In Vivo Tri-Dimensional Two-Photon Microscopy to Study Conducted Vascular Responses by Local ATP Ejection Using a Glass Micro-Pipette In Vivo Tri-Dimensional Two-Photon Microscopy to Study Conducted Vascular Responses by Local ATP Ejection Using a Glass Micro-Pipette In Vivo

Résumé

Nous présentons une procédure d'éjection locale optimisée utilisant une micropipette en verre et une méthode rapide d'imagerie d'hyperpile de deux photons, qui permet la mesure précise des changements de diamètre capillaire et l'étude de sa régulation en trois dimensions.

Résumé

Le maintien de la fonction cérébrale normale nécessite un approvisionnement suffisant et efficace en oxygène et en nutrition par un réseau complexe de vaisseaux. Cependant, la régulation du flux sanguin cérébral (CBF) est incomplètement comprise, particulièrement au niveau capillaire. La microscopie à deux photons est un outil puissant largement utilisé pour étudier la CBF et sa régulation. À l'heure actuelle, ce domaine est limité par l'absence d'études in vivo de microscopie à deux photons examinant (1) les réponses CBF en trois dimensions, (2) les réponses vasculaires menées et (3) les interventions localisées au sein du réseau vasculaire. Ici, nous décrivons une méthode in vivo 3D utilisant la microscopie de deux photons pour étudier les réponses vasculaires menées obtenues par l'éjection locale de l'ATP avec une micro-pipette en verre. Notre méthode utilise l'imagerie rapide et répétitive de deux photons d'hyperpile fournissant des mesures précises de diamètre par projection d'intensité maximale des images obtenues. En outre, nous montrons que cette méthode peut également être utilisée pour étudier les réponses 3D de calcium astrocytique. Nous discutons également des avantages et des limites de l'insertion de micropipette en verre et de l'imagerie d'hyperpile à deux photons.

Introduction

Le cerveau a un taux de consommation d'énergie élevé. Environ 20% de l'oxygène et 25% du glucose consommé par le corps humain sont dédiés à la fonction cérébrale, tandis que le cerveau occupe seulement 2% de la masse corporelle totale. Le maintien de la fonction cérébrale normale nécessite un approvisionnement suffisant et efficace en oxygène et en nutrition par le flux sanguin dans un réseau complexe de vaisseaux. L'activité cérébrale locale et le flux sanguin cérébral (CBF) sont solidement couplés, selon les propriétés fonctionnelles des neurones, des astrocytes, des péricytes, des cellules musculaires lisses (SMC) et des cellules endothéliales (EC)¹. Récemment, les premiers ordres de capillaires ramifiant des artérioles pénétrantes ont émergé comme un «hotspot»², montrant une régulation active de la circulation sanguine capillaire. Une réponse vasculaire menée lentement (CVR) a été découverte à ce « point chaud » dans le cortex somatosensoriel de souris pendant la stimulation de moustaches et l'éjection locale (puffing) de l'ATP avec une micro-pipette^enverre 3.

Bien que l'imagerie in vivo par microscopie fluorescente à balayage laser à deux photons ait été largement utilisée pour étudier les réponses neurovasculaires dans le cortex cérébral, la plupart des études ont mesuré le diamètre des vaisseaux sanguins et étudié leur régulation dans un plan x-y en deux dimensions (2D). Les défis sont les : Tout d'abord, les vaisseaux sanguins cérébraux et leurs astrocytes, péricytes et SMC construisent des branches en trois dimensions (3D). Il est donc crucial d'étudier leurs interactions en 3D. Deuxièmement, même une petite quantité de dérive dans la mise au point affectera la mesure précise des diamètres des navires et des signaux fluorescents cellulaires. Enfin, les CVR sont rapides et de grande portée en trois dimensions. La numérisation du volume 3D est optimale pour détecter les CVR et dévoiler leurs mécanismes. Nous avons mis en œuvre un objectif de moteur piezo dans un microscope à deux photons pour étudier le cortex somatosensoriel de souris in vivo, permettant des mesures précises de diamètre par des projections d'intensité maximale des images obtenues.

Les micro-pipettes en verre ont souvent été utilisées pour des études in vivo sur le cerveau, par exemple pour charger en vrac des colorants organiques⁴, enregistrer les EEG⁵ et pour le clampage des timbres⁶. Néanmoins, des limites subsistent. Généralement, la pointe de la micro-pipette en verre est imprécise, ou la micro-pipette n'est pas utilisée pour les interventions locales. Ici, nous avons optimisé la procédure d'insertion de micro-pipettes et d'éjection locale.

En outre, la combinaison de la microscopie 3D à deux photons et d'indicateurs fluorescents génétiquement codés offre une occasion sans précédent d'étudier le couplage neurovasculaire dans une portée 3D. Dans cette étude, nous avons profité de ceci et avons injecté des vecteurs viraux portant des indicateurs de calcium génétiquement-encodés spécifiques d'astrocyte dans le cortex somatosensory de souris. Les astrocytes ainsi que les diamètres des vaisseaux ont été photographiés simultanément en combinant différents marqueurs fluorescents.

Dans l'ensemble, nous présentons une méthode optimisée d'éjection locale (puffing) par micro-pipette en verre et l'imagerie rapide de l'hyperpile à deux photons, qui permet de mesurer avec précision les changements de diamètre capillaire. En outre, notre méthode fournit un nouvel outil pour étudier simultanément les profils 3D des réponses Ca^{2 dans} les astrocytes et les réponses de diamètre vasculaire.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été approuvées par le Comité national danois d'éthique conformément aux lignes directrices énoncées dans la Convention du Conseil européen pour la protection des animaux vertébrés utilisés à des fins expérimentales et scientifiques et respectaient les lignes directrices de l'ARRIVE. Il s'agit d'une procédure terminale avec les souris étant euthanasiées avant la récupération anesthésique.

1. Préparation préchirurgicale

1. Nettoyer la table chirurgicale et toute la zone environnante avec 70% d'éthanol. Nettoyez et séchez soigneusement les outils chirurgicaux avant la chirurgie.
2. Anesthésiez une souris NG2DsRed (Tg(Cspg4-DsRed.T1)1Akik/J; les deux sexes; 4-8 mois) par une injection péritonéale de kétamine et xylazine (60 mg/kg et 10 mg/kg) dissoute dans de l'eau stérilisée, pH 7,4. Administrer des doses supplémentaires de kétamine (30 mg/kg) toutes les 25 min jusqu'à l'achèvement de l'intervention chirurgicale. Vérifiez régulièrement les réflexes de pincement de la queue et des orteils pour vérifier la profondeur de l'anesthésie.
3. Injecter saline sous-cutanée à quatre endroits différents sur le dos de la souris pour un volume total de 1 ml pour prévenir la déshydratation pendant l'expérience. Pour protéger les yeux du dessèchement, appliquez du lubrifiant pour les yeux. Maintenir la température corporelle à 37 oC à l'aide d'une sonde à température rectale et d'une couverture chauffante.

2. Procédure chirurgicale

1. Trachéotomie
   1. Placez la souris sur le dos. Injecter 0,04 ml de lidocaïne de 0,5 % sous-cutané sous l'incision prévue et attendre 2 min. Faire une incision de 10 mm de long au-dessus de l'os thoracique (manubrium). Séparez les glandes submandibulaires et les muscles stériliques, puis exposez la trachée.
   2. Faire la trachéotomie entre deux anneaux trachéaux avec des ciseaux. Insérer un petit tube métallique d'une longueur de 16,2 mm et d'un diamètre de 1 mm dans la trachée. Connectez le tube à un ventilateur mécanique et à un capnographe pour surveiller le CO₂ (figure1A).
2. Insertion de cathéter
   1. Injecter 0,5 % de lidocaïne (0,04 ml) sous-cutané sous l'incision prévue et attendre 2 min.
   2. À l'aide de fines pointes, séparer délicatement l'artère de la veine. Arrêtez le flux sanguin en amont avec une pince microvasculaire. Limitez le flux sanguin en aval avec une suture en nylon 10-0 ligant les deux vaisseaux sanguins.
   3. Utilisez des ciseaux micro-disséquants pour faire une petite incision dans l'artère et la veine. Insérer des cathéters en plastique dans les deux vaisseaux sanguins. Sécuriser les cathéters en resserrant les sutures (8-0 ou 10-0 sutures en nylon dépendant de la taille du navire) sans compromettre les lumens cathéter. Retirez la pince microvasculaire et fermez la peau.
   4. Surveillez la pression artérielle par le cathéter artériel. Mesurer les niveaux de gaz sanguins dans les échantillons de sang artériel (50 l) avant et après chaque expérience (valeurs normales: pO₂, 90-120 mmHg; pCO₂, 35-40 mmHg; pH, 7,25-7,45) à l'aide d'un analyseur de gaz sanguin. Utilisez le cathéter veineux pour l'infusion de fluorescéine et d'anesthésie.
3. Craniotomie
   1. Raser la fourrure de la tête de la souris entre les oreilles. Injecter 0,04 ml de 0,5 % de lidocaïne sous-cutané sous l'incision prévue et attendre 2 min.
   2. Essuyez le crâne à l'aide d'une solution de 10 % de fer-chlorure pour enlever le périoste. Rincer le crâne à fond avec salin. Collez une barre de tête en métal au crâne avec de la colle et un activateur de cyanoacrylate (Figure 1A).
      REMARQUE : La barre de tête en métal est de 75 mm de long et 13,5 mm de large, avec un trou rond de 5 mm de diamètre au centre.
   3. Percer une craniotomie de 4 mm de diamètre, centrée à 0,5 mm derrière et 3 mm à droite du bregma au-dessus du cortex du canon sensoriel droit. Retirer la dura à l'aide d'un dilatateur de navire à pointe fine.
   4. Couvrir le cortex exposé de gel agarose de 0,75 %, dissous dans du liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF; pH à 7,4) et refroidi à 35 oC. Couvrez 80-90% de la craniotomie avec un couvercle en verre à un angle de 10-15 degrés à la barre de tête en métal (figure 1B) qui permet l'insertion et le placement de la micro-pipette en verre.
   5. Pour minimiser la pulsation cérébrale, collez les deux coins de la couverture en verre sur la barre de tête en métal avec de la colle cyanoacrylate et l'activateur. Appliquer l'activateur avec soin pour éviter d'entrer dans le cerveau exposé. Rincer le couvercle en verre collé à fond avec salin par la suite.
4. Effectuer l'insertion de la sonde de stimulation du tampon de moustachu. Insérez un ensemble d'électrodes bipolaires sur mesure (8 mm de longueur et 0,25 mm d'épaisseur) percutanément dans le côté gauche de la face pour stimuler les infraorbitalis ramus du nerf trigeminal contralatéral à la craniotomie. Placez la cathode près de l'infraorbitalis hiatus, et insérez l'anode dans les muscles masticatoires⁷. Effectuer la stimulation avec un stimulateur électrique à une intensité de 1,5 mA pour 1 ms dans les trains de 20 s à 2 Hz.
5. À la fin de la chirurgie, administrer un bolus de 0,05 mL de fluorescéine isothiocyanate-dextran (FITC-dextran, 4% w/v, poids moléculaire [MW] 50.000) dans la veine fémorale pour étiqueter le plasma sanguin. Interrompre la kétamine et passer à l'infusion intraveineuse continue de chloralose (17 % w/v, concentration finale) mélangée à du FITC-dextran (2 % w/v, concentration finale) à 0,02 mL/10 g/h. Attendez environ une demi-heure pour stabiliser le nouveau l'état anesthésique.
   REMARQUE : Le FITC-dextran et le chloralose sont dissous en salin de 0,9 %.

3. Première séance d'imagerie à deux photons

1. Transférer la souris au stade d'un microscope commercial à deux photons (Table of Materials). Sous les deux modes de protéines fluorescentes rouges (DP, figure 1C) et de protéines fluorescentes vertes (GFP, figure 1C)d'éclairage épifluorescent, prenez une photo du cortex exposé avec un objectif 5x. Utilisez l'image de la DP comme « carte » pour l'insertion de la micro-pipette en verre lors de la session suivante.
   REMARQUE : La « carte » de GFP est utilisée pour distinguer les veines/les œilles des artères/artérioles.
2. Effectuez l'imagerie à deux photons à l'aide du microscope à deux photons et d'un objectif d'immersion de l'eau de 25 x 1,0 (NA) avec le moteur piezo. Définir la longueur d'onde de l'excitation à 900 nm. Rechercher le cortex et suivre chaque artériole pénétrante et trouver ses branches horizontales (1 capillaires^de l'ordre).
3. Image arterioles pénétrantes et leurs capillaires 1^er ordre au repos et pendant la stimulation de tampon de moustaches. Voir les paramètres d'imagerie détaillés de la section 5.
4. Marquez les emplacements des capillaires de 1^ère de commande avec une vasodilatation de 5 % pendant la stimulation des moustachus sur la « carte » de la DP (Figure 1C). Les emplacements avec la vasodilatation de 5 % sont considérés comme étant en dehors de la région du cortex du baril de moustaches.
   REMARQUE : Si vous utilisez des souris de type sauvage au lieu de souris NG2DsRed dans l'expérience, l'image GFP est utilisée comme « carte » à la place.

4. Insertion de la micro-pipette en verre

1. Préparer des micro-pipettes en verre pour la bouffée à l'aide d'une pipette (Tableaudes matériaux). Les micro-pipettes en verre ont une résistance de 3-3.5 M et une longueur de cône de 4.5-5 mm. Chargez une pipette avec un mélange de 1 mM ATP et 10 'M Alexa 594 afin de visualiser la pointe de pipette sous la lampe épi-fluorescente et le microscope à deux photons.
2. Montez la micro-pipette en verre sur un porte-étanchéité et connectez-la à une pompe à air. Définir la pompe en maintenant la pression à 0 psi.
3. À l'aide de l'éclairage épifluorescent rouge, concentrez-vous sur la pointe de la pipette avec l'objectif 5x. Placez la micro-pipette en verre dans l'aCSF au-dessus de l'agarose. Ajuster la pression de fixation de la pompe à air à 0,2 psi. Un petit nuage rouge peut être observé éjectant de la pointe de pipette dans l'aCSF. Il s'agit d'éviter l'engorgement pendant l'insertion de pipette.
4. Choisissez l'un des emplacements marqués dans la « carte » de la DP comme destination. Déplacez l'extrémité de la pipette vers le plan horizontal du bord de verre de couverture avec une distance de 30 m, pointant grossièrement vers la destination dans le plan x-y.
5. Abaissez soigneusement la pointe de pipette dans l'axe z sous le bordereau de verre de couverture. Ensuite, commencez à avancer la pipette en verre vers la destination jusqu'à 500 m au-dessus de la surface du cerveau. Basculez fréquemment entre le bord de verre de couverture, l'extrémité de pipette et la surface de cerveau, s'assurant qu'il y a assez d'espace libre pour déplacer la pipette.
6. Passez l'objectif à 25x. Recentrez la pointe de la pipette et avancez la pointe de la pipette plus loin vers la destination sur la « carte » de la DP. Gardez la pointe de pipette dans la couche d'agarose.
7. Lorsque l'extrémité de la pipette est à 100 m au-dessus de la surface du cerveau, passez le mode d'imagerie à la microscopie à deux photons. Concentrez-vous sur un endroit cible où souffler. Notez ses coordonnées x, y (x₀, y₀) et sa profondeur sous la surface (z₀). Calculer les coordonnées du point d'insertion sur la surface du cerveau (x_i, y_i) comme suit:
   x_i x ₀ z₀ / tan
   y_i y₀
   où est l'angle entre le porte-pipette et le plan horizontal.
8. Placez la pointe de pipette aux coordonnées (x_i, y_i) sur la surface du cerveau. Insérez doucement et lentement la pipette jusqu'à ce qu'elle atteigne (x₀, y₀, z₀). Si un navire est en voie de trajectoire d'insertion, retirez la pipette et recalculez d'autres coordonnées et trajectoires d'insertion; ou tourner légèrement la plaque d'étape (comme indiqué à la figure 1A).
9. Fixer la pression de maintien de la pompe à 0 psi et la pression d'éjection à 10-15 psi. Puff ATP pour 200-400 ms à l'emplacement cible pendant l'imagerie à deux photons. Ajuster la pression et la durée de la bouffée pour chaque pipette et au fil du temps comme expliqué dans la section de discussion.

5. Imagerie à deux photons Hyperstack

1. Effectuez des expériences à l'aide du microscope à deux photons et d'un objectif d'immersion d'eau 25 x 1,0 NA avec moteur piezo. Définir la longueur d'onde de l'excitation à 900 nm. Filtrer la lumière émise pour recueillir la lumière rouge de DsRed (péricytes)/téramethylrhodamine isothiocyanate-dextran (TRITC-dextran) colorant le plasma sanguin et la lumière verte de FITC-dextran (plasma sanguin)/GCaMP6 (GFP, calcium astrocytique).
2. Produire une z-pile haute résolution à l'endroit d'intérêt contenant une artériole pénétrante, un capillaire de 1er ordre, un 2^nd cellules capillaires d'ordre et peut-être voisines (par exemple, péricytes, astrocytes). Déterminez le volume d'imagerie par hyperpile en incluant autant que possible la structure 3D des vaisseaux sanguins. La hauteur totale de chaque pile peut varier de 30 à 50 m, tandis que l'avion x-y couvre à peu près une superficie de 60 m x 40 m.
3. Définir la pile d'images dans le logiciel d'imagerie pour être composé de 8-10 avions avec une distance inter-plan de 4-5 m. L'objectif piezo-moteur s'arrête à chaque niveau sur l'axe z pour acquérir l'image de chaque plan. Le taux d'échantillonnage est de 1 s par pile et la résolution des pixels dans le plan x-y est de 0,2 à 0,3 m (Figure 2A). Un enregistrement comprend normalement 10 piles d'images pré-puff et 150 piles d'images post-puff.

6. Traitement des données

1. Traiter les données à l'aide d'un logiciel d'analyse sur mesure. Aplatir chaque pile d'images en une seule image par projection d'intensité maximale (Figure 2B). Dessiner une région rectangulaire d'intérêt (ROI) d'une largeur de 3 m impédiculairement à travers le navire d'intérêt (figure 2C).
2. Pour minimiser les interférences des ombres des globules rouges et des vibrations mineures du cortex, faites la moyenne du retour sur investissement rectangulaire en le projetant en une seule ligne, ce qui représente ensuite le profil moyen du segment du vaisseau. Faites ceci pour chaque image d'intensité maximale.
3. Tracer les lignes de profil comme une image 2D avec l'axe X représentant des images d'intensité maximale dans l'ordre chronologique (Figure 2D, panneau supérieur). Utilisez un algorithme de contour actif (segmentation Chan-Vese) pour trouver les bords du navire^8,9 (indiqué par des courbes rouges; Figure 2 D, panneau supérieur).
4. Calculer le cours temporel du diamètre change à mesure que la différence entre les bords du vaisseau sanguin (distance verticale entre les courbes rouges supérieures et inférieures de la figure 2D, panneau inférieur). Normaliser les changements de diamètre à la ligne de base de diamètre pré-puffing et les courbes de parcelle de changement de diamètre au fil du temps. Faites-le pour chaque retour sur investissement (Figure 2E).
5. L'amplitude de réponse du navire est définie comme l'amplitude de pointe la plus élevée/la plus basse après avoir soufflé. La latence de réponse est définie comme la latence de l'amplitude demi-max (figure 2G). Tracer manuellement la structure vasculaire squelettée en plaçant des nœuds le long des vaisseaux (figure 2F) et en mesurant la distance géographique entre chaque retour sur investissement et l'artériole pénétrante. Calculez la vitesse du CVR en divisant les distances par des différences de latence.

7. Injection vectorielle virale

1. Afin d'étudier simultanément les réponses astrocytiques du calcium, injectez un volume de vecteur viral de 0,6 L (pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f, Addgene) dans le cortex somatosensoriel des souris NG2DsRed, suivant la procédure standard d'injection vectorielle virale stéréotaxique ¹⁰.
2. Après trois semaines, les astrocytes dans le cortex somatosensory de souris expriment l'indicateur génétiquement codé de calcium, GCaMP6f. Suivez l'intervention chirurgicale susmentionnée et l'imagerie à deux photons pour les souris. Pour faire la distinction entre les astrocytes et la sommité des vaisseaux, TRITC-dextran au lieu de FITC-dextran est utilisé pour tacher la lumina rouge vaisseaux.

Résultats

Une fois la chirurgie terminée, les souris ont été transportées au microscope à deux photons (figure1A). Une micropipette en verre contenant 1 mM d'ATP a été insérée à proximité du vaisseau sanguin de destination à l'endroit cible (figure 1B).

Nous avons effectué l'imagerie hyperpile tout en donnant une bouffée de 1 mM ATP (Figure 2A, Vidéo...

Discussion

Un défi pour les études vasculaires est la mesure précise du diamètre des vaisseaux. La méthode que nous décrivons ici a employé un objectif motorisé de piezo pour faire l'imagerie rapide et répétitive d'hyperpile par microscopie de deux photons. Tout d'abord, cette méthode permet des examens répétés de l'artériole pénétrante, 1er ordre et 2 capillaires d'ordre sans perte de concentration et a conduit à la découverte de réponses vasculaires lentement menées dans les capillaires in vivo.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma–Aldrich	A6138	Apply upon exposed cortex for protection
Alexa 594	Life Technologies	A-10438	Stain puffing compound to red fluorescent color
ATP	Sigma-Aldrich	A9187	Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound
Cyanoacrylate glue and activator	Loctite	Adhesives and SF7452	Glue for metal piece and coverglass
Eye lubricant	Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark		Keep the mouse eyes moisterized
FITC-dextran	Sigma-Aldrich	FD500S	Blood serum dye, green fluorescent color
NG2DsRed mice	Jackson Laboratory	8241	These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter
pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f	Addgene	52924-AAV5	Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators
TRITC-dextran	Sigma-Aldrich	52194	Blood serum dye, red fluorescent color
List of Equipments
Air pump	WPI	PV830	Give air pressure to pipette puffing
Blood gas analyzer	Radiometer	ABL 700	Measure levels of blood gases
Blood pressure monitor	World Precision Instruments	BP-1	Monitor aterial blood pressure
Body temperature controller	CWE	Model TC-1000	Keep the mouse body temperature in physiological range
Capnograph	Harvard Apparatus	Type 340	Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse
Electrical stimulator	A.M.P.I.	ISO-flex	Apply whisker pad stimulation
Mechanical ventilator	Harvard Apparatus	D-79232	Mechanically ventilate the mouse in physiological range
Micropipette puller	Sutter Instrument	P-97
Two-photon microscope	Femtonics Ltd	Femto3D-RC
List of Surgical Instruments
Anatomical tweezer	Lawton	09-0007
Angled and balanced tweezer	S&T AG	00595 FRAS-18 RM-8
Iris scissor	Lawton	05-1450
Micro vascular clamp	S&T AG	462
Mouse vascular catheters	Verutech	100828