In Vivo microscopia bidimensionale bidimensionale per studiare le risposte vascolari mediante l'espulsione locale dell'ATP utilizzando una micropipetta di vetro

Riepilogo

Vi presentiamo una procedura di espulsione locale ottimizzata utilizzando una micro-pipetta di vetro e un metodo di imaging iperpilato a due fotoni veloce, che consente una misurazione precisa dei cambiamenti di diametro capillare e l'analisi della sua regolazione in tre dimensioni.

Abstract

La manutenzione della normale funzione cerebrale richiede una fornitura sufficiente ed efficiente di ossigeno e nutrizione da parte di una complessa rete di vasi. Tuttavia, la regolazione del flusso sanguigno cerebrale (CBF) è incompletamente compresa, soprattutto a livello capillare. La microscopia a due fotoni è un potente strumento ampiamente utilizzato per studiare la CBF e la sua regolazione. Attualmente, questo campo è limitato dalla mancanza di studi in vivo sulla microscopia a due fotoni che esaminano (1) le risposte CBF in tre dimensioni, (2) hanno condotto risposte vascolari e (3) interventi localizzati all'interno della rete vascolare. Qui, descriviamo un metodo 3D in vivo usando la microscopia a due fotoni per studiare le risposte vascolari condotte provocare l'espulsione locale dell'ATP con una micropipetta di vetro. Il nostro metodo utilizza immagini iperimpilate a due fotone veloci e ripetitive, fornendo misurazioni precise del diametro mediante la proiezione dell'intensità massima delle immagini ottenute. Inoltre, mostriamo che questo metodo può essere utilizzato anche per studiare le risposte di calcio astrocitico 3D. Discutiamo anche dei vantaggi e dei limiti dell'inserimento di micropipe in vetro e dell'imaging iperstack a due fotoni.

Introduzione

Il cervello ha un alto tasso di consumo di energia. Circa il 20% dell'ossigeno e il 25% del glucosio consumato dal corpo umano sono dedicati alla funzione cerebrale, mentre il cervello occupa solo il 2% della massa corporea totale. Il mantenimento della normale funzione cerebrale richiede un apporto sufficiente ed efficiente di ossigeno e nutrizione da flusso sanguigno in una complessa rete di vasi. L'attività cerebrale locale e il flusso sanguigno cerebrale (CBF) sono robustamente accoppiati, a seconda delle proprietà funzionali di neuroni, astrociti, periciti, cellule muscolari lisce (SMC) e cellule endoteliali (EC)¹. Recentemente, i primi ordini di capillari che si ramificano dalle arteriole penetranti sono emersi come un 'hotspot'², che mostra la regolazione attiva del flusso sanguigno capillare. Una risposta vascolare lenta condotta (CVR) è stata scoperta in questo 'hotspot' nella corteccia somatosensoriale del topo sia durante la stimolazione del baffo che l'espulsione locale (puffing) di ATP con una micro-pipetta di vetro³.

Sebbene l'imaging in vivo mediante microscopia fluorescente a scansione laser a due fotoni sia stato ampiamente utilizzato per studiare le risposte neurovascolari nella corteccia cerebrale, la maggior parte degli studi ha misurato i diametri dei vasi sanguigni e ne ha studiato la regolazione in un piano x-y bidimensionale (2D). Le sfide sono: in primo luogo, i vasi sanguigni cerebrali e la loro adozione di astrociti, periciti e SMC costruiscono rami in tre dimensioni (3D). È quindi fondamentale studiare le loro interazioni in 3D. In secondo luogo, anche una piccola quantità di deriva a fuoco influenzerà la misurazione precisa sia dei diametri dei vasi che dei segnali fluorescenti cellulari. Infine, i CCR sono veloci e di vasta portata in tre dimensioni. La scansione del volume 3D è ottimale per rilevare i CCR e svelare i loro meccanismi. Abbiamo implementato un obiettivo motorio piezoso in un microscopio a due fotoni per studiare la corteccia somatosensoriale dei topi in vivo, consentendo misurazioni precise del diametro mediante proiezioni di intensità massima delle immagini ottenute.

Le micropipe in vetro sono state spesso utilizzate per studi sul cervello in vivo, ad esempio per caricare alla rinfusa coloranti organici⁴, registrare EEG⁵ e per il bloccaggio delle patch⁶. Tuttavia, permangono delle limitazioni. Comunemente, la punta della micro-pipetta di vetro è posizionata in modo incontuoso, o la micro-pipetta non viene utilizzata per interventi locali. Qui, abbiamo ottimizzato la procedura di inserimento di micro-pipette e espulsione locale.

Inoltre, la combinazione di microscopia 3D a due fotoni e indicatori fluorescenti geneticamente codificati offre un'opportunità senza precedenti di studiare l'accoppiamento neurovascolare in un ambito 3D. In questo studio, abbiamo approfittato di questo e iniettato vettori virali che trasportano indicatori di calcio geneticamente codificati specifici dell'astrocite nella corteccia somatosensoriale del topo. Gli astrociti e i diametri dei vasi sono stati immagini simultaneamente combinando diversi marcatori fluorescenti.

Nel complesso, presentiamo un metodo ottimizzato di espulsione locale (puffing) da micro-pipetta di vetro e imaging veloce per iperpilati a due fotoni, che consente una misurazione precisa dei cambiamenti di diametro capillare. Inoltre, il nostro metodo fornisce un nuovo strumento per studiare contemporaneamente i profili 3D delle risposte Ca^{2 in} astrociti e risposte di diametro vascolare.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state approvate dal Comitato etico nazionale danese secondo le linee guida stabilite nella Convenzione del Consiglio europeo per la protezione degli animali vertebrati utilizzati per scopi sperimentali e di altro tipo e rispettavano le linee guida di ARRIVE. Questa è una procedura terminale con i topi che vengono eutanasiati prima del recupero anestetico.

1. Preparazione pre-chirurgica

1. Pulire la tavola chirurgica e tutta l'area circostante con il 70% di etanolo. Pulire e asciugare accuratamente gli strumenti chirurgici prima dell'intervento.
2. Anestesizzare un topo NG2DsRed (Tg(Cspg4-DsRed.T1)1Akik/J; entrambi i sessi; 4-8 mesi) da un'iniezione peritoneale di ketamina - xylazina (60 mg/kg - 10 mg/kg) disciolto acqua sterilizzata, pH 7.4. Somministrare dosi supplementari di chetamina (30 mg/kg) ogni 25 min fino al completamento della procedura chirurgica. Controllare regolarmente i riflessi della coda e del pizzico delle dita dei dei dei dei dei dei dei dei dei pipimi per verificare la profondità dell'anestesia.
3. Iniettare la salina sottocutanea in quattro posizioni diverse sul retro del mouse per un volume totale di 1 mL per prevenire la disidratazione durante l'esperimento. Per proteggere gli occhi dall'essiccazione, applicare il lubrificante per gli occhi. Mantenere la temperatura corporea a 37 gradi centigradi utilizzando una sonda a temperatura rettale e una coperta riscaldante.

2. Procedura chirurgica

1. Tracheotomia
   1. Posizionare il mouse sulla schiena. Iniettare 0,04 mL dello 0,5% di lidocaina sotto l'incisione pianificata e attendere 2 min. Separare le ghiandole submandibolare e i muscoli sternotroidi, quindi esporre la trachea.
   2. Fare la tracheostomia tra due anelli tracheali con le forbici. Inserire un piccolo tubo metallico con una lunghezza di 16,2 mm e un diametro di 1 mm nella trachea. Collegare il tubo a un ventilatore meccanico e a un capnografo per monitorare il CO₂ espiratorio finale (Figura1A).
2. Inserimento catetere
   1. Iniettare 0.5% lidocaina (0.04 mL) sotto l'incisione prevista e attendere 2 min.
   2. Utilizzando pinze punta fine separare delicatamente l'arteria dalla vena. Fermare il flusso sanguigno a monte con un morsetto microvascolare. Costringi il flusso sanguigno a valle con una sutura di nylon 10-0 che lega entrambi i vasi sanguigni.
   3. Utilizzare forbici micro-dissettive per fare una piccola incisione sia nell'arteria che nella vena. Inserire cateteri di plastica in entrambi i vasi sanguigni. Fissare i cateteri stringendo le suture (8-0 o 10-0 suture di nylon dipendenti dalle dimensioni del vaso) senza compromettere i lumami del catetere. Rimuovere il morsetto microvascolare e chiudere la pelle.
   4. Monitorare la pressione sanguigna tramite il catetere arterioso. Misurare i livelli di gas ematici nei campioni di sangue arterioso (50) prima e dopo ogni esperimento (valori normali: pO₂, 90-120 mmHg; pCO₂, 35-40 mmHg; pH, 7.25-7.45) utilizzando un analizzatore di gas sanguigno. Utilizzare il catetere della vena per l'infusione di fluoresceina e anestesia.
3. Craniotomy
   1. Rasare la pelliccia dalla testa del topo tra le orecchie. Iniettare 0,04 mL dello 0,5% di lidocaina sotto l'incisione pianificata e attendere 2 min.
   2. Pulire il cranio utilizzando una soluzione di cloruro di ferro al 10% per rimuovere il periosteo. Sciacquare accuratamente il cranio con la salina. Incollare una barra di testa metallica al cranio con colla e attivatore di cianoacrita (Figura 1A).
      NOTA: La barra della testa metallica è lunga 75 mm e larga 13,5 mm, con un foro rotondo di 5 mm di diametro al centro.
   3. Forare una craniotomia di 4 mm di diametro, centrata a 0,5 mm dietro e 3 mm a destra della bregma sulla corteccia della canna sensoriale destra. Rimuovere la dura con un dilatatore a punta fine.
   4. Coprire la corteccia esposta con gel di agarose dello 0,75%, disciolto nel liquido cerebrospinale artificiale (aCSF; pH 7,4) e raffreddato a 35 gradi centigradi. Coprire l'80-90% della craniotomia con un coperchio di vetro con un angolo di 10-15 gradi rispetto alla barra di testa metallica (Figura 1B) che consente l'inserimento e il posizionamento della micro-pipetta di vetro.
   5. Per ridurre al minimo la pulsazione cerebrale, incollare i due angoli del coperchio di vetro sulla barra della testa metallica con colla cianoacrilata e attivatore. Applicare l'attivatore con attenzione per evitare di entrare nel cervello esposto. Sciacquare il coperchio di vetro incollato accuratamente con salina in seguito.
4. Eseguire l'inserimento della sonda di stimolazione del pad del baffo. Inserire una serie di elettrodi bipolari su misura (lunghezza 8 mm e spessore di 0,25 mm) percutaneamente nel lato sinistro del viso per stimolare il ramus infraorbitalis del nervo trigeminale contraplaterale alla craniotomia. Posizionare il catodo vicino alla pausa infraorbitalis e inserire l'anodo nei muscoli masticatori⁷. Eseguire la stimolazione con uno stimolatore elettrico ad un'intensità di 1,5 mA per 1 ms in treni di 20 s a 2 Hz.
5. Al termine dell'intervento, somministrare un bolo di isotoniociocionano-dextran (FITC-dextran, 4% w/v, peso molecolare [MW] 50.000) nella vena femorale per etichettare il plasma sanguigno. Interrompere la chetamina e passare l'anestesia a infusione endovenosa continua di z-cloralo (17% w/v, concentrazione finale) mescolata con FITC-dextran (2% w/v, concentrazione finale) a 0,02 mL/10 g/h. Attendere circa mezz'ora per la stabilizzazione del nuovo stato anestetico.
   NOTA: sia fitC-dextran che cloralo sono dissolti nello 0,9% salino.

3. Prima sessione di imaging a due fotoni

1. Trasferire il mouse allo stadio di un microscopio commerciale a due fotoni (Tabella dei Materiali). In entrambi i modi di illuminazione epi-fluorescente, in base alle proteine fluorescenti rosse (RFP, Figura 1C) e alle proteine fluorescenti verdi (GFP, Figura 1C)dell'illuminazione epifluorescente, scattare una foto della corteccia esposta con un obiettivo 5x. Utilizzare l'immagine RFP come una "mappa" per l'inserimento della micropipetta di vetro nella sessione successiva.
   NOTA: La "mappa" GFP viene utilizzata per distinguere le vene/venule dalle arterie/arteriole.
2. Eseguire l'imaging a due fotoni utilizzando il microscopio a due fotoni e un obiettivo di immersione dell'acqua 25x 1.0 di apertura numerica (NA) con motore piezo. Impostare la lunghezza d'onda dell'eccitazione su 900 nm. Cerca la corteccia e segui ogni arteriola penetrante e trova i suoi rami orizzontali (1 capillari^di ordine).
3. Immagini penetranti arteriole e loro capillari di ordine 1^st a riposo e durante la stimolazione del baffo. Vedere i parametri di imaging dettagliati nella sezione 5.
4. Contrassegnare le posizioni di 1^st ordine capillari con >5% vasodilazione durante la stimolazione del pad baffo sulla RFP 'mappa' (Figura 1C). Le località con vasodialamento <5% sono considerate al di fuori della regione della corteccia della canna del baffo.
   NOTA: Se si utilizzano topi di tipo selvaggio invece di topi rossi NG2D nell'esperimento, l'immagine GFP viene invece utilizzata come "mappa".

4. Inserimento della micropipetta di vetro

1. Preparare micro-pipette di vetro per sbuffare utilizzando un estore di pipette (Tabella dei materiali). Le micropipette in vetro hanno una resistenza di 3-3,5 M e una lunghezza di coniatura di 4,5-5 mm. Caricare una pipetta con una miscela di 1 mM ATP e 10 Alexa 594 al fine di visualizzare la punta della pipetta sotto la lampada epi-fluorescente e il microscopio a due fotoni.
2. Montare la micropipetta di vetro su un supporto per morsetti e collegarla a una pompa ad aria. Impostare la pressione di tenuta della pompa a 0 psi.
3. Utilizzando l'illuminazione epifluescente rossa, concentrarsi sulla punta della pipetta con l'obiettivo 5x. Collocare la micropipetta di vetro nell'aCSF sopra l'agarose. Regolare la pressione di tenuta della pompa d'aria a 0,2 psi. Una piccola nuvola rossa può essere osservata espellere dalla punta della pipetta nell'ACSF. Questo per evitare intasamenti durante l'inserimento della pipetta.
4. Scegliere una delle posizioni contrassegnate nella "mappa" della richiesta di offerta come destinazione. Spostare la punta della pipetta sul piano orizzontale del bordo del vetro di copertura con una distanza di 30 m, indicando approssimativamente verso la destinazione nel piano x-y.
5. Abbassare con attenzione la punta della pipetta nell'asse z sotto lo slittamento del vetro di copertura. Quindi iniziare a far avanzare la pipetta di vetro verso la destinazione fino a 500 m sopra la superficie del cervello. Spostare spesso la messa a fuoco tra il bordo del vetro di copertura, la punta della pipetta e la superficie del cervello, assicurandosi che ci sia abbastanza spazio libero per spostare la pipetta.
6. Impostare l'obiettivo su 25x. Ricentrare la punta della pipetta e far avanzare ulteriormente la punta della pipetta verso la destinazione sulla "mappa" RFP. Mantenere la punta della pipetta nello strato di agarose.
7. Quando la punta della pipetta è di 100 m sopra la superficie del cervello, passare alla microscopia a due fotoni. Concentrarsi su una posizione di destinazione in cui sbuffare. Scrivere le coordinate x, y (x₀, y₀) e la profondità sotto la superficie (z₀). Calcolare le coordinate del punto di inserimento sulla superficie del cervello (x_i, y_i) come segue:
   x_i - x₀ x z₀ / tan
   y_i : y₀
   dove è l'angolo tra il supporto della pipetta e il piano orizzontale.
8. Posizionare la punta della pipetta sulle coordinate (x_i, y_i) sulla superficie del cervello. Inserire delicatamente e lentamente la pipetta fino a raggiungere (x₀, y₀, z₀). Se un recipiente ha la direzione di un percorso di inserimento, ritirare la pipetta e ricalcolare altre coordinate e percorso di inserimento; o ruotare leggermente la piastra dello stage (come indicato nella figura 1A).
9. Impostare la pressione di tenuta della pompa a 0 psi e la pressione di espulsione a 10-15 psi. Puff ATP per 200-400 ms nella posizione di destinazione durante l'imaging a due fotoni. Regolare la pressione e la durata di sbuffare per ogni pipetta e nel tempo come spiegato nella sezione di discussione.

5. Immagini hyperstack a due fotoni

1. Eseguire esperimenti utilizzando il microscopio a due fotoni e un obiettivo di immersione dell'acqua 25 x 1,0 NA con motore piezo. Impostare la lunghezza d'onda dell'eccitazione su 900 nm. Filtrare la luce emessa per raccogliere la luce rossa da DsRed (periciti)/tetramethylrhodamine isothiocyanate-dextran (TRITC-dextran) colorando plasma sanguigno e luce verde da FITC-dextran (plasma sanguigno)/GCaMP6 (GFP, calcio astrocitico).
2. Produrre uno z-stack ad alta risoluzione nella posizione di interesse contenente un arteriolo penetrante, un capillare di 1^st ordine, un 2^nd ordine di cellule fluorescenti e possibilmente vicine (ad esempio, periciti, astrociti). Determinare il più possibile il volume di immagini iperimpilate di x-yz includendo la struttura 3D dei vasi sanguigni. L'altezza totale di ogni pila può variare da 30-50 m, mentre il piano x-y copre approssimativamente un'area di 60 m x 40 m.
3. Impostare la pila di immagini nel software di imaging in modo che sia composta da 8-10 piani con una distanza tra piani di 4-5 m. L'obiettivo piezo-motorio si ferma ad ogni livello sull'asse z per acquisire l'immagine di ogni piano. La frequenza di campionamento è di 1 s per pila e la risoluzione dei pixel nel piano x-y è 0,2-0,3 m (Figura2A). Una registrazione include normalmente 10 pile di immagini pre-puff e 150 pile di immagini post-puff.

6. Trattamento dei dati

1. Elaborare i dati utilizzando software analitico personalizzato. Appiattire ogni pila di immagini in un'immagine in base alla proiezione di intensità massima (Figura 2B). Disegnare una regione di interesse rettangolare (ROI) con una larghezza di 3 m perpendicolarmente attraverso il recipiente di interesse (Figura 2C).
2. Per ridurre al minimo l'interferenza dalle ombre dei globuli rossi e dalle vibrazioni minori della corteccia, calcolare la media del ROI rettangolare proiettandolo in una linea, che rappresenta quindi il profilo medio del segmento del vaso. Eseguire questa operazione per ogni immagine di intensità massima.
3. Tracciare le linee di profilo come immagine 2D con l'asse x che rappresenta le immagini di massima intensità in ordine cronologico (Figura2D, pannello superiore). Utilizzare un algoritmo di contorno attivo (segmentazione Chan-Vese) per trovare i bordi della nave^8,9 (indicata da curve rosse; Figura 2 D, pannello superiore).
4. Calcolare il percorso temporale del diametro cambia come la differenza tra i bordi del vaso sanguigno (distanza verticale tra le curve rosse superiore e inferiore in Figura 2D, pannello inferiore). Normalizza modifiche di diametro alla linea di base del diametro pre-puffing e le curve di traccia del diametro cambiano nel tempo. Eseguire questa operazione per ogni ROI (Figura 2E).
5. L'ampiezza di risposta del recipiente è definita come l'ampiezza di picco più alta / più bassa dopo lo sbuffamento. La latenza di risposta è definita come la latenza dell'ampiezza half-max (Figura 2G). Tracciare manualmente la struttura vascolare scheletrata posizionando i nodi lungo i vasi (Figura 2F) e misurando la distanza geografica tra ogni ROI e l'arteriosa penetrante. Calcolare la velocità CVR dividendo le distanze per le differenze di latenza.

7. Iniezione vettoriale virale

1. Per studiare simultaneamente le risposte astrocitiche al calcio, iniettare un volume di 0,6 -L vettore virale (p-ac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f, Addgene) nella corteccia somatosensoriale dei topi rossi, seguendo la procedura standard di iniezione di vettori virali stereotassici ¹⁰.
2. Dopo tre settimane, gli astrociti nella corteccia somatosensoriale del topo esprimono l'indicatore del calcio geneticamente codificato, GCaMP6f. Seguire la procedura chirurgica di cui sopra e l'imaging a due fotoni per i topi. Per distinguere tra astrociti e lumina della nave, TRITC-dextran invece di FITC-dextran viene utilizzato per macchiare la lumina del vaso.

Risultati

Una volta completato l'intervento, i topi sono stati trasportati al microscopio a due fotoni (Figura1A). Una micropipetta di vetro contenente 1 mM ATP è stata inserita in prossimità del vaso sanguigno di destinazione nella posizione di destinazione (Figura 1B).

Abbiamo eseguito l'imaging iperstack dando un soffio di 1 mM ATP (Figura 2A, suppleme...

Discussione

Una sfida per gli studi vascolari è la misurazione precisa dei diametri dei vasi. Il metodo che qui descriviamo ha usato un obiettivo di piezo motorizzato per creare immagini iperimpilate veloci e ripetitive mediante microscopia a due fotoni. In primo luogo, questo metodo consente ripetuti esami dell'arteriola penetrante, 1^st ordine e 2^nd ordine capillari senza perdita di messa a fuoco e ha portato alla scoperta di risposte vascolari lentamente condotte nei capillari in vivo. In secondo luogo, in c...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma–Aldrich	A6138	Apply upon exposed cortex for protection
Alexa 594	Life Technologies	A-10438	Stain puffing compound to red fluorescent color
ATP	Sigma-Aldrich	A9187	Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound
Cyanoacrylate glue and activator	Loctite	Adhesives and SF7452	Glue for metal piece and coverglass
Eye lubricant	Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark		Keep the mouse eyes moisterized
FITC-dextran	Sigma-Aldrich	FD500S	Blood serum dye, green fluorescent color
NG2DsRed mice	Jackson Laboratory	8241	These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter
pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f	Addgene	52924-AAV5	Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators
TRITC-dextran	Sigma-Aldrich	52194	Blood serum dye, red fluorescent color
List of Equipments
Air pump	WPI	PV830	Give air pressure to pipette puffing
Blood gas analyzer	Radiometer	ABL 700	Measure levels of blood gases
Blood pressure monitor	World Precision Instruments	BP-1	Monitor aterial blood pressure
Body temperature controller	CWE	Model TC-1000	Keep the mouse body temperature in physiological range
Capnograph	Harvard Apparatus	Type 340	Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse
Electrical stimulator	A.M.P.I.	ISO-flex	Apply whisker pad stimulation
Mechanical ventilator	Harvard Apparatus	D-79232	Mechanically ventilate the mouse in physiological range
Micropipette puller	Sutter Instrument	P-97
Two-photon microscope	Femtonics Ltd	Femto3D-RC
List of Surgical Instruments
Anatomical tweezer	Lawton	09-0007
Angled and balanced tweezer	S&T AG	00595 FRAS-18 RM-8
Iris scissor	Lawton	05-1450
Micro vascular clamp	S&T AG	462
Mouse vascular catheters	Verutech	100828