В Vivo Трехмерная Двухфотонной Микроскопии для изучения проведенных сосудистых реакций по местному выбросу АТФ с помощью стеклянной микро-пипетки

Резюме

Мы представляем оптимизированную локальную процедуру выброса с использованием стеклянной микропипетты и быстрого метода визуализации двухфотонного гиперстога, который позволяет точно измерять изменения диаметра капилляров и исследует его регулирование в трех измерениях.

Аннотация

Поддержание нормальной функции мозга требует достаточного и эффективного снабжения кислородом и питанием сложной сетью сосудов. Однако регуляция мозгового кровотока (CBF) понимается неполно, особенно на уровне капилляров. Двухфотоническая микроскопия является мощным инструментом, широко используемым для изучения CBF и его регулирования. В настоящее время эта область ограничена отсутствием в ививо двухфотонных микроскопических исследований, исследующих (1) cbF ответы в трех измерениях, (2) провел сосудистые реакции, и (3) локализованных вмешательств в сосудистой сети. Здесь мы описываем метод 3D in vivo с использованием двухфотонной микроскопии для изучения проведенных сосудистых реакций, вызванных локальным выбросом АТФ со стеклянной микропипеткой. Наш метод использует быструю и повторяющиеся гиперстек двухфотонные изображения, обеспечивающие точные измерения диаметра по максимальной интенсивности проекции полученных изображений. Кроме того, мы показываем, что этот метод также может быть использован для изучения 3D астроцитарных реакций кальция. Мы также обсуждаем преимущества и ограничения вставки стеклянной микропипетты и двухфотонного гиперстакта.

Введение

Мозг имеет высокий уровень потребления энергии. Около 20% кислорода и 25% глюкозы, потребляемой человеческим телом, предназначены для работы мозга, в то время как мозг занимает только 2% от общей массы тела. Поддержание нормальной функции мозга требует достаточного и эффективного снабжения кислородом и питания кровотоком в сложной сети сосудов. Местная мозговая активность и мозговой кровоток (CBF) надежно связаны, в зависимости от функциональных свойств нейронов, астроцитов, перицитов, гладких мышечных клеток (СМК) и эндотелиальных клеток (ЭК)¹. В последнее время первые несколько заказов капилляров, разветвляющихсяиз проникающих артериол, стали «горячей точкой» 2, показывая активную регуляцию капиллярного кровотока. Медленно проводимых сосудистой реакции (CVR) был обнаружен в этой "горячей точке" в мыши соматосенсорной коры во время как стимуляции усов и местного выброса (пыхтя) АТФ со стеклянной микро-пипеткой³.

Хотя in vivo изображений с помощью двухфотонной лазерной сканирующей флуоресцентной микроскопии широко используется для изучения нервно-сосудистых реакций в коре головного мозга, большинство исследований измеряли диаметры кровеносных сосудов и исследовали их регуляцию в двухмерная (2D) плоскость x-y. Проблемы: Во-первых, церебральные кровеносные сосуды и их охватывающие астроциты, перициты и СМК строят ветви в трех измерениях (3D). Поэтому очень важно изучить их взаимодействия в 3D. Во-вторых, даже небольшое количество дрейфа в фокусе повлияет на точное измерение как диаметров судов, так и клеточных флуоресцентных сигналов. Наконец, ССЗ быстро и далеко идущие в трех измерениях. 3D-сканирование объема оптимально для обнаружения СВРс и открытия их механизмов. Мы внедрили цель пьезо мотора в двухфотонный микроскоп для изучения соматосенсорной коры мыши in vivo, что позволило точно измерить диаметр максимальной интенсивности проекций полученных изображений.

Стеклянные микро-пипетки часто используются для исследования мозга in vivo, например, для навалом загрузки органических красителей⁴, записи EEGs⁵ и для зажима патча⁶. Тем не менее, ограничения остаются. Как правило, кончик стеклянной микро-пипетки неточно помещается, или микро-пипетка не используется для местных вмешательств. Здесь мы оптимизировали процедуру вставки микропипетты и локального выброса.

Кроме того, сочетание трехфотонной микроскопии и генетически закодированных флуоресцентных индикаторов дает беспрецедентную возможность исследовать нервно-сосудистые связи в 3D сфере. В этом исследовании мы воспользовались этим и ввели вирусные векторы, несущие астроцитные специфические генетически закодированные индикаторы кальция в соматосенсорную кору мыши. Астроциты, а также диаметры судов были изображены одновременно путем объединения различных флуоресцентных маркеров.

В целом, мы представляем оптимизированный метод локального выброса (пыхтя) стеклянным микропипеткой и быстрой двухфотонной гиперстековой визуализацией, которая позволяет точно измерять изменения диаметра капилляров. Кроме того, наш метод предоставляет новый инструмент для одновременного изучения 3D-профилей ответов Ca^{2 в} ответах астроцитов и сосудистого диаметра.

протокол

Все процедуры, касающиеся животных, были одобрены Датским национальным комитетом по этике в соответствии с руководящими принципами, изложенными в Конвенции Европейского совета по защите животных-позвоночных, используемых в экспериментальных и других научных целях и в соответствии с руководящими принципами ARRIVE. Это терминальная процедура с мышами усыплены до анестезии восстановления.

1. Предоперационная подготовка

1. Очистите хирургический стол и всю прилегающую территорию с 70% этанола. Тщательно очистить и высушить хирургические инструменты перед операцией.
2. Анестезия NG2DsRed мышь (Tg (Cspg4-DsRed.T1)1Akik/J; оба пола; 4-8 месяцев; 4-8 месяцев) путем перитонеальной инъекции кетамина и ксилазина (60 мг/кг 10 мг/кг), растворенных в стерилизованной воде, рН 7,4. Вводят дополнительные дозы кетамина (30 мг/кг) каждые 25 мин до завершения хирургической процедуры. Регулярно проверяйте рефлексы хвоста и ног, чтобы проверить глубину анестезии.
3. Вводят солин подкожно в четырех различных местах на задней части мыши в общей сумме 1 мл для предотвращения обезвоживания во время эксперимента. Чтобы защитить глаза от высыхания, нанесите смазку для глаз. Поддерживайте температуру тела при температуре 37 градусов по Цельсию с помощью ректального датчика температуры и нагревательного одеяла.

2. Хирургическая процедура

1. Трахеотомия
   1. Поместите мышь на спину. Вводят 0,04 мл 0,5% лидокаина подкожно под запланированным разрезом и ждите 2 мин. Сделайте 10-мм разрез над грудной костью (манубриум). Разделите подчелюстные железы и стернотиреоидные мышцы, а затем разоблачить трахею.
   2. Сделайте трахеостомию между двумя кольцами трахеи ножницами. Вставьте в трахею небольшую металлическую трубку длиной 16,2 мм и диаметром 1 мм. Подключите трубку к механическому вентилятору и капрофуму для мониторинга конечных CO₂ (рисунок1А).
2. Вставка катетера
   1. Вводят 0,5% лидокаина (0,04 мл) подкожно под запланированным разрезом и ждите 2 мин.
   2. Используя тонкие наконечникщины мягко отделить артерию от вены. Остановите поток крови вверх по течению с микрососудистым зажимом. Сужение кровотока вниз по течению с 10-0 нейлоновый шов ligating обоих кровеносных сосудов.
   3. Используйте микро-рассекающие ножницы, чтобы сделать небольшой разрез в артерии и вены. Вставьте пластиковые катетеры в оба кровеносных сосуда. Защищайте катетеры, затягивая швы (8-0 или 10-0 нейлоновых швов, зависящих от размера судна) без ущерба для люменов катетера. Удалить микрососудистый зажим и закрыть кожу.
   4. Мониторинг артериального давления через артериальный катетер. Измерение уровня газов крови в образцах артериальной крови (50 л) до ипосле каждого эксперимента (нормальные значения: PO 2, 90-120 мм рт. ст.; pCO_2,35-40 мм рт.; рН, 7,25-7,45) с использованием анализатора газа крови. Используйте катетер вены для инфузии флуоресцеина и анестезии.
3. Краниотомия
   1. Сбрить мех с головы мыши между ушами. Вводят 0,04 мл 0,5% лидокаина подкожно под запланированным разрезом и ждите 2 мин.
   2. Протрите череп с помощью 10% раствора железа хлорида, чтобы удалить периостеум. Тщательно промыть череп сольным раствором. Клей металлической головной бар к черепу с cyanoacrylate клей и активатор(Рисунок 1A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Металлическая головная прутья имеет длину 75 мм и ширину 13,5 мм, а в центре - круглое отверстие диаметром 5 мм.
   3. Просверлить краниотомии диаметром 4 мм, по центру на 0,5 мм позади и 3 мм справа от брегмы над правой сенсорной головной коры ствола. Удалите дюру с тонкой наконечником расширителя сосуда.
   4. Обложка открытой коры с 0,75% агарозный гель, растворенный в искусственной спинномозговой жидкости (aCSF; рН 7,4) и охлажденных до 35 градусов по Цельсию. Обложка 80-90% краниотомии со стеклянным покрытием под углом 10-15 "к металлической головке бар (Рисунок 1B), что позволяет вставки и размещения стекла микро-пипетка.
   5. Чтобы свести к минимуму пульсацию мозга, приклейте два угла стеклянного покрывала на металлическую головную штангу с помощью клея цианоакрилата и активатора. Применить активатор тщательно, чтобы предотвратить попадание на открытый мозг. Промыть склеенное стекло крышкой тщательно с сольным после этого.
4. Выполните вставку зонда стимуляции усов. Вставьте набор изготовленных на заказ биполярных электродов (длина 8 мм и толщина 0,25 мм) в левую сторону лица, чтобы стимулировать рамус инфраорбиталис тройничного нерва контралатерального к краниотомии. Расположите катод близко к перерыву infraorbitalis, и вставьте анод в маститационные мышцы⁷. Выполните стимуляцию с электрическим стимулятором при интенсивности 1,5 мА на 1 мс в поездах по 2 Гц при 2 Гц.
5. По завершении операции, ввести болюс 0,05 мл флуоресцеина изотиоциоцианат-декект (FITC-dextran, 4% ж / V, молекулярный вес (Mw) 50000) в бедренной вены для обозначения плазмы крови. Прекратите кетамин и переключите анестезию на непрерывный внутривенный вливание хлоралоза (17% w/v, конечная концентрация), смешанного с FITC-dextran (2% w/v, конечная концентрация) при 0,02 мл/10 г/ч. Подождите около получаса для стабилизации нового анестезируетическое состояние.
   ПРИМЕЧАНИЕ: И FITC-декстран, и хлоралоза растворяются в 0,9% сольнца.

3. Первый двухфотонный сеанс визуализации

1. Перенос мыши на стадию коммерческого двухфотонный микроскоп(Таблицаматериалов). Под красным флуоресцентным белком (RFP, Рисунок 1С) и зеленым флуоресцентным белком (GFP, Рисунок 1С)режимы эпифлуоресцентного освещения, сфотографировать открытые коры с 5x цели. Используйте изображение RFP в качестве «карты» для вставки стеклянной микропипетки в следующем сеансе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: GFP 'карта' используется для различения вен / вен от артерий / артериологов.
2. Выполните двухфотонную визуализацию с помощью двухфотонного микроскопа и 25x 1.0 численной диафрагмы (NA) цели погружения с пьезо мотором. Установите длину волн возбуждения до 900 нм. Поиск коры и следовать каждому проникающего артериола и найти его горизонтальные ветви (1-го порядка капилляров).
3. Изображение проникающих артериол и их^1-го порядка капилляров в покое и во время стимуляции усов площадку. Подробные параметры изображения смотрите в разделе 5.
4. Отметьте места проведения капилляров^1-го порядка с вазодилатацией усов во время стимуляции усов на карте RFP (рисунок1C). Места с вазодилатациями йlt;5% считаются за пределами области коры коры ствола усов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании диких мышей вместо NG2DsRed мышей в эксперименте, GFP изображение используется в качестве "карты" вместо.

4. Вставка стеклянной микропипетты

1. Подготовка стеклянных микро-пипетки для пыхтя с помощью пипетки тягач (Таблица материалов). Стеклянные микропипетты имеют сопротивление 3-3,5 МЗ и конусность длиной 4,5-5 мм. Загрузите пипетку со смесью 1 мМ АТФ и 10 ММ Alexa 594, чтобы визуализировать наконечник пипетки под эпифлуоресцентной лампой и двухфотонным микроскопом.
2. Установите стеклянный микропипетна на держатель зажима патча и соедините его с воздушным насосом. Установите давление насоса, удерживая до 0 пси.
3. Используя красное эпифлуоресцентное освещение, сосредоточьтесь на наконечнике пипетки с 5x целью. Поместите стеклянную микропипетку в aCSF над агарозой. Отрегулируйте удерживая давление воздушного насоса до 0.2 psi. Небольшое красное облако можно наблюдать выталкивание из пипетки наконечник в aCSF. Это необходимо для предотвращения засорения во время вставки пипетки.
4. Выберите одно из отмеченных мест в «карте» RFP в качестве пункта назначения. Переместите кончик пипетки к горизонтальной плоскости края стекла крышки с расстоянием 30 мкм, ориентируя к месту назначения в плоскости x-y.
5. Аккуратно опустите наконечник пипетки в z-оси под крышкой стекла скольжения. Затем начните продвижение стеклянной пипетки к месту назначения до 500 мкм над поверхностью мозга. Переключите фокус часто между краем стекла крышки, кончиком pipette и поверхностью мозга, убеждаясь что достаточно свободно космос для двигать пипетку.
6. Переключите цель на 25x. Re-центр пипетка отзыв и заранее пипетка отзыв дальше к месту назначения на RFP "карта". Держите кончик пипетки в слое агарозы.
7. Когда наконечник пипетки находится на 100 мкм над поверхностью мозга, переключите режим изображения на двухфотонную микроскопию. Сосредоточьтесь на целевом месте, в котором пыхтеть. Запишите его x, yкоординаты (x 0, y₀₎и его глубину ниже поверхности (z_0). Рассчитайте координаты точки вставкина поверхности мозга (x i, y_i)следующим образом:
   х_х х₀ q₀ / загар
   у_я й й₀
   где угол между держателем пипетки и горизонтальной плоскостью.
8. Расположите кончик пипеткик координатам (x i, y_i)на поверхности мозга. Аккуратно и медленно вставьте пипетку,пока она не достигнет (x 0, y_0,z_0). Если судно находится на пути пути вставки, снимите пипетку и пересчет других координат и пути вставки; или слегка повернуть сценическую пластину (как указано на рисунке 1А).
9. Установите давление насоса, удерживая на уровне 0 пси и давление выброса при 10-15 пси. Слоеный АТФ на 200-400 мс в целевом месте во время двухфотонной визуализации. Отрегулируйте давление и продолжительность пыхтя для каждого пипетки и с течением времени, как это объясняется в разделе обсуждения.

5. Гиперстек двухфотон изображения

1. Выполняйте эксперименты с использованием двухфотонного микроскопа и цели погружения в воду 25 x 1.0 NA с мотором пьезо. Установите длину волн возбуждения до 900 нм. Фильтр излучаемых света для сбора красного света от DsRed (перициты) / тетраметилродамина изотиоциозата-декестран (TRITC-dextran) окрашивания плазмы крови и зеленый свет от FITC-dextran (плазма крови) / GCaMP6 (GFP, астроцититарный).
2. Производите стек с высоким разрешением в месте интереса, содержащий проникающий артериол, капилляр^1-го порядка, капилляр^2-го порядка и, возможно, соседние флуоресцентные клетки (например, перициты, астроциты). Определите объем гиперстековой визуализации, включив в нее 3D-структуру кровеносных сосудов. Общая высота каждого стека может варьироваться от 30-50 мкм, в то время как плоскость x-y примерно покрывает площадь 60 мкм х 40 мкм.
3. Установите стек изображения в программном обеспечении для визуализации, который будет состоять из 8-10 плоскостей с межсамолетной дистанцией 4-5 мкм. Пьезо-моторная цель останавливается на каждом уровне на оси z, чтобы приобрести изображение каждой плоскости. Частота выборки составляет 1 с на стек и пиксельное разрешение в плоскости x-y 0.2-0.3 мкм(рисунок 2A). Одна запись обычно включает в себя 10 предварительно слоеных стеков изображений и 150 пост-слоеных стеков изображений.

6. Обработка данных

1. Обработка данных с помощью специального аналитического программного обеспечения. Сгладить каждое изображение стек в одно изображение по максимальной интенсивности проекции(Рисунок 2B). Нарисуйте прямоугольную область интереса (ROI) шириной 3 мкм перпендикулярно через судно интереса(рисунок 2C).
2. Чтобы свести к минимуму помехи от теней красных кровяных телец и от незначительных вибраций коры головного мозга, усреднейте прямоугольную рентабельность инвестиций, проецируя ее на одну линию, которая затем представляет средний профиль сегмента сосуда. Сделайте это для каждого изображения максимальной интенсивности.
3. Участок линий профиля как 2D-изображение с x-оси, представляющих максимальную интенсивность изображений в хронологическом порядке(Рисунок 2D, верхняя панель). Используйте алгоритм активного контура (сегментация Chan-Vese), чтобынайти края судна 8,⁹ (указано красными кривыми; Рисунок 2 D, верхняя панель).
4. Рассчитайте временной ход изменения диаметра по мере того, как разница между краями кровеносных сосудов (вертикальное расстояние между верхними и нижними красными кривыми на рисунке 2D,нижняя панель). Нормализация изменения диаметра до предварительнопывая диаметр базовых и сюжет кривых диаметра изменения с течением времени. Сделайте это для каждого рентабельности инвестиций(рисунок 2E).
5. Амплитуда реакции судна определяется как самая высокая/самая низкая пиковая амплитуда после пыхтя. Задержка реакции определяется как задержка полумаксимальной амплитуды(рисунок 2G). Вручную прослеживается скелетизированная сосудистая структура, помещая узлы вдоль сосудов(рисунок 2F)и измеряя географическое расстояние между каждой рентабельностью инвестиций и проникающим артериолем. Рассчитайте скорость CVR, разделив расстояния на различия в задержке.

7. Вирусная векторная инъекция

1. Для того, чтобы одновременно изучить астроцитарные реакции кальция, вводят объем вируса-вектора 0,6 л (p'ac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f, Addgene) в соматосенсорную кору мышей NG2DsRed, следуя стандартной процедуре стереотаксического вирусного впрыска ¹⁰.
2. Через три недели астроциты в мышечной соматосенсорной коре выражают генетически закодированный индикатор кальция GCaMP6f. Следуйте вышеупомянутой хирургической процедуре и двухфотонизображению для мышей. Чтобы различать астроциты и светило сосуда, TRITC-dextran вместо FITC-dextran используется для окрашивать сосуд наятиной в красный цвет.

Результаты

После завершения операции мышей перевезли в двухфотонный микроскоп(рисунок 1А). Стеклянная микропипетка, содержащая 1 мМ АТЦ, была вставлена в непосредственной близости от кровяного сосуда назначения в целевом месте(рисунок 1B).

Обсуждение

Одной из проблем для сосудистых исследований является точное измерение диаметров сосудов. Метод, который мы описываем здесь, использовал моторизованную цель пьезо, чтобы сделать быструю и повторяющееся гиперстек-изображение с помощью двухфотонной микроскопии. Во-первых, этот метод п?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma–Aldrich	A6138	Apply upon exposed cortex for protection
Alexa 594	Life Technologies	A-10438	Stain puffing compound to red fluorescent color
ATP	Sigma-Aldrich	A9187	Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound
Cyanoacrylate glue and activator	Loctite	Adhesives and SF7452	Glue for metal piece and coverglass
Eye lubricant	Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark		Keep the mouse eyes moisterized
FITC-dextran	Sigma-Aldrich	FD500S	Blood serum dye, green fluorescent color
NG2DsRed mice	Jackson Laboratory	8241	These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter
pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f	Addgene	52924-AAV5	Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators
TRITC-dextran	Sigma-Aldrich	52194	Blood serum dye, red fluorescent color
List of Equipments
Air pump	WPI	PV830	Give air pressure to pipette puffing
Blood gas analyzer	Radiometer	ABL 700	Measure levels of blood gases
Blood pressure monitor	World Precision Instruments	BP-1	Monitor aterial blood pressure
Body temperature controller	CWE	Model TC-1000	Keep the mouse body temperature in physiological range
Capnograph	Harvard Apparatus	Type 340	Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse
Electrical stimulator	A.M.P.I.	ISO-flex	Apply whisker pad stimulation
Mechanical ventilator	Harvard Apparatus	D-79232	Mechanically ventilate the mouse in physiological range
Micropipette puller	Sutter Instrument	P-97
Two-photon microscope	Femtonics Ltd	Femto3D-RC
List of Surgical Instruments
Anatomical tweezer	Lawton	09-0007
Angled and balanced tweezer	S&T AG	00595 FRAS-18 RM-8
Iris scissor	Lawton	05-1450
Micro vascular clamp	S&T AG	462
Mouse vascular catheters	Verutech	100828