopia eletrônica de transmissão para besouro lenhador. Usando o apêndice de insetos como um sujeito representativo do estudo, demonstramos várias melhorias em relação aos métodos tradicionais de preparação de amostras.

O óleo líquido desconectado da superfície sólida é emulsificado em pequenas gotículas, que podem ser bem dispersas e suspensas no meio de lavagem para reduzir o redepós...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anatomical lens	Chongqing Auto Optical limited liability company	1425277
Carbon adhesive tape	SPI Supplies, Division of Structure Probes, Inc.	7311
Carbon tetrachloride	Sigma	56-23-5
Copper grids	GilderGrids	G300
Disodium hydrogen phosphate	Sinopharm group chemical reagent co., LTD	10039-32-4
Ethanol	J.T. Baker	64-17-5
Flat embedding molds	Hyde Venture (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.	70900
Fluorescence microscope	LEICA	DM2500
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	111-30-8	Anhydrous EM Grade
Isophorone	Sigma	78-59-1
Lead citrate	Sigma	512-26-5
Methanol	Sigma	67-56-1
Monobasic sodium phosphate	Its group chemical reagent co., LTD	7558-80-7
Objective micrometer	Olympus	0-001-034
Osmium tetroxide	Sigma	541-09-3
Petri dish	Aldrich	1998
Razor blade	Gillette
Resin	Spurr	ERL4221
Scalpel	Lianhui	GB/T19001-2008
SEM	Hitachi	S-3400
Silica gel desiccant	Suzhou Longhui Desiccant Co., Ltd.	112926-00-8
Small brush	Martol	G1220
Sodium hydroxide	Sigma	1310-73-2
Sputter ion instrument	Hitachi Koki Co. Ltd., Tokyo, Japan	E-1010
Stereo microscope	Leica	EZ4 HD
TEM	Hitachi	H-7500
Tween 20	Tianjin Damao Chemical Reagent	9005-64-5
Ultramicrotome	Leica	UC6
Ultrasonic cleaner	GT Sonic	GT-X1
Uranyl acetate	Sigma	6159-44-0