Induction et caractérisation de l’hypertension pulmonaire chez les souris à l’aide du modèle Hypoxie/SU5416

Résumé

Ce protocole décrit l’induction de l’hypertension pulmonaire (PH) chez les souris basée sur l’exposition à l’hypoxie et l’injection d’un antagoniste des récepteurs VEGF. Les animaux développent l’hypertrophie ph et ventriculaire droite (RV) 3 semaines après le début du protocole. La caractérisation fonctionnelle et morphométrique du modèle est également présentée.

Résumé

L’hypertension pulmonaire (PH) est une condition pathophysiologique, définie par une pression artérielle pulmonaire moyenne dépassant 25 mm Hg au repos, telle qu’évaluée par cathétérisme cardiaque droit. Un large éventail de maladies peut mener à PH, différent dans leur étiologie, histopathologie, présentation clinique, pronostic, et réponse au traitement. Malgré des progrès significatifs au cours des dernières années, ph reste une maladie non réparée. Comprendre les mécanismes sous-jacents peut ouvrir la voie au développement de nouvelles thérapies. Les modèles animaux sont d’importants outils de recherche pour atteindre cet objectif. Actuellement, il existe plusieurs modèles disponibles pour la récapitulation ph. Ce protocole décrit un modèle PH de souris à deux succès. Les stimuli pour le développement de PH sont l’hypoxie et l’injection de SU5416, un antagoniste du facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF). Trois semaines après l’initiation de l’Hypoxie/SU5416, les animaux développent le remodelage vasculaire pulmonaire imitant les changements histopathologiques observés dans le PH humain (principalement groupe 1). Le remodelage vasculaire dans la circulation pulmonaire a comme résultat le remodelage du ventricule droit (RV). Les procédures de mesure des pressions de RV (utilisant la méthode de coffre ouvert), les analyses morphométriques du RV (par disséquer et pesant les deux ventricules cardiaques) et les évaluations histologiques du remodelage (à la fois pulmonaire en évaluant le remodelage vasculaire et cardiaque en évaluant l’hypertrophie cardiomyocyte de RV) sont décrites en détail. Les avantages de ce protocole sont la possibilité de l’application à la fois chez les souris sauvages et chez les souris génétiquement modifiées, la mise en œuvre relativement facile et peu coûteuse, et le développement rapide de la maladie d’intérêt (3 semaines). Les limites de cette méthode sont que les souris ne développent pas un phénotype grave et PH est réversible au retour à la normoxie. La prévention, ainsi que les études thérapeutiques, peuvent facilement être mises en œuvre dans ce modèle, sans la nécessité de compétences avancées (par opposition aux modèles chirurgicaux de rongeurs).

Introduction

L’hypertension pulmonaire (PH) est une affection pathophysiologique, définie par une pression artérielle pulmonaire moyenne (PA) supérieure à 25 mm Hg au repos, telle qu’évaluée par cathétérisme cardiaque droit^1,2. Il ya une variété de maladies qui peuvent conduire à PH. Dans le but d’organiser les conditions associées au PH, plusieurs systèmes de classification ont été mis au point. La classification clinique actuelle classe les multiples maladies associées au PH dans 5 groupes différents¹. Cette distinction est importante puisque divers groupes de patients ont des maladies qui diffèrent dans leur présentation clinique, la pathologie, le pronostic, et la réponse au traitement². Le tableau 1 résume la classification actuelle, complétée par les caractéristiques histopathologiques de base de chaque maladie.

Tableau 1 : Vue d’ensemble de la classification clinique de ph, ainsi que des principales caractéristiques histopathologiques au sein des groupes. Aptitude du protocole Hypoxia/SU5416 pour la modélisation de PH. Ce tableau a été modifié à partir de¹⁹. PH: Hypertension pulmonaire, HAP: Hypertension artérielle pulmonaire

Malgré des progrès significatifs dans le traitement des maladies associées au PH, PH reste toujours sans remède, avec un taux de mortalité à 3 ans allant de 20% à 80%³. Cela indique la nécessité impérative de comprendre les mécanismes sous-jacents de PH et, par la suite, le développement de nouvelles thérapies pour prévenir, ralentir la progression, et guérir la maladie. Les modèles animaux sont d’une importance cruciale pour cette portée. Actuellement, divers modèles existent pour étudier le PH. Le lecteur intéressé est référé aux excellents commentaires sur ce sujet^2,3,4. Compte tenu de la variété des maladies conduisant à la PH, il est évident que les diverses conditions de PH humaine ne peut pas être parfaitement récapitulée dans un modèle animal. Les modèles animaux disponibles peuvent être classés dans i) single-hit, ii) deux coups, iii) knock-out, et iv) modèles de surexpression³. Dans les modèles à impact unique, PH est induite par un stimulus pathologique unique, tandis que les modèles à deux coups combinent deux stimuli pathologiques dans le but d’induire un PH plus grave et donc plus étroitement imiter la maladie humaine complexe. Outre les différences étiologiques, les plusieurs stimuli entraînent des différences de modélisation ph qui dépendent aussi de l’espèce et de l’arrière-plan génétique des animaux⁴.

L’un des modèles classiques les plus couramment utilisés de rongeurs PH est le modèle chronique d’hypoxie^2. L’hypoxie est connue pour induire la PH chez l’homme ainsi que chez plusieurs espèces animales. L’hypoxie a l’avantage d’être un stimulus physiologique pour ph (Tableau 1). Cependant, alors que le degré d’hypoxie utilisé pour induire la PH chez les rongeurs est beaucoup plus grave que chez l’homme, l’insulte unique (hypoxie) conduit seulement à une forme légère de remodelage vasculaire. Cela n’imite pas la gravité de la maladie humaine. L’ajout d’un deuxième coup, un stimulus supplémentaire pour induire PH, a montré des résultats prometteurs: injection du composé SU5416 aux rongeurs combiné avec le stimulus hypoxique induit un phénotype PH plus grave^2,5,6. SU5416 est un inhibiteur du récepteur du facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) récepteur-2. Il bloque les récepteurs vegf et conduit à l’apoptose des cellules endothéliales. Dans des conditions hypoxiques, cela stimule la prolifération d’un sous-ensemble de cellules endothéliales résistantes à l’apoptose. En outre, SU5416 conduit à la prolifération des cellules musculaires lisses. La combinaison de ces effets entraîne un remodelage vasculaire pathologique de la circulation pulmonaire et conduit à une pression élevée pa et le remodelage ventriculaire droit^2,5,7. Le modèle a d’abord été décrit chez les rats⁶ et plus tard appliqué sur les souris^4,5,7. Le modèle de souris présente un remodelage vasculaire moins sévère que celui des rats. En outre, lorsqu’il est retourné à la normoxie, PH continue de progresser chez les rats, tandis que chez les souris, il est partiellement réversible.

Le protocole suivant décrit toutes les étapes de modélisation de PH chez les souris à l’aide de la méthode Hypoxia/SU5416 (planification, chronologie, exécution). En outre, la caractérisation du modèle est décrite dans ce protocole : fonctionnellement (en mesurant invasivement la pression ventriculaire droite (RV) utilisant la technique de coffre ouverte), morphométrique (par disséquer et pesant les ventricules droit et gauche), aussi bien que histologiquement (en évaluant le remodelage vasculaire pulmonaire, hypertrophie et fibrose ventriculaire droite).

Toutes les étapes et méthodes décrites dans ce protocole peuvent être facilement mises en œuvre par les enquêteurs à n’importe quel niveau d’expérience. Bien que les mesures fonctionnelles du RV en utilisant la technique de la poitrine ouverte (décrite ici) ne soit pas la méthode d’étalon-or sur le terrain, elle a l’avantage qu’elle peut être rapidement apprise et reproduite avec précision même par un expérimentateur moins expérimenté.

Protocole

Avant toute expérimentation animale obtenir l’autorisation du comité local de soins aux animaux en établissement. Les expériences actuelles ont été réalisées après approbation par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) à l’École de médecine Icahn du Mont Sinaï.

1. Induction de PH

1. Préparation
   1. Avant de commencer l’étude, planifiez soigneusement la conception expérimentale. Assurez-vous que les souris sont soumises à l’hypoxie en même temps que la première injection de SU5416. Un exemple de la conception expérimentale pour induire le PH à l’aide de la méthode Hypoxia/SU5416 est illustré à la figure 1A. Les souris témoins n’ont reçu que le véhicule. Pour ce modèle, SU5416 sera injecté aux souris une fois par semaine pendant 3 semaines consécutives.
   2. Utilisez des souris C57BL/6 de huit à douze semaines pour cette étude. Loger les animaux à 18-20 °C dans un cycle clair-foncé de 12 h. Assurez-vous que la nourriture et l’eau sont accessibles ad libitum.
   3. Peser les animaux. Attribuez-les au hasard à chaque groupe : Normoxia et Hypoxia/SU5416.
   4. Préparer la chambre hypoxique comme le montre la figure 1B. Fixer les réservoirs d’azote (N₂₎près de la chambre. Réglez le contrôleur de l’oxygène (O₂₎à un point de 10% O₂. Laissez le système atteindre un état stable.
   5. Préparer su5416 pour l’injection (utiliser une dose de 20 mg/kg de poids corporel). SU5416 ne se dissout pas dans des solutions aqueuses; par conséquent, dissoudre la quantité calculée en 100 μL DMSO⁸. Par exemple, pour une souris de 25 g, la quantité de SU5416 à injecter est de 0,5 mg dissous dans un solvant de 100 μL (DMSO). La concentration finale de SU5416 pour cette souris est donc de 5 mg/mL.
      ATTENTION: SU5416 est une matière dangereuse. Lisez attentivement la fiche de données de sécurité accompagnée du produit et assurez-vous de prendre les précautions recommandées lors de la manipulation de cette substance. Portez des gants de protection et (comme pour toute injection) utilisez une protection oculaire. La structure chimique de SU5416 est indiquée à la figure 1C.
      REMARQUE : Calculer un excédent approprié de la solution pour compenser le volume qui sera perdu pendant l’injection (p. ex. dans la seringue, flacon, etc.). Selon la seringue utilisée, le volume mort est d’environ 200 μL. Pour un groupe de 10 souris, calculer un excès de 2 doses de souris.
   6. Préparer les seringues pour l’injection. Utilisez 1 seringue mL avec des aiguilles de 25 G x 5/8 po.
2. Injection sous-cutanée SU5416
   1. Retenez l’animal. Placez la souris sur le couvercle de la cage pour aider à la retenue. Saisissez la peau et formez une tente parallèle à la colonne vertébrale. Assurez-vous de saisir à l’arrière de la tête étroitement, pour éviter la blessure de morsure potentielle par la souris.
      REMARQUE : La présence de deux chercheurs rend la procédure plus rapide et plus précise, car l’un peut retenir l’animal pendant que l’autre effectue l’injection.
   2. Insérez l’aiguille sous-cutanéement sur le flanc au pli lâche de la peau. Assurez-vous d’insérer l’aiguille parallèle à la peau. Évitez de pénétrer la paroi abdominale.
   3. Injectez la teneur de la seringue (100 μL de SU5416 dissous ou d’un véhicule).
      REMARQUE : Afin d’éviter les fuites après la livraison complète, tenez la seringue pendant environ 10 s et faites pivoter légèrement l’aiguille sous la peau.
   4. Retirez l’aiguille et remettez l’animal dans sa cage. Après l’injection de SU5416, placez les cages dans la chambre d’hypoxie ventilée.
3. Exposition à l’hypoxie
   1. Surveillez la ventilation au fil du temps. Assurez-vous de maintenir 10% de l’approvisionnement en oxygène. Maintenir les animaux normoxia dans une chambre semi-sealable à 21% O₂.
   2. Assurez-vous que les chambres sont équipées d’un capteur d’oxygène pour mesurer le niveau d’oxygène. Évitez l’ouverture extensive des chambres. Pour le nettoyage et l’ajout de nourriture et d’eau ouvrir les chambres pour pas plus de 20 min tous les 3 jours.
   3. Inspectez les animaux tous les jours. Considérez les signaux de stress tels que la piloérection ou la perte de poids significative.
      REMARQUE : On s’attend à ce que les animaux sous Hypoxie/SU5416 perdent du poids⁵. C’est une indication du développement de la maladie.
   4. Répétez l’injection de SU5416 chaque semaine pendant 3 semaines consécutives (voir la figure 1A pour la vue d’ensemble de la conception expérimentale).
      REMARQUE : La variation du site d’injection peut aider à réduire les irritations cutanées.

2. Caractérisation fonctionnelle par des mesures invasives de pression de VR

1. Préparation
   REMARQUE : Choisissez un régime anesthésique. Des anesthésiques injectables ou inhalables peuvent être utilisés. Étant donné qu’une légère surdose d’anesthésiques injectables (en particulier de kétamine/xylazine ou de pentobarbital) peut affecter de manière significative la fonction cardiaque, l’utilisation d’anesthésiques volatils est recommandée. Il est d’une grande importance d’utiliser le même anesthésique pour toutes les souris dans le cadre d’une étude.
   1. Utilisez un vaporisateur pour assurer une dose précise d’anesthésiques par animal. La dose d’isoflurane est la suivante: induction 3-4%, entretien 1% mélangé avec 100% d’oxygène.
      REMARQUE : Portez de l’équipement de protection individuelle et évitez de respirer la vapeur.
   2. Préparer un coussin chauffant et/ou des lampes chauffantes pour maintenir la température corporelle. Préparer une sonde de température rectale pour surveiller la température corporelle.
   3. Assurer une bonne ventilation. Préparer le ventilateur à l’avance. Préparer le connecteur y-tube et vérifier la fonction du ventilateur à l’aide du mode manuel. Assurez-vous que la pression inspiratoire est de 1 cm H₂O pour éviter le barotrauma. Réglez le taux respiratoire à 110 respirations/min.
   4. Préparer un tube endotrachéal en coupant un cathéter intravasculaire de 20 G.
   5. Préparer les instruments nécessaires : petits forceps, ciseaux, rétracteurs élastiques, cautérisateur de navire et coton-tige. Sur un coton-tige ajuster une petite aiguille de 25 G x 5/8 " qui sera utilisé pour faire une petite perforation dans le ventricule droit.
   6. Préparez le cathéter de pression, l’unité de contrôle du volume de pression et lancez le logiciel d’acquisition de données. Placez le cathéter PV dans un tube de 15 ml rempli de PBS à 37 °C pendant 15 min et calibrez selon le protocole du fabricant.
   7. Pour la perfusion et la fixation des organes, préparer pbs et une solution de 50% PBS / 50% OCT. Préparer 2 x 10 mL seringues (avec une aiguille de 25 G): l’un sera utilisé pour perfuser le cœur et le poumon avec PBS in situ et le second pour l’injection de l’OCT / PBS (50/50) solution à l’échantillon pulmonaire qui sera utilisé pour l’examen histologique.
2. Intubation
   1. Peser la souris et enregistrer l’état de santé avant l’anesthésie.
   2. Induire l’anesthésie avec 3-4% isoflurane. Vérifiez la profondeur d’anesthésie en testant le réflexe de pincement des orteils : pincez fermement l’orteil d’un des membres. Si l’animal retire le membre, c’est un signe d’anesthésie insuffisante.
   3. Après l’induction d’anesthésie, raser le cou et les zones de la poitrine.
   4. Placez la souris sur le coussin chauffant. Placez une sonde de température rectale pour surveiller la température corporelle.
      REMARQUE : Le maintien de la température corporelle est important pour les mesures fonctionnelles. La température corporelle doit être d’environ 36,5 à 37 °C.
   5. À l’aide de forceps incurvés attacher un fil de suture aux incisives supérieures de la souris, étirer et fixer au coussin chauffant avec du ruban chirurgical. Fixez les membres de la souris à l’aide de bandes chirurgicales.
   6. Pour l’intubétisation de l’animal faire une petite incision d’environ 1 cm dans la peau cervicale médiale à l’aide de petits ciseaux.
      REMARQUE : L’intubation orale est une méthode alternative qui nécessite plus d’expérience.
   7. Avec un applicateur à pointe de coton séparer brutalement les glandes salivaires parotides et submandibulaires au niveau intermédiaire. Cela exposera les muscles au-dessus de la trachée.
   8. Coupez soigneusement ces muscles exposant la trachée.
   9. Avec de petits ciseaux faire une petite incision entre les cartilages trachéaux et insérer le tube endotrachéal préparé. Sortez le guide métallique du cathéter intravasculaire.
   10. Connectez le cathéter au ventilateur. Vérifiez la position du tube trachéal en gonflant manuellement les poumons. Sécurisez la position avec du ruban adhésif.
   11. Maintenir une anesthésie isoflurane de 1% tout au long de la procédure.
   12. Surveillez régulièrement la profondeur de l’anesthésie en testant le réflexe de pincement des orteils. Ajuster l’anesthésie en conséquence.
       NOTE: La fréquence cardiaque recommandée pendant les expériences, sous 1% d’anesthésie isoflurane, est d’environ 400 battements /min. Le maintien de la température corporelle et l’anesthésie sont essentiels pour contrôler la fréquence cardiaque. L’excès d’isoflurane peut réduire la fréquence cardiaque. Cependant, la récupération peut être réalisée en réduisant le taux d’isoflurane.
3. Mesures de pression RV (approche thoracique ouverte)
   1. Avec de petits ciseaux effectuer une incision de la peau d’environ 1 cm sur le processus xiphoide et la partie abdominale supérieure. Séparez la peau couvrant la poitrine et la paroi abdominale des quadrants abdominaux supérieurs : commencez à la ligne médiane, distale au xiphoide et déplacez-vous soigneusement de façon postérieure des deux côtés. Utilisez la thermocauté pour contrôler les saignements.
      REMARQUE : Le but est d’avoir accès à la cavité thoracique par la paroi abdominale.
   2. Ouvrez la cavité abdominale et coupez soigneusement le diaphragme, en prenant soin de ne pas blesser le cœur ou les poumons.
      NOTE: Le but est d’exposer l’apex et le ventricule droit du cœur. Une bonne exposition et une bonne vue du cœur sont d’une importance cruciale pour le placement correct du cathéter. Il est d’une grande importance d’éviter les saignements tout au long de la procédure. Même de petits changements dans le volume intravasal peuvent modifier la charge du cœur droit et affecter les paramètres enregistrés.
   3. Retirez délicatement le péricarde à l’aide d’un applicateur à pointe de coton.
   4. Juste avant de placer le cathéter de pression dans le cœur, apportez le cathéter à côté de la souris.
   5. L’utilisation de l’applicateur préparé à pointe de coton avec l’aiguille fait une blessure au couteau dans la partie distale apicale du ventricule droit. Retirez soigneusement l’aiguille et insérez le cathéter de pression dans ce trou.
      REMARQUE : Cela devrait fonctionner sans appliquer la force. Dans le cas où cela n’est pas possible, essayez de faire un nouveau trou près du premier afin d’éviter les blessures prolongées du cœur. L’aiguille ne doit pas être insérée plus profondément qu’environ 3 mm.
   6. Insérez le cathéter de pression parallèle à la direction du ventricule droit, avec la pointe faisant face à l’artère pulmonaire.
   7. Surveillez le traçage des ondes de pression pour assurer le positionnement correct du cathéter. Les recherches représentatives sont démontrées à la figure 2.
   8. Laissez le signal de pression se stabiliser. Pause respirations et obtenir au moins 3 mesures. Entre les mesures individuelles, on peut aérer l’animal.
   9. Une fois que toutes les mesures sont enregistrées, retirez le cathéter et placez-le dans le tube rempli de PBS dans le bain d’eau.
      REMARQUE : Après l’expérience, nettoyez le cathéter selon les instructions du fabricant.
4. Euthanasie et perfusion pulmonaire
   1. À la fin de l’expérience euthanasier la souris par exsanguination.
   2. Ouvrez largement la poitrine. À l’aide de ciseaux, couper tout le sternum et faire attention à ne pas blesser le cœur ou les poumons.
   3. L’utilisation de ciseaux d’iris fait une petite incision dans le ventricule gauche pour permettre au sang de quitter la chambre.
   4. Placez l’aiguille de 25 G d’une seringue contenant 10 mL de PBS dans le ventricule droit et injectez la solution PBS jusqu’à ce que les poumons soient dégagés du sang.
   5. Une fois cette étape terminée, confirmez l’euthanasie par la récolte des tissus vitaux (cœur et poumons): couper le cava et les attachements aortiques et enlever le cœur et les poumons en bloc.

3. Caractérisation morphométrique

1. Immédiatement après avoir enlevé le cœur et les poumons (étape 2.4.5), isoler le cœur et enlever les deux atrias. Avec des ciseaux incurvés de tenotomie disséquent soigneusement le ventricule droit (RV) du ventricule gauche (LV), laissant le septum (S) avec le ventricule gauche. Peser RV et LV+S et calculer l’indice Fulton = RV/LV+ S (Figure 3)^5,9.
2. Prenez une partie du ventricule droit et placez-le dans un moule d’incorporation préremplie oct. Utilisez l’autre partie du ventricule droit pour l’analyse de l’ARN et/ou des protéines. Casser le gel dans la glace sèche et conserver à -80 °C.
3. Utilisez des ciseaux d’iris pour isoler les poumons du cœur et de tout autre tissu restant.
   REMARQUE : Pour la préparation des poumons, la perfusion décrite ci-dessus (étapes 2.4.3-2.4.5) est d’une grande importance.
4. Casser congeler une partie des poumons et la stocker pour l’ARN, l’extraction de protéines ou d’autres tests.
5. Utilisez l’autre partie des poumons pour l’analyse histologique. À cette fin, insérez la seringue contenant 50 % de PBS et 50 % d’OCT dans une bronche du lobe utilisé^10,11. L’expérimentateur peut facilement voir que le poumon se gonfle lorsque le contenu de la seringue est perfusé dans le tissu.
6. Placez ces morceaux de poumon dans les moules d’incorporation préremplis avec les PTOM et casser les congeler dans la glace sèche. Conserver les échantillons à -80 °C après leur congélation.
7. Préparer 8 sections de μm de RV et de poumon à l’aide d’une machine cryostat. Sécher les sections à l’air à température ambiante pendant 30 min.
8. Fixer les lames à température ambiante à l’aide de 10 % de paraformaldéhyde (PFA) pendant 10 min.
   NOTE : La PFA est un cancérogène connu pour l’homme. Réduisez le risque d’exposition à l’aide d’une hotte à fumée chimique, de procédures appropriées et d’un équipement de protection individuelle. Consultez la fiche de données sur la sécurité des matériaux (MSDS) pour plus d’informations.
9. Évaluation vascularisation de remodelage par coloration d’hématoxyline/d’éosine
   Note : Effectuer la coloration de l’hématoxyline/éosine afin d’évaluer les changements structurels du cœur et le remodelage vasculaire dans le poumon (Figure 3).
   1. Tacher avec la solution d’hématoxyline pendant 8 min.
   2. Rincer à l’eau courante du robinet pendant 5 min, puis rincer rapidement à l’eau distillée.
   3. Rincer à 95% EtOH pendant 1 min et contre-tacher dans la solution Eosin pendant 1 min.
   4. Déshydrater (80% éthanol 10-30 s, 100 éthanol pour 1 min et 100% toluol pendant 3 min).
   5. Monter et couvrir d’un couvercle. Sécher les toboggans toute la nuit à température ambiante.
      REMARQUE : Les solutions utilisées pour la coloration peuvent être dangereuses. Réduisez le risque d’exposition à l’aide d’une hotte à fumée chimique, de procédures appropriées et d’un équipement de protection individuelle. Reportez-vous au MSDS pour plus d’informations.
10. Évaluation de la fibrose ventriculaire droite par Picrosirius Red Staining
    NOTE: Dans le Picrosirius Red Staining, Picrosirius Rouge, qui est acide, se lie au collagène¹². Par conséquent, cette coloration peut être utilisée pour un examen histologique de la teneur en collagène.
    1. Incuber les lames dans une solution bouin préchauffée à 58 °C pendant 1 h.
    2. Laver les diapositives dans l’eau courante du robinet pour enlever la couleur jaune des sections pendant 10-15 min.
    3. Tacher dans 0,1% Vert rapide pendant 20 min à température ambiante.
    4. Rincer à 1% d’acide acétique pendant 1 min.
    5. Rincer à l’eau du robinet pendant 5 min.
    6. Tache dans 0,1% de sirius rouge pendant 30 min à température ambiante suivie de déshydratation dans le Toluol.
       ATTENTION : Les solutions utilisées pour la coloration peuvent être dangereuses. Réduisez le risque d’exposition à l’aide d’une hotte à fumée chimique, de procédures appropriées et d’un équipement de protection individuelle. Reportez-vous au MSDS pour plus d’informations.
11. Évaluation de l’hypertrophie de cardiomyocyte de RV par WGA Staining
    REMARQUE : L’hypertrophie du ventricule droit (RV) au niveau cellulaire peut être évaluée en effectuant une coloration d’agglutinine de germe de blé (WGA) (figure 4).
    1. Fixer les diapositives dans la solution d’acétone froide pendant 15 min suivie de 3 étapes de lavage en PBS (5 min chacune).
    2. Bloc avec 10% de sérum de chèvre dans une solution Dako pendant 30 min à température ambiante.
    3. Incuber les diapositives avec WGA: Ajouter WGA 1:200 et incuber pendant 1 1/2 h à 37 °C dans l’obscurité.
    4. Laver les diapositives trois fois avec PBS.
    5. Incuber les lames avec un colorant acide nucléique.
    6. Laver les diapositives trois fois avec PBS.
    7. Pour le montage, retirer l’excès de liquide et appliquer un support de montage et un couvercle. Sécher les lames pendant 1 heure à température ambiante dans l’obscurité et les conserver à 4 °C.
       REMARQUE : Les solutions utilisées pour la coloration peuvent être dangereuses. Réduisez le risque d’exposition à l’aide d’une hotte à fumée chimique, de procédures appropriées et d’un équipement de protection individuelle. Reportez-vous au MSDS pour plus d’informations.
12. Effectuer l’immunochimie du poumon pour évaluer plus loin et spécifiquement le remodelage vasculaire. Par exemple, la coloration lisse des cellules musculaires peut être utilisée pour évaluer la musculature des vaisseaux, tandis que la coloration de facteur von Willebrand peut être utilisée pour visualiser les changements endothéliales. Ces méthodes sont décrites ailleurs⁵.

Résultats

Dans ce protocole, nous décrivons en détail la création du modèle Hypoxia/SU5416 pour induire le PH chez les souris. En outre, nous détaillons toutes les étapes nécessaires pour effectuer l’évaluation vasculaire pulmonaire et cardiaque à la fin de la période d’observation.

Un aperçu de la conception expérimentale de ce modèle est présenté à la figure 1A^13,14. Les souris...

Discussion

Ce protocole décrit comment modéliser le PH chez la souris en combinant deux stimuli pathologiques : l’hypoxie chronique et l’injection de SU5416 (Hypoxia/SU5416)¹⁸. Dans une tentative de corréler ce modèle de souris avec la condition humaine ph, il faut inévitablement regarder la classification actuelle ph, indiqué dans le tableau 1. Ph sous presque toutes les formes est caractérisée par la vasoconstriction pulmonaire et la prolifération aberrante des cellules muscul...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid glacial	Roth	3738.1
Acetone, Histology Grade	The Lab Depot	VT110D
ADVantage Pressure-Volume System	Transonic	ADV500
Bouin's solution	Sigma	Ht10132
Cautery System	Fine Science Tools	18000-00
Connection tubing and valves
Cotton-Tipped Applicators	Covidien	8884541300
Coverslips, 24 x50 mm	Roth	1871
Data Acquisition and Analysis	Emka	iox2
Direct Red 80	Sigma	365548-5G
DMSO (Dimethyl Sulfoxide)	Sigma Aldrich	276855
Dry ice
Dumont # 5 forceps	Fine Science Tools	11251-10
Dumont # 7 Fine Forceps	Fine Science Tools	11274-20
Embedding molds	Sigma Aldrich	E-6032
Eosin Solution Aqueous	Sigma	HT110216
Ethanol, laboratory Grade	Carolina Biological Supply Company	861285
Fast Green FCF	Sigma	F7252-5G
Fine scissors	Fine Science Tools	14090-09
Goat Serum	invitrogen	16210-064
Heating pad	Gaymar	T/Pump
Hematoxylin 2	Thermo Scientific	7231
Hypoxic chamber	Biospherix	A30274P
Induction chamber	DRE Veterinary	12570
Intubation catheter (i.v. catheter SurFlash (20 G x 1") )	Terumo	SR*FF2025
Iris scissors	Fine Science Tools	14084-08
Isoflurane	Baxter	NDC-10019-360-40
Isoflurane vaporizer	DRE Veterinary	12432
Mice (C57BL/6)	Charles River
Needles 25 G x 5/8"	BD	305122
OCT	Tissue Tek	4583
PBS (Phosphate Buffered Saline)	Corning	21-031-CV
Piric Acid- Saturated Solution 1.3 %	Sigma	P6744-1GA
Pressure volume catheter	Transonic	FTH-1212B-4018
Retractor	Kent Scientific	SURGI-5001
Static oxygen Controller ProOx 360	Biospherix	P360
SU 5416	Sigma Aldrich	S8442
Surgical Suture, black braided silk, 5.0	Surgical Specialties Corp.	SP116
Surgical tape	3M	1527-1
Syringe 10 ml	BD	303134
Syringes with needle 1 ml	BD	309626
Sytox Green Nuclein Acid Stain	Thermo Scientific	S7020
Tenotomy scissors	Pricon	60-521
Toluol	Roth	9558.3
Ventilator	CWE	SAR-830/P
WGA Alexa Fluor	Thermo Scientific	W11261
Xylene	Roth