Programmes de propagation des papillons captifs à risque pour améliorer les connaissances sur l’histoire de la vie et les techniques efficaces de conservation Ex Situ

Résumé

Ici, nous présentons des protocoles pour 1) la propagation en captivité de laboratoire du papillon bleu de Miami en voie de disparition fédérale (Cyclargus thomasi bethunebakeri), et 2) évaluant des informations de base d’histoire de la vie telles que le temps de développement immature et le nombre de stades larvaires. Les deux méthodes peuvent être adaptées pour une utilisation avec d’autres programmes de conservation ex situ.

Résumé

Il est important d’améliorer la connaissance des pratiques exemplaires ex situ pour les papillons à risque pour générer des résultats réussis dans le programme de conservation et de rétablissement. La recherche sur ces populations captives peut également fournir des données précieuses pour combler les principales lacunes de l’information sur le comportement, l’histoire de la vie et l’écologie du taxon cible. Nous décrivons un protocole pour la propagation captive du Cyclargus thomasi bethunebakeri en voie de disparition fédérale qui peut être utilisé comme modèle pour d’autres programmes ex situ de papillon à risque, particulièrement ceux dans la famille Lycaenidae. Nous fournissons en outre un protocole simple et simple pour l’enregistrement de diverses mesures de l’histoire de la vie qui peuvent être utiles pour informer les méthodologies ex situ ainsi que adapté pour les études de laboratoire d’autres lépidoptères.

Introduction

Une liste croissante d’études indique des déclins globaux répandus et graves dans les populations de papillons^1,2,3,4,5. Cela comprend la grande majorité des espèces en péril. Les programmes de conservation conçus pour atténuer ces déclins utilisent souvent un mélange de stratégies, y compris la surveillance des populations, la gestion et la restauration de l’habitat, la recherche scientifique, la propagation des captifs et la translocation de l’organisme⁶. Rien qu’aux États-Unis et dans ses territoires, un total de 30 taxons papillons sont répertoriés en vertu de la Endangered Species Act (ESA) comme étant soit menacées, soit en voie de disparition, dont 21 ont approuvé des projets ou des plans de rétablissement définitifs. Pour ces taxons, plus de la moitié des stratégies de récupération identifiées recommandent la propagation en captivité ou stipulent que la propagation en captivité doit être évaluée⁷. L’utilisation des efforts de conservation ex situ pour les papillons a considérablement augmenté ces dernières années^8,9, et a le potentiel d’être un outil essentiel pour aider les efforts de rétablissement¹⁰. De nombreuses institutions, organisations et agences participent actuellement aux efforts ex situ pour au moins 11 taxons de papillons inscrits à l’ESA (c.-à-d. Cyclargus thomasi bethunebakeri, Euphydryas editha quino, Euphydryas editha taylori, Heraclides aristodemus, Hesperia dacotae, Lycaeides melissa samuelis, Oarisma poweshiek, Pyrgus ruralis lagunae, et Speryeria zerene hippolyta) et plusieurs autres taxons à risque (par exemple, Callophrys irus, Euphydryas phaeton, Speyeria idalia, et Eumaeus atala)¹¹. Malgré le nombre d’efforts solides et fructueux, il subsiste un manque de communication régulière entre les programmes et entre les praticiens de la conservation qui impliquent l’échange d’idées, de données, de méthodologies efficaces et de résultats. Un tel partage des connaissances est essentiel, car il contribue à réduire au minimum le chevauchement des efforts, améliore les pratiques exemplaires globales et améliore l’impact sur la conservation. Peu de protocoles publiés de démarrage de tête, d’élevage, d’élevage ou d’élevage sont facilement disponibles pour les taxons de papillon à risque, et ceux qui manquent souvent de détails narratifs et/ou d’illustrations. Ceux-ci fournissent souvent la plupart du temps des détails sommaires avec des instructions étape par étape limitées et des images d’accompagnement, rendant la réplication difficile ou l’application à d’autres taxons difficile à évaluer^12,13,14,15. Bon nombre des protocoles disponibles sont limités d’une certaine manière: ils n’existent que dans la littérature grise, ou dans différents niveaux de détail, l’âge de publication, ou comme composantes dans les procédures du symposium, les rapports d’agence / bailleur de billets, ou des manuels internes^{16,17,18,19,20,21,22,23,24}.

Pour la plupart des programmes de conservation, la propagation des captifs est principalement menée pour soutenir la translocation de conservation, qui comprend la réintroduction, le renforcement (c.-à-d. l’augmentation) et l’introduction^25,26. Ces activités sont destinées à être mises en œuvre stratégiquement dans le cadre de la stratégie globale de rétablissement afin d’aider à prévenir l’extinction d’une espèce, d’une sous-espèce ou d’une population inscrites. Il convient de noter, cependant, qu’il s’agit de l’un des nombreux autres rôles potentiels que ces programmes ex situ peuvent servir. Il peut également s’agir de maintenir une population d’assurance (c.-à-d. de refuge), de sauvetage temporaire d’organismes, de soutenir la recherche et/ou la formation liées au rétablissement, et de promouvoir les efforts d’éducation et de sensibilisation liés à la conservation^27,28. Peu importe si les programmes ex situ ont un seul objectif défini ou un mélange de plusieurs, les praticiens de la conservation devraient maximiser les possibilités de collecte de données afin de combler les principales lacunes en matière d’information lorsque cela est possible. Cela est particulièrement important parce que la grande majorité des taxons à risque ont généralement été mal étudiés avant un déclin important de la population sauvage. Les connaissances améliorées obtenues sur divers aspects comportementaux, écologiques ou de l’histoire de la vie du taxon focal peuvent aider à faire progresser la conservation et la gestion efficaces des espèces²⁹.

Ici, nous décrivons en détail le protocole de propagation en captivité qui a été développé pour le papillon bleu de Miami en voie de disparition au niveau fédéral (Cyclargus thomasi bethunebakeri) (Figure supplémentaire 1) dans le cadre d’un programme plus vaste de conservation et de récupération. Dans ce cas, le programme de propagation en captivité joue trois rôles spécifiques identifiés : 1) une population d’assurance en cas de perte de la population sauvage existante, 2) une population de recherche conçue pour combler les lacunes identifiées en matière de connaissances écologiques et d’antécédents de vie qui peuvent aider à éclairer le rétablissement et/ou la gestion, et 3) produire des organismes viables pour la translocation de conservation dans des sites relevant de l’aire de répartition historique du taxon. Le protocole qui en a résulté a été bien examiné et prouvé, ayant été utilisé et amélioré pendant plus d’une décennie. Par conséquent, nous estimons que les techniques et les méthodologies décrites représentent un modèle viable qui peut être appliqué ou facilement adapté à d’autres programmes de papillons ex situ à risque, en particulier ceux impliquant Lycaenidae ou taxons connexes. Bien que nous ne suggérons pas que le protocole décrit soit supérieur à d’autres, nous estimons qu’il existe des possibilités d’appliquer certaines des méthodes de façon plus générale pour aider à améliorer la productivité, les soins ou l’efficacité. Cela est d’autant plus vrai que la plupart de notre reproduction se fait dans des conditions de laboratoire intérieur avec un espace limité, similaire aux programmes de conservation impliquant Euphydryas editha taylori et Speryeria zerene hippolyta^17,23. De nombreux autres protocoles utilisent souvent des matériaux en pot pour l’oviposition ou l’élevage larvaire, ce qui peut parfois conduire à une complexité accrue liée à la lutte contre les prédateurs, le contrôle de l’environnement (c.-à-d., l’humidité, la température), la surveillance du bétail, la collecte de données, les problèmes phytosanitaires, et l’espace pour n’en nommer que^{quelques-uns 21,22}. Enfin, le protocole présenté décrit les méthodes d’élevage en captivité. De nombreux autres programmes de conservation des papillons à risque impliquent le démarrage de la tête ou l’élevage en captivité avec les protocoles représentatifs reflétant ces différences. Bien que souvent mineur, nous estimons que cela contribue à élargir le bassin actuel d’information disponible pour d’autres programmes à examiner. C’est essentiel, parce que la plupart des programmes ex situ représentent des efforts pionniers pour aider à faciliter le rétablissement des taxons rares et souvent mal étudiés. Les protocoles disponibles peuvent servir d’excellent point de départ pour aider à fournir un aperçu précieux, réduire la duplication des efforts et promouvoir l’innovation. En raison de « la grande diversité interspécifique des comportements des papillons, des traits de l’histoire de la vie et des exigences écologiques combinés à des différences souvent marquées dans les installations du programme, les budgets, l’expertise des praticiens » et d’autres différences inhérentes, la dépendance à une seule méthodologie, même pour les taxons étroitement liés, est souvent limitante et injustifiée³⁰. La flexibilité d’affiner ou d’élaborer de nouveaux protocoles adaptés aux besoins de taxons ou de programmes spécifiques est essentielle à la réussite et devrait donc être soulignée. Nous décrivons en outre les techniques de laboratoire pour recueillir des mesures sur le développement de l’organisme dans des conditions captives, y compris le nombre d’étoiles larvaires, la durée des stades de développement individuels, le temps de développement total et la longueur des larvaires et des pupales. Ces techniques ont une large applicabilité pour les études d’histoire de la vie des lépidoptères qui peuvent être utilisées pour affiner les protocoles ex situ ou informer les données sur le terrain.

Protocole

1. Assurer la cour et l’accouplement adultes réussis

1. Après l’eclosion réussie, relâchez les papillons adultes viables dans une cage de vol sécurisée, sans rendez-vous et grillagée située dans une serre à température contrôlée(figure supplémentaire 2).
   REMARQUE : Les adultes peuvent être marqués sur la surface ventrale des ailes avec des marqueurs permanents d’encre si l’identification des individus spécifiques est désirée pour la séparation des lignes génétiques, l’origine de stock, ou pour la collecte spécifique de données liées à la longévité, au comportement, Etc.
   1. Bien que les dimensions exactes de la cage puissent varier, assurez-vous qu’il y a suffisamment d’espace pour accueillir le matériel végétal de nectar adéquat nécessaire pour soutenir la densité des papillons adultes logés et fournir de la place à un être humain pour se tenir librement debout et pivoter autour.
   2. Au-delà de la régulation de la température, assurez-vous que la serre est sécurisée afin qu’elle puisse fournir une deuxième couche de confinement ainsi qu’une protection contre les intempéries (p. ex. pluie abondante, vent).
2. Élever le matériel végétal de nectar en pot de sorte qu’il n’y ait pas plus de 30 cm d’espace du haut intérieur de la cage aux fleurs les plus fleurises(figure supplémentaire 2). Cela permet un accès optimal aux ressources de nectar disponibles, offre de nombreux perchoirs adultes et minimise l’activité de vol.
3. Placer une plante hôte en pot dans la cage de vol. Cela garantit que même si un couple accouplé est manqué tous les œufs résultants pondus peuvent être recueillis.
4. Fournir un flux d’air constant. Cela améliore l’activité de la cour et le succès de l’accouplement. Dans un serre, les souffleurs et les ventilateurs fixes de circulation de montage sont mieux employés pour aider à améliorer la ventilation et le mouvement d’air. Une ventilation portative plus petite, comme des ventilateurs de boîte ou de bureau, peut également être employée.
5. Maintenir la température interne de la serre entre 27 et 32 oC afin de favoriser une activité optimale des adultes et le succès de l’accouplement. La température à l’intérieur de la cage est surveillée à l’aide d’un thermomètre de surveillance de la mémoire traçable.
6. Brume zetez régulièrement la cage de vol grillagée (environ une fois tous les 2 h) avec de l’eau à l’aide d’une pompe à main, d’un pulvérisateur de réservoir en plastique ou d’un tuyau d’arrosage.
7. Recueillir délicatement les paires d’accouplement individuels de la cage de vol grillagée à l’aide d’une fiole de bouchon en plastique transparent de 50 dram(tableau des matériaux),en plaçant une à deux paires par flacon, et le transport vers une salle d’élevage ou un laboratoire intérieur(figure supplémentaire 3).

2. Maximiser la production d’œufs

1. Assembler la chambre d’oviposition.
   1. Prenez une tasse de papier blanc ordinaire de 12 onces et à l’aide d’un couteau utilitaire à lame, faites deux coupes horizontales de chaque côté de la tasse en face de l’autre. Chaque coupe doit être d’environ 1 cm au-dessous de la jante.
   2. Couper un seul coton-tige en deux et insérer l’extrémité de la tige de chacundans les deux coupes horizontales de chaque côté de la tasse en papier de sorte que la partie coton-tige s’étend d’environ 2 cm vers l’intérieur de la tasse.
   3. À l’aide d’un couteau utilitaire à lame, faire deux coupes « X » au fond de la tasse en papier. Chaque coupe diagonale doit être d’environ 1 cm de long.
   4. Prenez une tasse en plastique de 9 onces et remplissez le fond avec environ 2 cm d’eau du robinet.
   5. Placer une coupe fraîche, d’environ 15 cm de long, de la croissance de la plante hôte terminale dans la tasse en papier en insérant la tige à travers l’une des coupes « X » dans le fond. Poussez la tige à travers la coupe de sorte qu’environ 4-5 cm dépasse le fond.
   6. Placez la tasse en papier avec le matériau hôte dans la tasse en plastique, en veillant à ce que la tige de la plante est dans l’eau.
   7. Remplir une seringue sous-Q de 1 ml (0,45 mm x 16 mm) d’une boisson sportive aromatisée et saturer les deux cotons-tiges dans la tasse en papier. Ceux-ci agissent comme des fleurs artificielles.
      REMARQUE : La boisson sportive aromatisée au melon et au punch aux fruits offre la meilleure alternative au nectar.
   8. Une fois que chaque paire d’accouplement se sépare, placez 2-3 femelles gravid dans la configuration de tasse assemblée (c.-à-d., la chambre d’oviposition).
   9. Couvrir la tasse d’un fragment carré coupé de tulle noir (environ 15 cm x 15 cm) et le fixer avec un élastique autour du couvercle(figure supplémentaire 4). Le tulle noir offre la meilleure visibilité dans la tasse et l’identification facile de tous les œufs qui pourraient parfois être pondus sur le tulle.
2. Stimuler l’activité et l’oviposition des papillons adultes.
   1. Placez chaque chambre d’oviposition sur un banc de laboratoire ou une table d’environ 19 cm au-dessous d’une lampe de pince de 8,5 pouces (21,59 cm) avec un réflecteur en aluminium abritant une ampoule à incandescence de 40 W(figure supplémentaire 5).
      REMARQUE : La lumière incandescente fournit la chaleur radiante nécessaire pour stimuler l’activité et l’oviposition des adultes.
   2. Placez un thermomètre de surveillance de mémoire traçable à côté des lumières et exécutez le capteur de température de sorte qu’il repose sur une chambre d’oviposition située directement sous une lumière de pince.
      REMARQUE : La plage de température cible se situe entre 27,5 et 29 oC.
   3. Ajouter des feux de pince supplémentaires au besoin en fonction du nombre total de chambres ovipositionnelles déployées.
   4. Branchez les feux de pince dans une minuterie mécanique de 15 amp 24 h à l’intérieur avec deux prises (programmables en intervalles chronométrés de 30 min).
   5. Mettre la minuterie pour allumer la lumière de la pince pendant 30 min d’intervalles (c.-à-d., un cycle répétable de 30 min, 30 min de plus).
      REMARQUE : Ce cycle de lumière aide à maximiser la production d’oeufs en fournissant des périodes répétables d’illumination pour stimuler l’activité et l’oviposition de papillon adulte suivies de courtes périodes de repos foncées.
   6. Rafraîchissez les cotons-tiges dans chaque tasse avec une boisson sportive aromatisée via la seringue sous-Q et de la brume régulièrement avec de l’eau à l’aide d’une bouteille de pulvérisation en plastique environ tous les 2-3 h ou au besoin.
      REMARQUE : Cela fournit suffisamment de nectar artificiel et d’humidité pour permettre aux papillons de se nourrir librement comme vous le souhaitez. Il améliore ainsi la longévité des adultes et la productivité de l’oviposition dans des conditions de laboratoire où le matériel végétal vivant et en fleurs ne peut pas facilement être utilisé.
   7. Surveillez régulièrement les tasses et remplacez l’usine hôte par des boutures fraîches au besoin.
   8. Lorsque les œufs commencent à éclore ou que la densité des œufs devient élevée, déplacez la femelle vers une nouvelle tasse avec un hôte frais et commencez le protocole des larves avec des nouveau-nés.

3. Soins et entretien larvaires

1. Répétez les étapes 2.3-2.6 pour assembler des tasses pour les larves.
2. Lorsque les œufs commencent à éclore, déplacez le matériel végétal hôte avec des œufs et des larves de nouveau-nés dans une tasse nouvellement assemblée, en plaçant la tige à travers le deuxième « X » dans le fond en veillant à ce que la tige de la plante soit dans l’eau et que les feuilles touchent la coupe de l’hôte frais adjacente.
3. Lorsque les larves sont jeunes (instar de nouveau-né-2), vérifiez quotidiennement les tasses larvaires pour décevoir la fraîcheur du matériel végétal hôte et la présence de moisissures ou de frass excessifs.
   REMARQUE : L’enlèvement quotidien du matériel hôte n’est pas recommandé lorsque les larves sont jeunes, car cela peut entraîner des blessures à l’organisme en raison de la manipulation et/ou du gaspillage inutile de matériel hôte frais.
4. Si le matériel hôte est flétri ou en mauvais état, placez une autre coupe de matériel hôte frais dans une tasse de sorte qu’il touche le feuillage existant et permettez aux larves de se déplacer vers le nouvel hôte par elles-mêmes.
5. Une fois que les larves atteignent la^3e étoile, remplacez la tasse en papier et ajoutez du matériel hôte frais tous les jours.
6. Utilisez un petit pinceau à l’aquarelle à poil de chameau pour déplacer doucement les larves de l’ancien matériau hôte ou de la surface de la tasse vers le matériau hôte frais dans la nouvelle tasse.
7. Placez le vieux matériau hôte dans un contenant rectangulaire vide de stockage d’aliments.
8. Répétez les étapes 3.5-3.7 par jour et jusqu’à ce que toutes les tasses avec des larves aient été traitées.
9. Une fois terminé, ajouter une petite quantité de matériel hôte frais sur le dessus des déchets végétaux dans le contenant de stockage des aliments et placer lâchement un couvercle sur le dessus.
   REMARQUE : Cela sert de garantie au cas où les larves seraient négligées pendant le traitement quotidien parce qu’elles rampent sur le nouveau matériel hôte au-dessus des déchets végétaux et peuvent être enlevées le lendemain.
10. Maintenir les tasses sous la température de laboratoire entre 25 et 28 oC pour une activité et un développement larvaires optimaux(figure supplémentaire 6).
    REMARQUE : Pour atteindre des températures d’élevage optimales dans des conditions intérieures, il est souvent nécessaire de placer des tasses sous des feux de pince avec des réflecteurs en aluminium abritant 40 ampoules à incandescence W. Les températures peuvent ensuite être surveillées activement à l’aide d’un thermomètre de surveillance de la mémoire traçable et de la hauteur de lumière ajustée pour atteindre des conditions d’élevage optimales.

4. Construction de la chambre de pupaison

1. Couper un rouleau de papier ondulé à une seule face en carrés de 3,8 cm x 3,8 cm de taille égale.
2. Placer un carré dans une tasse de portion en plastique transparent de 2 onces.
3. Placez la tasse sur un plateau de tasse en plastique transparent(figure supplémentaire 7).

5. Préparation des larves pour la pupaison

1. Identifier les larves matures prêtes à se pupaison pendant le traitement quotidien des colonies.
   REMARQUE : De telles larves tourneront un brun verdâtre terne uniforme, perdront leurs chevrons et errent souvent hors de l’hôte.
2. Retirez délicatement chaque larve mature à l’aide d’un petit pinceau à l’aquarelle de chameau ou de forceps et placez-en une dans chaque chambre de pupaison.
3. Accrochez fermement le couvercle en plastique transparent sur la chambre de pupaison.
4. Répéter les étapes 5.1-5.3 jusqu’à ce que toutes les larves prêtes à se puper aient été transférées dans des chambres de pupaison, ajoutant de nouveaux plateaux en plastique au besoin (Figure supplémentaire 8).

6. Maintenir les pupae

1. Pour chaque plateau de chambres de pupaison, enregistrez la date de la première pupaison et toute autre information pertinente nécessaire (c.-à-d. lignée génétique, essai expérimental, etc.).
2. Organiser les plateaux par date et place dans un endroit sûr au sein du laboratoire (Figure supplémentaire 8).
3. Surveillez les plateaux tous les jours pour l’éclosion adulte.
   REMARQUE : Les conditions de laboratoire telles que la température influenceront fortement le temps de développement.
4. Avant l’éclosion adulte (généralement dans les 10 jours suivant la première pupaison), retirez les couvercles des chambres de pupaison individuelles et placez le plateau dans une cage d’élevage de 34,29 cm x 34,29 cm x 60,96 cm à maille pliable(figure supplémentaire 9).
   REMARQUE : Les pupae solidement attachées dans les rainures des carrés en papier ondulé facilitent l’eclosion adulte réussie(figure supplémentaire 10).
5. Répétez le protocole entier à partir de l’étape 1.1 pour la génération captive suivante.

7. Évaluer le temps de développement des stades immatures et le nombre de stades

1. Placer une seule larve sous un microscope à disséquer. Utilisez un petit pinceau à l’aquarelle à poil de chameau pour déplacer soigneusement et isoler les larves afin d’éviter les blessures à l’organisme.
2. Trempez un seul cheveu du pinceau dans de la peinture lumineuse non toxique(Table of Materials),et mettez soigneusement une petite goutte de peinture sur le dos (dorsum) de la larve. Utilisez une couleur de peinture qui se distingue de la couleur de fond et la couleur de motif de la larve (Figure supplémentaire 11). Assurez-vous d’éviter de placer de la peinture sur la tête de la larve.
3. Une fois que la peinture sèche (environ 30 s environ), placez chaque larve individuelle dans sa propre tasse de portion en plastique transparent de 2 onces contenant environ 1 ou 3 petites feuilles de matériel hôte terminal frais et écrivez un identifiant unique sur la tasse et le couvercle(figure supplémentaire 12).
4. Vérifiez soigneusement chaque larve tous les jours. Retirer les feuilles et les mettre sur la surface blanche. Inspecter la tasse, le couvercle transparent et examiner les feuilles au microscope disséquant la présence d’exuvions larvaires (peau moulée) et/ou de capsules de tête.
5. Si une exuvia larvaire est trouvée, retirez-la de la tasse et placez-la dans un tube de microcentrifuge étiqueté avec le numéro de tasse correspondant et la date (voir les étapes 8.1-8.6. ci-dessous).
6. Repeindre les larves après chaque mue et enregistrer les dattes de mue.
7. Mesurer la longueur totale du corps (de la tête au dernier segment abdominal) de chaque larve quotidiennement à l’aide d’étriers numériques. Prenez trois mesures et enregistrez la moyenne des trois, ainsi que la date et l’heure. Pour les larves précoces d’étoiles, une loupe ou une lunette de dissection devraient être utilisées lors de la mesure afin d’assurer des mesures précises.
8. Remettre la larve dans sa tasse de portion en plastique correspondante.
9. Ajouter du matériel hôte frais au besoin et enlever tous les frass et les vieux débris de l’hôte. Si la moisissure se trouve dans la tasse, disposer et utiliser une nouvelle tasse. Écrivez le numéro d’identification unique correct sur la nouvelle tasse.
10. Répétez les étapes 7.5-7.9 jusqu’à ce que toutes les larves atteignent leur étoile finale et commencent le stade préuptif. Lorsque les larves cessent de se nourrir, tournez une couleur verdâtre-brun terne uniforme, perdez leurs chevrons, et errent souvent hors de l’hôte, au minimum les déranger.
11. Placez un petit morceau de papier ondulé dans la tasse (voir l’étape 4.1).
12. Une fois que chaque larve a complètement pâturé, mesurez sa longueur totale comme à l’étape 7.8 ci-dessus et enregistrez la date de la pupaison. Ce sera la dernière mue de chaque individu.
13. Vérifiez les pupae quotidiennes et enregistrez la date d’éclosion et le sexe de chaque papillon adulte résultant.
14. Mesurer la longueur de l’accord d’aile de chaque papillon à l’aide d’étriers numériques. Les papillons peuvent être tenus doucement avec des forceps pour la mesure. Si le papillon est trop actif pour être facilement mesuré, placez-le temporairement dans un réfrigérateur pendant 30 s ou moins et réessayez.

8. Collecte des exuvés larvaires

1. Lorsqu’une exuvia larvaire est observée, remplissez un tube de microcentrifuge avec 0,2 l de glycérine. Étiquetez le dessus du couvercle et le côté avec le numéro de larve, la date de la mue et la capsule de tête (H.C.).
   REMARQUE : Les larves de certaines larves de lépidoptères consomment régulièrement leur exuviae, mais la capsule de la tête devrait rester.
2. Placez l’exuvia larvaire et la capsule de tête associée dans un couvercle de tasse en plastique transparent et mettez quelques gouttes d’éthanol dedans.
3. Examinez l’exuvia larvaire sous un microscope disséquant en la plaçant dans un couvercle de tasse de portion en plastique transparent et en y mettant quelques gouttes d’éthanol. Si la capsule de tête larvaire est déjà séparée de l’exuvia, placez une goutte de glycérine sur la pointe des forceps entomologiques pointus et touchez doucement la capsule de tête à la glycérine. Placez la capsule de tête dans le tube de microcentrifuge associé.
4. Si la capsule de tête est toujours attachée à l’exuvia larvaire, utilisez des forceps pointus et une goupille d’insecte pour séparer la capsule de tête de l’exuvia larvaire.
5. Une fois qu’il est séparé, utilisez la technique de la glycérine pour ramasser la capsule de tête. S’il y a trop d’éthanol, vous pouvez utiliser une petite serviette en papier pour en enlever certains, mais attention à ne pas enlever accidentellement la capsule de tête.
6. Placer la capsule de tête dans une fiole remplie de glycérine étiquetée et fermer le couvercle hermétiquement.

Résultats

Au cours de deux initiatives de conservation distinctes visant le rétablissement de Cyclargus thomasi bethunebakeri de février 2003 à décembre 2010 et de novembre 2016 à aujourd’hui, ce protocole a été utilisé pour produire avec succès un excédent de 51 052 organismes viables. D’après l’aperçu sommaire d’un an de la productivité globale de la population captive de juin 2018 à juin 2019, un total de 10 166 organismes viables ont été produits, ce qui représente 782,00 à 118,93 organismes par mois sur 13 générations. De même, la production totale moyenne d’œufs par femelle dans des conditions de laboratoire était de 114,00 à 26,12 (n 12)³¹. La productivité substantielle résultante d’organisme classe ce programme parmi les plus grands efforts ex situ tels aux Etats-Unis, avec ceux d’Euphydryas editha taylori, Speyeria zerene hippolyta, et Lycaeides melissa samuelis²⁴. Une partie de cette productivité peut être attribuée au fait que le papillon est continuellement couvé, produisant une génération environ toutes les 4-6 semaines en captivité. La majorité des autres programmes de sélection de conservation impliquent des taxons qui sont univoltine ou bivoltine. Néanmoins, même pour les programmes impliquant des taxons extrêmement féconds comme Speyeria spp., le nombre total d’organismes viables produits pour la translocation de conservation sur une base annuelle dépasse rarement quelques milliers³². Par conséquent, notre population captive a permis une recherche dirigée et une collecte approfondie de données sur de nombreuses lacunes clés en matière de données, ce qui est important pour améliorer les meilleures pratiques d’élevage et d’élevage en laboratoire (figure 1) et pour éclairer les décisions de rétablissement et de gestion.

Le temps de développement total moyen entre la larve de nouveau-né et l’adulte était de 28,63 jours(tableau 1). La majorité des larves avaient quatre mues (Figure 2, Figure 3), bien que deux avaient cinq mues, et une avait six mues. La longueur moyenne globale de toutes les étoiles larvaires était de 5,97 mm, et les larves étaient les plus grandes aux quatrième set et prépaupales (tableau 1). Si l’on n’inclut que les variables ayant plus de 30 observations, le temps le plus court a été passé dans les premières étapes instar et préuppelle, et le plus long a été passé comme des chiots (tableau 1, Figure 2). Les femelles se sont généralement développées plus rapidement à tous les stades immatures que les mâles, bien que cela n’ait pas eu d’effet significatif (p - 0,625). Des analyses statistiques ont été effectuées à l’aide de la version 1.1.463 de RStudio (R Core Team 2016)³³. La longueur moyenne de l’accord d’aile adulte était de 12,64 mm(tableau 2), et il y avait une différence significative entre les sexes (p - 0,047). Le t-test à double face a été exécuté pour évaluer la différence d’accord d’aile entre les sexes. Le modèle de régression linéaire et la régression progressive pour la durée moyenne de chaque étape de vie ont montré que la longueur du pupal était le meilleur prédicteur pour la longueur de l’accord d’aile adulte (Tableau 3, Tableau 4). Les modèles de régression pour le temps de développement ont montré que le nombre de jours passés dans les deuxième et quatrième instars et le nombre total de jours étaient les meilleurs prédicteurs pour la longueur de l’accord d’aile adulte, mais seulement le nombre de jours dans la quatrième instar était significatif (tableau 5, tableau 6). Étant donné que les variables étaient continues, deux modèles linéaires de régression ont été exécutés pour le temps de développement de chaque étape de vie, ainsi que la longueur de chaque étape de vie, avec la longueur adulte d’accord d’aile comme variable dépendante. Des régressions progressives ont été courues sur les deux modèles de régression afin de déterminer les meilleurs prédicteurs de la longueur de l’accord d’aile adulte.

Figure supplémentaire 1 : Spécimens épinglés de Cyclargus thomasi bethunebackeriadulte. (A) Mâle adulte, dorsal (gauche), ventral (droite). (B) Femelle adulte, dorsale (gauche), ventrale (droite). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure supplémentaire 2 : Cage de vol grillée logée dans une serre à température contrôlée. (A) L’intérieur montre des plantes de nectar adultes en pot et une seule plante hôte larvaire en pot. (B) Les étagères métalliques aident à élever les plantes de nectar en pot de sorte qu’il n’y ait pas plus de 30 cm d’espace du haut intérieur de la cage aux fleurs les plus fleuries les plus élevées. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure supplémentaire 3 : Procédure de collecte des couples d’adultes en copule. (A) Couple d’accouplement de Cyclargus thomasi bethunebakeri adulte à l’intérieur de la cage de vol grillagée (femelle, droite et mâle, gauche). (B) Couples d’accouplement recueillis dans la cage de vol dans des flacons de capuchon et amenés dans le laboratoire. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure supplémentaire 4 : Procédure d’assemblage de la chambre d’oviposition. (A) Système de deux tasses avec matériau hôte terminal et coton tampons. (B) Une seringue sous-Q de 1 ml (0,45 mm x 16 mm) avec boisson sportive aromatisée saturant les cotons-tiges dans la tasse en papier. (C) Coupes abritant des femelles gravid fixées avec du tulle noir. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure supplémentaire 5 : Configuration en laboratoire pour maximiser la production d’œufs. (A) Chambres d’oviposition placées sur un banc de laboratoire sous une lampe de pince avec une ampoule à incandescence de 40 W. (B) Un thermomètre de surveillance de la mémoire traçable est placé à côté des lumières avec le capteur de température reposant sur une chambre d’oviposition située directement sous une lumière de pince. (C) Une seringue de 1 ml sous-Q et une petite boisson sportive aromatisée à la tenue de bécher placée à côté des chambres d’oviposition pour faciliter le rafraîchissement des cotons-tiges régulièrement tout au long de la journée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure supplémentaire 6 : Configuration en laboratoire pour les soins et l’entretien des voies larvaires. (A) Système de deux tasses contenant chacun du matériel hôte terminal frais et des larves. (B) La température dans les tasses est maintenue entre 25 et 28 oC pour une activité et un développement larvaires optimaux par des feux de pince supérieurs avec des ampoules à incandescence de 40 W. (C) Un thermomètre de surveillance de la mémoire traçable avec le capteur de température placé directement dans une tasse est utilisé pour surveiller la température. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure supplémentaire 7 : Chambres de pupaison préparées. (A) Coupes individuelles en plastique de portion logées sur les plateaux en plastique clairs de tasse. (B) Un carré de papier ondulé est placé dans chaque tasse de portion en plastique. (C) Une seule larve mature sera placée dans chaque tasse de portion en plastique préparée pour puper. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure supplémentaire 8 : Préparation des larves à la pupaison et à l’entretien des pupales. (A) Larve mûre prête à se puper sur du papier ondulé. Il s’agit d’un uniforme terne brun verdâtre et a perdu tous les chevrons. (B) Chambres de pupaison prêtes à recevoir des larves matures adjacentes à des tasses avec larves nourriclantes. Toutes les chambres de pupaison avec des couvercles abritent des larves qui se préparent à se puper. (C) Chambres de pupation avec des pupae. (D) Banques de chambres de pupaison avec des pupae organisées par date et maintenues dans des conditions de laboratoire. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure supplémentaire 9 : Cage d’émergence de laboratoire. (A) Une cage d’élevage en maille pliante abritant les chambres de puplies occupées. (B) Les couvercles de toutes les chambres de pupaison sont enlevés pour faciliter l’éclosion adulte réussie. (C) Tous les papillons adultes viables qui en résulteront seront relâchés dans la cage de vol grillagée afin d’assurer une copulation réussie. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure supplémentaire 10 : Papillon mâle adulte réussi tissain de la pupa sur un carré de papier ondulé. (A) Fermeture adulte de la pupa. (B) Adulte complètement retiré du boîtier pupal. (C) Adulte positionné pour étendre ses ailes. (D) Adulte élargissant ses ailes. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure supplémentaire 11 : Cinquième larve instar marquée de peinture lumineuse non toxique. (A) Une petite goutte de peinture lumineuse rouge et non toxique contrastante est placée sur le dorsum à l’aide d’un pinceau pour marquer avec succès la larve. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure supplémentaire 12 : Mise en place de l’élevage pour l’étude de l’histoire de la vie. ( A )Uniquelyétiqueté 2 onces de tasses en plastique transparent portion. (B) Une seule larve est séquestrée dans chaque tasse. (C) Toutes les larves sont suivies individuellement à travers tous les stades de développement, du nouveau-né au papillon adulte. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 1 : Nombre de paires enregistrées dans la copule en fonction de la température (c) dans une cage de vol filtrée et sans rendez-vous logée dans une serre à température contrôlée. La température a été enregistrée dans les 2 premières minutes d’un événement d’appariement réussi (n ' 411). Les données qui en ont résulté ont été utilisées pour aider à affiner les conditions environnementales contrôlées afin de maximiser le succès de l’accouplement et, en fin de compte, la productivité globale de la propagation en captivité. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Temps de développement moyen (nombre de jours) de chaque stade de vie immature. (A) Les barres affichent la moyenne de chaque groupe, et les barres d’erreur représentent les valeurs d’écart standard supérieures et inférieures pour chaque groupe. (B) Les barres bleu foncé représentent les femelles, et le bleu clair représente les mâles. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Capsules de tête recueillies auprès de #25 individuelles à l’aide du protocole d’historique de vie. Des capsules de tête ont été photographiées par Johnathan Bremer à l’aide d’un système d’automontage. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Étape de la vie	Longueur moyenne du corps (mm)	Erreur de Std. (longueur)	Temps de développement moyen (nombre de jours)	Std. Erreur (temps dev.)
Instar I	1.69478261 (n-23)	0.02152643	2,90625 (n-32)	0.08229783
Instar II	2.77248958 (n-32)	0.04302826	3.375 (n-32)	0.16649857
Instar III	5.45751042 (n-32)	0.12120829	3.5 (n-32)	0.20080483
Instar IV	10.2369688 (n-32)	0.23653991	3.875 (n-32)	0.18917265
Instar V	8.7625 (n-2)	2.6125	1.5 (n-2)	0.5
Instar VI	10.2666667 (n-1)	Na	3 (n-1)	Na
Pré-pupa	11.0858333 (n-24)	0.23948251	2,9375 (n-32)	0.21504641
Pupa	9.0316129 (n-31)	0.12106792	11.6578947 (n-38)	0.3272288

Tableau 1 : Durée moyenne et temps de développement de chaque étape de la vie. Erreur standard incluse pour chaque variable, et taille de l’échantillon entre parenthèses.

Étape de la vie	Longueur moyenne d’accord d’aile (mm)	Erreur de Std.
Adulte	12.63895 (n-38)	0.1365516
Femelle	12.960 (n-13)	0.1465588
Mâle	12.472 (n'25)	0.1863205

Tableau 2 : Longueur moyenne d’accord d’aile de premier pour les papillons adultes. Comprend des moyens pour les femmes, les hommes et tous les adultes (les deux sexes combinés).

Modèle LM 1	Std. Erreur d’estimation	t valeur	p-valeur
Intercepter	1.9179	3.128	0.0046 **
Avg. longueur deuxième instar	0.6822	-1.11	0.278
Avg. longueur troisième instar	0.2928	0.476	0.6381
Avg. longueur quatrième instar	0.1373	-0.57	0.5739
Avg. longueur pupae	0.246	3.957	0.0005 ***
p lt; 0,001; p 'lt; 0.01; p lt; 0,05.

Tableau 3 : Tableau des coefficients pour le modèle de régression linéaire (modèle LM 1) afin d’évaluer la relation entre la durée moyenne de chaque étape de vie (n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Variable dépendante : longueur d’accord d’aile adulte (mm).

Coefficients	Std. Erreur d’estimation	t valeur	Pr (en anglais seulement)
Intercepter	1.7091	3.031	0.0053 **
Avg. longueur pupae	0.1878	4.414	0.0002 ***

Tableau 4 : Régression progressive (Stepwise 1). Variable dépendante : longueur d’accord d’aile adulte (mm).

Modèle LM 2	Std. Erreur d’estimation	t valeur	p-valeur
Intercepter	1.1888	12.643	4.21e-12
Nombre de jours premier instar	0.3486	0.937	0.3583
Num. jours deuxième instar	0.2603	-0.686	0.4993
Num. jours troisième instar	0.2281	1.028	0.3141
Num. jours quatrième instar	0.2048	2.378	0.0257 *
Nombre de jours pré-pupae	0.222	1.133	0.2686
Num. jours pupae	0.2495	0.616	0.5435
Nombre total de jours num.	0.1913	-1.454	0.1589
p lt; 0,001; p 'lt; 0.01; p lt; 0,05.

Tableau 5 : Table coefficients pour le modèle de régression linéaire (modèle LM 2) afin d’évaluer la relation entre le temps de développement et la longueur de l’accord d’aile adulte. Variable dépendante : longueur d’accord d’aile adulte (mm).

Coefficients	Std. Erreur d’estimation	t valeur	p-valeur
Intercepter	0.89304	16.314	7.86e-16
Num. jours deuxième instar	0.17974	-1.809	0,0811 -
Num. jours quatrième instar	0.16917	2.075	0.0473 *
Nombre total de jours num.	0.04184	-1.787	0,0848 .
p lt; 0,001; p 'lt; 0.01; p 'lt; 0.05; p lt; 0,1

Tableau 6 : Régression progressive (Stepwise 2) pour le temps de développement. Variable dépendante : longueur d’accord d’aile adulte (mm).

Discussion

Ici, nous illustrons l’efficacité de ce protocole de reproduction de conservation ex situ éprouvé pour la production de masse de papillons à risque, et comment il peut être adapté à la recherche scientifique pour aider à combler les principales lacunes comportementales, de l’histoire de la vie ou des données écologiques. Une meilleure compréhension du temps de développement total moyen (oeuf à adulte), de la durée moyenne à chaque étape de la vie et de la température optimale pour l’accouplement, par exemple, ont été utilisées pour aider à affiner le protocole et à améliorer le succès global du programme. La grande majorité des protocoles existants détaillent uniquement les méthodes d’élevage des organismes et ne discutent pas de la collecte de données, de la recherche scientifique ou de l’utilisation de ces résultats pour aider à éclairer et potentiellement à adapter les méthodes ex situ.

Ce protocole exige l’élevage quotidien de l’organisme. La santé et la productivité des organismes sont maximisées par des conditions d’élevage propres, un manque de surpeuplement des organismes et la disponibilité de matériel végétal hôte larvaire de haute qualité. Pour la plupart, nous utilisons des fournitures d’élevage jetables et des conteneurs (p. ex., des gobelets en papier et en plastique), et nous les remplaçons généralement régulièrement, souvent tous les jours, et ne réutilisons jamais le matériau. Ceci est à la fois rentable et minimise le besoin d’un assainissement des matériaux à forte intensité de main-d’œuvre. Les outils couramment utilisés, cependant, tels que les forceps entomologiques, les pinceaux à l’aquarelle et les petites cages de vol pop-up, ainsi que toutes les surfaces d’élevage telles que les tables et les dessus de banc de laboratoire sont régulièrement désinfectés à l’aide d’une solution d’eau de Javel de 5 %. Le calendrier exact de l’assainissement dépend fortement de la fréquence d’utilisation, de la phénologie de l’organisme et d’autres variables, et devrait être adapté aux besoins spécifiques de chaque programme ex situ. Nous constatons en outre que le papier de boucher blanc est utile pour couvrir toutes les surfaces d’élevage. Il fournit un substrat propre peu coûteux et facilement déployable, et la couleur de fond blanche facilite l’observation de tous les organismes errants. Pour l’élevage quotidien, tout le personnel de laboratoire doit toujours porter des gants jetables d’examen de laboratoire pour minimiser la contamination et protéger le personnel contre toute irritation cutanée potentielle résultant de la manipulation des plantes ou des organismes. Ceci est particulièrement critique si le personnel de laboratoire a des animaux domestiques qui nécessitent des traitements topiques aux puces. Même une petite quantité de résidus d’ingrédients actifs peut être dangereux pour le bétail en captivité.

En outre, il faut prendre soin de minimiser la surpopulation de l’organisme. Le surpeuplement des larves peut rapidement conduire à une réduction de la santé de l’organisme et même au cannibalisme dans certains taxons, en particulier les Lycaenidae. Il peut être nécessaire de séparer régulièrement les larves pour réduire le nombre de larves dans les récipients d’élevage et/ou même isoler les larves individuelles, comme décrit dans la partie de l’histoire de la vie du protocole. Les nombres idéaux par conteneur peuvent varier considérablement en fonction du taxon particulier et des diverses contraintes du programme ex situ, comme le budget disponible, les installations de laboratoire et le nombre total de membres du personnel d’élevage. Nous recommandons également de laisser suffisamment d’espace entre les tasses abritant les larves afin de minimiser le potentiel de mouvement de l’organisme entre les conteneurs. Enfin, pour les grandes populations captives, il est fortement recommandé de séparer les stocks entre une ou plusieurs installations de laboratoire. Cette stratégie de sauvegarde peut aider à minimiser les pertes catastrophiques de l’ensemble de la population en raison de maladies ou d’autres impacts imprévus.

La qualité et la disponibilité des installations hôtes larvaires stimulent la production animale et influencent fortement à la fois les taux de développement larvaire et la santé globale de la population. Néanmoins, peu de rapports ou d’études publiés mettent en évidence cette exigence en coulisse ou discutent des meilleures pratiques de pépinière. La planification réussie du programme ex situ doit tenir compte des quantités, de la production et de l’entretien adéquats de l’usine. Comme de nombreuses larves ont aussi besoin ou préfèrent certaines parties végétales (p. ex., nouvelle croissance terminale, bourgeons floraux et inflorescences, fruits, etc.), une mise en scène efficace pour s’assurer qu’une phenologie végétale appropriée est nécessaire.

D’autres considérations comprennent une gestion démographique et génétique appropriée, et la minimisation de tout effet négatif potentiel de la captivité. Nous recommandons l’élaboration d’un plan de gestion génétique. Cela peut inclure des stratégies visant à inclure l’infusion de nouveaux matériels génétiques sur une base régulière, à maximiser la diversité et à prévenir la consanguinité rapprochée, à évaluer périodiquement les variables clés de la condition physique des organismes et à surveiller la génétique à un certain niveau pour permettre la comparaison avec les populations existantes et vérifier la santé des stocks en captivité. La comparaison périodique des caractéristiques des individus captifs aux individus des populations fondatrices est également justifiée^34,35.

Ces protocoles représentent des pratiques exemplaires éprouvées. Ils devraient être bénéfiques pour une variété de chercheurs et de praticiens de la conservation qui peuvent appliquer ou adapter directement nos méthodes à leurs propres études et ex situ à risque papillon ou des programmes de conservation et de récupération des insectes. Le protocole spécifique décrit de reproduction en captivité est probablement le plus applicable aux programmes axés sur d’autres Lycaenidae, taxons connexes, ou taxons de plus petite taille. Néanmoins, de nombreux éléments tels que ceux qui impliquent l’obtention de la cour réussie et la copulation, l’entretien des adultes avec nectar artificiel, la maximisation de l’oviposition, et les soins larvaires généraux pourraient sans doute être appliquées plus largement ou adaptées à un plus large éventail de taxons. Comme nous l’avons mentionné précédemment, bien qu’il faille souligner la flexibilité du protocole, l’accès à d’autres méthodologies établies peut aider à fournir un aperçu précieux et un point de départ viable pour l’adaptation et l’innovation. Les méthodes présentées pour évaluer diverses caractéristiques de l’histoire de la vie, comme le temps de développement des larvaires et le nombre de stades larvaires, ont sans doute une large applicabilité à d’autres programmes de reproduction de conservation et à des taxons à risque. Nous encourageons les autres à aider à combler les principales lacunes en matière de données écologiques dans la mesure du possible et à publier des protocoles et des résultats de programmes approuvés.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 oz plain white paper cups (Karat)	Lollicup	C-KC16
15-Amp 2-Outlet Mechanical Residential Plug-in Countdown Lighting Timer	Lowes	UTTNI2423
1ml sub-Q syringes (0.45 mm x 16 mm)	Fisher Scientific	14-829-10F
2 oz clear plastic portion cup lids	Party City	#791091
2 oz Clear Plastic Portion Cups	Party City	#791088
34.29 cm x 34.29 cm x 60.96 cm collapsible mesh popup rearing cage	Bioquip	1466BV
8.5" 1-Watt Incandescent Clamped Work Light	Lowes	PTC301L
Adoric Electronic Digital Caliper	Amazon.com	B07QX2SK2F
Big Kid's Choice Arts & Crafts Brush Set-12/Pkg, assorted sizes	Walmart	#10965135
Clear Plastic Cup Tray	Frontier Scientific Services	AG_9040
Fisher Scientific traceable memory monitoring thermometer	Fisher Scientific	15-077-8D
Forceps, Straight Points, Swiss Style #4, Stainless	BioQuip	4531
Humco Glycerin 6 oz	Walmart	#303951037966
Luminous Paint Kit, Blue, Red, Yellow, 4 Dram	Bioquip	1166A
Melon flavored Gatorade Fierce Thirst Quencher or fruit punch flavored Gatorade Thirst Quencher sports drink	Walmart	#568456137
Neoteck Digital 2 in 1 Hygrometer-Thermometer	Amazon.com	NTK026
Olympus 0.6 ml Microtubes, Clear, Polypropylene, Nonsterile	Amazon.com	24-272C
Plastic Tank Sprayer	Lowes	#5318
Q-tips Cotton swabs	Walmart	#551398298
Rectangular plastic tupperware container with lid (Rubbermaid)	Walmart	#554320171
Showgard 903 Stamp Tongs, 4 5/8 inch Spade Tip	Amazon.com	#787793151378
Single face corrugated paper roll	Amazon.com	BXSF12
Snap blade utility knife	OLFA	#5023
Solo 9 oz plastic cups	Solo	SQ950
Thorton Plastics 50 dram clear plastic snap cap vial (6.25 oz.)	Thorton Plastics	#50
Tulle Spool 9 inch x 150 feet - Black	Jo Ann Fabrics	#16029696
Zep 32 oz Plastic Spray Bottle	Lowes	HDPRO36