На риск бабочка плен программы распространения для повышения знаний истории жизни и эффективных Ex Situ Методы сохранения

Резюме

Здесь мы представляем протоколы для 1) лабораторное пленение распространения находящихся под угрозой исчезновения Майами голубая бабочка(Cyclargus thomasi bethunebakeri), и 2) оценки основных информации истории жизни, таких как незрелое время развития и количество личинок стадионов. Оба метода могут быть адаптированы для использования с другими программами сохранения ex situ.

Аннотация

Улучшение знаний ex situ передовой практики для на подвержение риска бабочек имеет важное значение для получения успешных результатов программы сохранения и восстановления. Исследования таких популяций в неволе могут также дать ценные данные для устранения ключевых информационных пробелов о поведении, истории жизни и экологии целевой таксон. Мы описываем протокол для в неволе распространение находящихся под федеральной угрозой Cyclargus thomasi bethunebakeri, которые могут быть использованы в качестве модели для других в группе риска бабочка ex situ программ, особенно в семье Lycaenidae. Мы также предоставляем простой и простой протокол для записи различных метрик истории жизни, которые могут быть полезны для информирования ex situ методологии, а также адаптированы для лабораторных исследований других lepidoptera.

Введение

Растущий список исследований указывает на широкораспространенное и серьезное глобальное снижение популяций бабочек^1,2,3,4,5. Это включает в себя подавляющее большинство видов, подверженных риску. Программы сохранения, предназначенные для смягчения такого снижения часто используют сочетание стратегий, включая мониторинг населения, управление средой обитания и восстановление, научные исследования, распространение в неволе, и транслокации организма⁶. Только в США и на их территориях в соответствии с Законом об исчезающих видах (ЕКА) в соответствии с Законом об исчезающих видах (ESA) в соответствии с Законом об исчезающих видах (ESA) они находятся под угрозой исчезновения, причем 21 из них одобрили проект или окончательные планы восстановления. Для таких таксонов, более половины выявленных стратегий восстановления рекомендуют в неволе распространение или заявить, что распространение в неволе должно быть оценено⁷. Использование ex situ усилия по сохранению бабочек значительно вырос в последние годы^8,9, и имеет потенциал, чтобы быть важным инструментом для оказания помощи усилия по восстановлению¹⁰. Многочисленные учреждения, организации и учреждения в настоящее время участвуют в ex situ усилия по крайней мере 11 ESA перечисленных бабочка такса (т.е., Cyclargus thomasi bethunebakeri, Euphydryas editha quino, Euphydryas editha taylori, Гераклиды aristodemus, Hesperia dacotae, Lycaeides Мелисса Samuelis, Oarisma poweshiek, Pyrgus ruralis lagunae, и Speryeria zerene hippolyta) и несколько других на риск такса (например, Callophrys irus, Euphydryas phaeton, Speyeria, idaria, idaria, idaria Eumaeus atala)¹¹. Несмотря на ряд энергичных и успешных усилий, по-прежнему отсутствует регулярная связь между программами и между специалистами по сохранению, включающая обмен идеями, данными, эффективными методологиями и результатами. Такой обмен знаниями имеет важное значение, поскольку он помогает свести к минимуму дублирование усилий, улучшает общую передовую практику и повышает воздействие на сохранение. Немногие опубликованные головы начала, в неволе воспитания, разведения, разведения, или животноводства протоколы легко доступны для риска бабочка такса, и те, которые часто не хватает достаточной детали повествования и / или иллюстраций. Они часто предоставляют в основном краткие детали с ограниченным пошаговыми инструкциями и сопроводительными изображениями, что делает репликацию сложной или прикладной к другим таксонным трудно оценить^12,13,14,15. Многие из имеющихся протоколов ограничены в некотором роде: они существуют только в серой литературе, или в различных уровнях детализации, возраст публикации, или в качестве составных частей в процессе симпозиума, агентства / фарвара доклады, или в доме руководства^{16,17,18,19,20,21,22,23,24}.

Для большинства программ сохранения, в неволе распространение в первую очередь проводится для поддержки сохранения транслокации, которая включает в себя реинтродукцию, укрепление (т.е., увеличение), и введение^25,26. Предполагается, что такая деятельность будет осуществляться стратегически в качестве компонента общей стратегии восстановления, с тем чтобы помочь предотвратить исчезновение перечисленных видов, подвидов или популяций. Следует отметить, однако, что это одна из нескольких других потенциальных ролей, что такие программы ex situ может служить. Они могут также включать в себя поддержание страхования (т.е. refugia) населения, временное спасение организма, поддержка восстановления связанных исследований и / или подготовки кадров, а также содействие сохранению связанных образования и осведомленности усилия^27,28. Независимо от того, имеют ли программы ex situ одну определенную цель или несколько, специалисты по сохранению должны максимально использовать возможности для сбора данных, с тем чтобы по возможности заполнить ключевые информационные пробелы. Это особенно важно, поскольку подавляющее большинство таксонов, подвергаемых риску, как правило, плохо изучались до существенного сокращения численности населения. В результате расширенные знания, полученные на различных поведенческих, экологических или жизненных аспектов истории фокусного таксона может служить для содействия эффективной сохранения видов и управления²⁹.

Здесь мы подробно описываем неволе протокол аженизации, который был разработан для федерального находящихся под угрозой исчезновения Майами голубая бабочка (Cyclargus thomasi bethunebakeri) (Дополнительный рисунок 1) в рамках более широкой программы сохранения и восстановления. В этом случае, в неволе программа распространения служит три конкретные определены роли: 1) страховое население должно существующих диких населения будут потеряны, 2) исследования населения, предназначенного для заполнения выявленных экологических и жизненных истории знаний пробелы, которые могут помочь информировать восстановления и / или управления, и 3) для производства жизнеспособных организмов для сохранения транслокации в местах в историческом диапазоне таксона. Полученный протокол был хорошо проверен и доказан, и он использовался и совершенствовался на протяжении более десяти лет. Следовательно, мы считаем, что описанные методы и методологии представляют собой жизнеспособную модель, которая может быть применена или легко адаптированы для других ex situ на риск бабочки программ, особенно с участием Lycaenidae или связанных таксон. Хотя мы не утверждаем, что описанный протокол превосходит другие, мы считаем, что существуют возможности для применения некоторых методов в более широком смысле, чтобы помочь повысить производительность, уход или эффективность. Это особенно верно, как большая часть нашего разведения осуществляется в закрытых лабораторных условиях с ограниченным пространством, подобно программам сохранения с участием Euphydryas editha taylori и Speryeria zerene hippolyta^17,23. Многочисленные другие протоколы часто используют материал в горшках для овипозиции или личиночного выращивания, что иногда может привести к увеличению сложностей, связанных с контролем хищников, экологический контроль (т.е. влажность, температура), мониторинг скота, сбор данных, проблемы вредителей растений, и пространство, чтобы назвать несколько^21,22. Наконец, в представленном протоколе излагаются методы разведения в неволе. Многие другие программы по сохранению бабочек из группы риска включают в себя начало головы или воспитание в неволе с репрезентативными протоколами, отражающими эти различия. Хотя часто незначительные, мы считаем, что это помогает расширить существующий пул доступной информации для других программ для рассмотрения. Это имеет решающее значение, поскольку большинство программ ex situ представляют собой новаторские усилия, направленные на содействие восстановлению редких и часто плохо изученных таксонов. Имеющиеся протоколы могут служить отличной отправной точкой, которая поможет получить ценную информацию, уменьшить дублирование усилий и способствовать инновациям. Из-за "обширного межвидового разнообразия поведения бабочки, черты истории жизни, и экологические требования в сочетании с часто заметные различия в программных средств, бюджеты, опыт практики" и другие присущие различия, зависимость от одной методологии, даже для тесно связанных таксонов, часто ограничивает и необоснованные³⁰. Гибкость в разработке или разработке новых протоколов с учетом потребностей конкретных таксонов или программ имеет важное значение для успеха и поэтому должна быть подчеркнута. Мы дополнительно описываем лабораторные методы сбора метрик развития организма в условиях неволе, включая количество личинок, продолжительность отдельных стадий развития, общее время разработки, а также личиночное и pupal длины. Эти методы имеют широкую применимость для изучения истории жизни Lepidoptera, которые могут быть использованы для уточнения ex situ протоколов или информировать данные на местах.

протокол

1. Обеспечение успешного ухаживания за взрослыми и спаривания

1. После успешного эклосии, освободить жизнеспособных взрослых бабочек в безопасной, ходить в, экранированный полет клетке, расположенной в контролируемой температурой теплицы(Дополнительная рисунок 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Взрослые могут быть отмечены на брюшной поверхности крыльев с постоянными маркерами чернил, если идентификация конкретных лиц желательно для разделения генетических линий, происхождения запасов, или для конкретного сбора данных, связанных с долголетием организма, поведением, Др.
   1. Хотя точные размеры клетки могут варьироваться, убедитесь, что есть достаточно места для размещения адекватного материала растения нектара, необходимого для поддержки плотности размещены взрослых бабочек и обеспечить пространство для человека свободно стоять и поворот вокруг.
   2. Помимо регулирования температуры, убедитесь, что теплица является безопасной, так что она может обеспечить второй слой сдерживания наряду с защитой от ненастной погоды (например, сильный дождь, ветер).
2. Поднимите горшок нектар растительного материала так, чтобы не было более 30 см пространства от внутренней верхней части клетки до самых цветущих цветов(Дополнительная рисунок 2). Это обеспечивает оптимальный доступ к имеющимся ресурсам нектара, предлагает широкие взрослые окуни, и сводит к минимуму посторонние полеты деятельности.
3. Поместите один горшок принимающей завода в полете клетке. Это гарантирует, что даже если спаренная пара пропустила любые полученные яйца, могут быть собраны.
4. Обеспечить постоянный воздушный поток. Это повышает ухаживания деятельности и спаривания успеха. В теплице, воздуходувки и фиксированные вентиляторы циркуляции крепления лучше всего использовать для повышения вентиляции и движения воздуха. Можно также использовать более мелкую портативную вентиляцию, такую как вентиляторы коробки или стола.
5. Поддержание внутренней температуры парниковой перепада между 27 и 32 градусами Цельсия для содействия оптимальной активности взрослых и успешности спаривания. Температура внутри клетки контролируется с помощью отслеживаемого термометра мониторинга памяти.
6. Туман экранированный полет клетки регулярно (примерно один раз в 2 ч) с водой с помощью ручного насоса, пластиковый распылитель бак, или садовый шланг.
7. Аккуратно собирать отдельные спаривания пар из экранированной клетке полета с помощью 50 драм ясно пластиковый флакон оснастки крышка (Таблица материалов), размещение от одной до двух пар на флакон, и транспорт в крытый комнате для воспитания или лаборатории(Дополнительная рисунок 3).

2. Максимальное производство яиц

1. Соберите камеру яйцики.
   1. Возьмите 12 унций простой белой бумажной чашки и с помощью оснастки нож омлачить утилиту, сделать два горизонтальных разрезов на каждой стороне чашки друг от друга. Каждый разрез должен быть примерно на 1 см ниже обода.
   2. Разрежьте один ватный тампон пополам и вставьте конец стержня каждого в два горизонтальных разреза с каждой стороны бумажной чашки так, чтобы часть ватного тампона простиралась примерно на 2 см к внутренней части чашки.
   3. Используя оснастки лезвие утилита нож, сделать два "X" сокращений в нижней части бумажного стаканчика. Длина каждой диагональной срезы должна составить около 1 см.
   4. Возьмите 9 унций пластиковый стаканчик и заполнить дно примерно 2 см водопроводной воды.
   5. Поместите свежую резку, длиной около 15 см, конечной личинки хозяина роста растений в бумажной чашке, вставив стебель через один из "X" сокращений в нижней части. Нажмите на стебель через разрез так, что примерно 4-5 см выступает из нижней части.
   6. Поместите бумажный стаканчик с материалом-хозяином в пластиковый стаканчик, гарантируя, что стебель растения находится в воде.
   7. Заполните 1 мл подкомного шприца (0,45 мм х 16 мм) ароматным спортивным напитком и насытите оба ватных тампона в бумажной чашке. Они действуют как искусственные цветы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дыня и фруктовый пунш ароматизированный спортивный напиток обеспечивают лучшую альтернативу нектару.
   8. Как только каждая брачная пара отделяется, поместите 2-3 gravid женщин в собранную конфигурацию чашки (т.е. камере оипозиции).
   9. Накройте чашку разрезаным квадратным фрагментом черного тюля (примерно 15 см х 15 см) и закрепите ее резинкой вокруг крышки(Дополнительная фигура 4). Черный тюль обеспечивает лучшую видимость в чашку и легко идентификации любых яиц, которые иногда могут быть заложены на тюль.
2. Стимулировать активность взрослых бабочек и овипозиции.
   1. Поместите каждую камеру яйцы на лабораторную скамейку или стол примерно на 19 см ниже 8,5 дюйма (21,59 см) зажима света с алюминиевым отражателем жилья 40 Вт лампы накаливания(Дополнительная рисунок 5).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лампы накаливания обеспечивает сияющее тепло, необходимое для стимулирования активности взрослых и яйточки.
   2. Поместите прослеживаемый термометр мониторинга памяти рядом с огнями и запустить датчик температуры так, что он лежит на верхней части камеры яйпозиции, расположенной непосредственно под зажимом света.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диапазон температуры цели между 27.5 C-29 C.
   3. Добавить дополнительные зажимные фары по мере необходимости в зависимости от общего числа яичников камер развернуты.
   4. Подключите зажим огни в программируемый 15 Amp 24 ч крытый плагин механический таймер с двумя розетками (программируемые в 30 минут приурочен интервалы).
   5. Установите таймер, чтобы включить зажим света на 30 минут интервалы (т.е., повторяемый цикл 30 мин, 30 минут).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот световой цикл помогает максимизировать производство яиц, предоставляя повторяемые периоды освещения, чтобы стимулировать активность взрослых бабочек и яйцеклетки с последующими короткими периодами темного отдыха.
   6. Освежайте ватные тампоны в каждой чашке с ароматизированным напитком спортов через sub-я шприц и туман регулярно с водой используя пластичные бутылки брызга приблизительно каждые 2-3 h или по мере необходимости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечивает адекватный искусственный нектар и влагу, чтобы бабочки бесплатно кормить по желанию. Это тем самым повышает как взрослого долголетия и продуктивности овипой в лабораторных условиях, где живые, цветущие растительные материалы не могут быть легко использованы.
   7. Регулярно мониторите чашки и заменяйте растение-хозяина свежими черенками по мере необходимости.
   8. Когда яйца начинают вылупляться или плотность яиц становится высокой, переместить самку (ы) в новую чашку со свежим хозяином и начать личинки протокола с новорожденными.

3. Уход и техническое обслуживание ларов

1. Повторите шаги 2.3-2.6 для сборки чашек для личинок.
2. Когда яйца начинают вылупляться, переместить хозяина растительного материала с яйцами и новоявленными личинками в недавно собранную чашку, поместив стебель через второй "X" в нижней части, гарантируя, что стебель растения находится в воде и оставляет коснуться прилегающих свежих резки хозяина.
3. Когда личинки молоды (новорожденный-2 instar), проверить личинки чашки ежедневно на свежесть материала растения хозяина и наличие плесени или чрезмерной frass.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ежедневное удаление материала хозяина не рекомендуется, когда личинки молоды, потому что это может привести к повреждению организма из-за обработки и / или ненужных отходов свежего материала хозяина.
4. Если материал хозяина увядший или в противном случае плохое состояние, поместите другую резку свежего материала хозяина в чашку так, чтобы она касалась существующей листвы и позволяла личинкам самостоятельно переходить к новому хозяину.
5. Как только личинки достигают^3-й instar, заменить бумажный стаканчик и добавить свежий материал хозяина ежедневно.
6. Используйте небольшой верблюжьи волосы акварелью краской кисть, чтобы аккуратно переместить личинки из старого материала хозяина или поверхности чашки на свежий материал хозяина в новой чашке.
7. Поместите старый материал-хозяин в пустой прямоугольный пластиковый контейнер для хранения продуктов питания.
8. Повторите шаги 3,5-3,7 ежедневно и до тех пор, пока все чашки с личинками не будут обработаны.
9. После завершения, добавить небольшое количество свежего материала хозяина на вершине растительных отходов в контейнере для хранения продуктов питания и свободно поместите крышку на вершине.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это служит гарантией в случае, если любые личинки упускается из виду во время ежедневной обработки, потому что они будут ползать на новый материал хозяина на верхней части отходов растений и могут быть удалены на следующий день.
10. Поддержание чашки при лабораторной температуре между 25 -C-28 C для оптимальной активности личинок и развития(Дополнительная диаграмма 6).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения оптимальной температуры воспитания в условиях внутреннего, часто необходимо разместить чашки под зажимом огней с алюминиевыми отражателями жилья 40 W лампы накаливания. Температура может быть активно контролируется с помощью отслеживаемого термометра мониторинга памяти и высота света скорректирована для достижения оптимальных условий воспитания.

4. Строительство камеры для очащейся

1. Разрежьте одно грань гофрированного рулона бумаги в равных размеров 3,8 см х 3,8 см квадратов.
2. Поместите один квадрат в 2 унции прозрачной пластиковой чашки порции.
3. Поместите чашку на прозрачный пластиковый поднос чашки(Дополнительная рисунок 7).

5. Подготовка личинок для ощения

1. Определите зрелых личинок, готовых к окутынию во время ежедневной обработки колонии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Такие личинки повернут униформу тускло-зеленовато-коричневой, потеряют свои шевроны и часто сбродят с хозяина.
2. Аккуратно удалите каждую зрелую личинку с небольшой верблюжьей волосакваторной краской кисти или щипками и поместите по одному в каждую ощение камеры.
3. Твердо оснастки прозрачной пластиковой крышкой на очащательной камере.
4. Повторите шаги 5.1-5.3 до тех пор, пока все личинки готовы к освящению были переведены в окуница камеры, добавляя новые пластиковые подносы по мере необходимости(Дополнительная диаграмма 8).

6. Поддержание куска

1. Для каждого лотка очаточных камер запишите дату первого опознавания и любую другую соответствующую информацию, необходимую (т.е. генетическую линию, экспериментальные испытания и т.д.).
2. Организуйте лотки по дате и месту в безопасном месте в лаборатории(Дополнительная диаграмма 8).
3. Монитор лотки ежедневно для взрослых eclosion.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Лабораторные условия, такие как температура, сильно влияют на время разработки.
4. Перед взрослой эклосией (обычно в течение 10 дней после первого ощения) снимите крышки с отдельных очающих камер и поместите лоток в 34,29 см х 34,29 см х 60,96 см складной сетки всплывающей клетки(дополнительная фигура 9).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Pupae надежно прилагается в канавки из гофрированных квадратов бумаги способствовать успешной электронной жизни взрослых(Дополнительная рисунок 10).
5. Повторите весь протокол со ступени 1.1 для последующего поколения в неволе.

7. Оценка времени разработки незрелых стадий и количества стадионов

1. Поместите одну личинку под рассекающий микроскоп. Используйте небольшой верблюжьи волосы акварель краской кисти, чтобы тщательно двигаться и изолировать личинки, чтобы избежать повреждения организма.
2. Опустите один волос кисти в нетоксичные светящиеся краски(Таблица материалов),и осторожно положите одну маленькую каплю краски на спину (дорсум) личинки. Используйте цвет краски, который выделяется из цвета фона и цвета рисунка личинки(Дополнительная рисунок 11). Обязательно не накладывайте краску на голову личинки.
3. После того, как краска высыхает (около 30 с или около того), поместите каждую отдельную личинку в свои собственные 2 унции прозрачной пластиковой порции, содержащей приблизительно 1-3 небольших листьев свежего материала конечного хозяина терминала и напишите уникальный идентификатор на чашке и крышке(Дополнительная рисунок 12).
4. Тщательно проверяйте каждую личинку ежедневно. Удалите листья и установите на белую поверхность. Осмотрите чашку, прочистую крышку и исследуете листья под рассекающим микроскопом на наличие личиночного эксувии (литых шкур) и/или капсул головы.
5. Если личиальная эксувия найдена, удалите ее из чашки и поместите в трубку микроцентрифуга с соответствующим номером чашки и датой (см. шаги 8.1-8.6. ниже).
6. Перекрасьте личинки после каждой линьки и запишите даты линьки.
7. Измерьте общую длину тела (голова до последнего брюшного сегмента) каждой личинки ежедневно с помощью цифровых калиперов. Возьмите три измерения и запишите среднее значение трех, а также дату и время. Для ранних личинок instar при измерении следует использовать увеличительное стекло или рассекающий область.
8. Верните личинку к соответствующей пластиковой порционной чашке.
9. Добавить свежий материал хозяина по мере необходимости и удалить все frass и старый мусор хозяина. Если плесень находится в чашке, распоряжаться и использовать новую чашку. Напишите правильный уникальный номер идентификатора на новой чашке.
10. Повторите шаги 7.5-7.9 до тех пор, пока все личинки не достигнут своего окончательного instar и не начнут prepupal этап. Когда личинки перестают кормить, поверните однородный тускло-коричневый цвет, потеряйте шевроны и часто блуждают у хозяина, сводят их с уникании, свести к минимуму их тревожные.
11. Поместите небольшой кусочек гофрированной бумаги в чашку (см. шаг 4.1).
12. После того, как каждая личинка полностью освящеется, измерьте ее общую длину как в шаге 7.8 выше и запишите дату ощения. Это будет окончательная линька каждого человека.
13. Проверьте на кусканого ежедневно и записывать eclosion дату и пол каждого в результате взрослых бабочки.
14. Измерьте длину крыла аккорда каждой бабочки с помощью цифровых калиперов. Бабочки можно аккуратно держать щипками для измерения. Если бабочка слишком активна, чтобы легко измерить, временно поместите его в холодильник на 30 с или меньше, и попробуйте еще раз.

8. Сбор личинок exuviae

1. При наблюдении личинки, заполните микроцентрифугую трубку 0,2 л глицерина. Наклейте верхнюю часть крышки и боковую сторону номером личинки, дату линьки и капсулу головы (H.C.).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Личинки некоторых личинок лепидоптеран регулярно потребляют их exuviae, но голова капсулы должны оставаться.
2. Поместите личиночных эксувии и связанные с ней капсулы головы в прозрачую пластиковую крышку чашки порции и положите в нее пару капель этанола.
3. Изучите личиночное эксувию под рассекающим микроскопом, поместив ее в прозрачую пластиковую крышку чашки и положив на нее несколько капель этанола. Если капсула личинки головы уже отделена от эксувии, поместите каплю глицерина на кончике остроконечных энтомологических щипцы и осторожно коснитесь капсулы головы к глицерину. Поместите капсулу головы в связанную микроцентрифугную трубку.
4. Если головная капсула все еще прикреплена к личиночной эксувии, используйте заостренные щипцы и булавку насекомого, чтобы отделить капсулу головы от личиночной эксувии.
5. Как только он отделяется, используйте технику глицерина, чтобы забрать капсулу головы. Если есть слишком много этанола, вы можете использовать небольшое бумажное полотенце, чтобы удалить некоторые, но будьте осторожны, чтобы случайно удалить голову капсулы.
6. Поместите капсулу головы в помеченный глицерин заполненные флакон и закрыть крышку плотно.

Результаты

В ходе двух отдельных природоохранных инициатив, направленных на восстановление Cyclargus thomasi bethunebakeri с февраля 2003 года по декабрь 2010 года и с ноября 2016 года по настоящее время, этот протокол был использован для успешного производства избытка 51 052 жизнеспособных организмов. На основе годового краткого снимка общей продуктивности населения в неволе с июня 2018 года по июнь 2019 года было произведено в общей сложности 10 166 жизнеспособных организмов, что составляет 782,00 и 118,93 организмов в месяц в течение 13 поколений. Аналогичным образом, средний общий объем производства яйцеклеток на одну самку в лабораторных условиях составил 114,00 и 26,12 (п No 12)³¹. В результате существенной продуктивности организма ряды этой программы среди крупнейших таких ex situ усилия в США, наряду с Euphydryas editha taylori, Speyeria zerene hippolyta, и Lycaeides Мелисса Samuelis²⁴. Отчасти эту продуктивность можно объяснить тем, что бабочка постоянно размышляет, производя одно поколение примерно каждые 4-6 недель в неволе. Большинство других программ сохранения разведения связаны таксона, которые являются univoltine или биволтина. Тем не менее, даже для программ, связанных с чрезвычайно fecund таксон, таких как Speyeria spp., общее количество жизнеспособных организмов, производимых для сохранения транслокации на ежегодной основе редко превышает несколько тысяч³². Соответственно, наша популяция в неволе позволила направить исследования и обширный сбор данных о многочисленных ключевых пробелов данных важно улучшить лучшие лабораторные методы разведения и животноводства(рисунок 1), а также помочь информировать восстановления и управления решениями.

Среднее общее время разработки от личинок новорожденных до взрослых составило 28,63 дня(таблица 1). Большинство личинок было четыре линьки(Рисунок 2, Рисунок 3), хотя два было пять линьки, и один из них шесть линьки. Общая средняя длина всех личинок instars составила 5,97 мм, а личинки были самыми большими на четвертом и предшествующей стадии жизни(таблица 1). Когда только включая переменные с более чем 30 наблюдений, самое короткое время было потрачено в первой instar и prepupal этапов, и самый длинный был проведен как кукулаки(Таблица 1, Рисунок 2). Самки обычно развивались быстрее на всех незрелых стадиях по сравнению с самцами, хотя это не было значительным эффектом (р 0,625). Статистический анализ проводился с использованием RStudio Version 1.1.463 (R Core Team 2016)³³. Средняя длина взрослого крыла аккорда составила 12,64 мм(таблица 2), и была существенная разница между полами (p 0.047). Двусторонний t-тест был запущен для оценки разницы в разнице между полами. Линейная регрессионная модель и пошаговая регрессия для средней продолжительности каждого этапа жизни показали, что длина pupal была лучшим предиктором для взрослых длина аккордов крыла(Таблица 3, Таблица 4). Регрессионные модели для разработки времени показали, что количество дней, проведенных во втором и четвертом instars и общее количество дней были лучшими предикторов для взрослых длина аккорда крыла, но только количество дней в четвертом instar было значительным (Таблица 5, Таблица 6). Поскольку переменные были непрерывными, две модели линейной регрессии запускались для времени разработки каждого этапа жизни, а также длины каждого этапа жизни, с длиной аккорда взрослого крыла в качестве зависимой переменной. Пошаговые регрессии запускались на обеих регрессионных моделях, чтобы определить лучшие предикторы длины аккордов взрослого крыла.

Дополнительная рисунок 1: Закрепленные образцы взрослого Cyclargus thomasi bethunebackeri. (A)Взрослый самец, дорсальный (слева), вентраль (справа). (B) Взрослая самка, дорсаль (слева), вентраль (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительная диаграмма 2: Экранированная летная клетка, размещенная в парнике, контролируемой температурой. (A) Интерьер показывает горшечные растения взрослого нектара и одно растение-хозяин личинки в горшках. (B) Металлические стеллажи помогает поднять горшечных растений нектара так, что есть не более 30 см пространства от внутренней верхней части клетки до самых цветущих цветов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительная рисунок 3: Процедура сбора взрослых пар в копуле. (A) Спаривание пара взрослых Cyclargus thomasi bethunebakeri внутри экранированной клетки полета (женщина, правая и мыжская, левая). (B) Спаривание пар, собранных из клетки полета в оснастки крышка флаконы и принес в лабораторию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительная рисунок 4: Процедура сборки камеры яйцы. (A) Двухчашка системы с терминальным материалом хозяина и ватные тампоны. (B) 1 мл суб-й шприц (0,45 мм х 16 мм) с ароматизированным спортивным напитком, насыщающим ватные тампоны в бумажной чашке. (C) Кубки жилья gravid женщин обеспеченных с черным тюлем. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительная диаграмма 5: Лабораторная установка для максимизации производства яиц. (A) Овипозиция камер, размещенных на лабораторной скамейке под зажимом света с лампой накаливания 40 W. (B) Отслеживаемый термометр мониторинга памяти находится рядом с огнями с датчиком температуры, опираясь на верхней части камеры яйцы, расположенной непосредственно под зажимом света. (C) 1 мл суб-й шприц и небольшой стакан проведения ароматизированный спортивный напиток размещен рядом с яичников камер для облегчения освежающих ватных тампонов регулярно в течение дня. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительная диаграмма 6: Лабораторная установка для ухода и обслуживания личинок. (A) Две чашки системы с каждой из которых содержит свежий материал терминала хозяина и личинок. (B) Температура в чашках поддерживается между 25 C-28 C для оптимальной активности личинок и развития накладными огнями зажима с 40 Вт ламп накаливания. (C) Прослеживаемый термометр мониторинга памяти с датчиком температуры, размещенным непосредственно в чашке, используется для мониторинга температуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительная диаграмма 7: Подготовленные очащения камер. (A) Индивидуальные пластиковые чашки порции размещены на прозрачных пластиковых подносов чашки. (B) Гофрированный квадрат бумаги помещается в каждой пластиковой чашки порции. (C) Одна зрелая личинка будет помещена в каждый подготовленный пластиковый стаканчик порции для окуна. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительная рисунок 8: Подготовка личинок для ощения и pupal обслуживания. (A) Зрелые личинки готовы окунать на гофрированной бумаге. Это равномерное тусклое зеленовато-коричневое и потеряло шевроны. (B) Окуниционные камеры готовы получить зрелые личинки, прилегающие к чашкам с кормлением личинок. Все окунающиеся камеры с крышками дома личинок, которые готовятся к окуне. (C) Окунищенные камеры с куколками. (D) Банки окутанных камер с кусками организованы по дате и поддерживается в лабораторных условиях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительная рисунок 9: Клетка появления лаборатории. (A) Складная сетка всплывающих воспитания клетке жилья оккупированных очащетельня камер. (B) Крышки всех очающих камер удаляются для облегчения успешного взрослого eclosion. (C) Все в результате жизнеспособных взрослых бабочек будут выпущены в экранированный полет клетке для обеспечения успешного совокупления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительная рисунок 10: Взрослый самец бабочки успешно eclosing от куколки на гофрированном квадрате бумаги. (A) Взрослый eclosing от кулачки. (B) Взрослый полностью удалены из pupal оболочки. (C) Взрослый расположен, чтобы расширить свои крылья. (D) Взрослый расширяет свои крылья. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительная фигура 11: Пятая личинка, отмеченная нетоксичными светящимися красками. (A) Небольшая капля контрастной красной, нетоксичной светящейся краски помещается на сум с помощью кисти, чтобы успешно отметить личинки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительная рисунок 12: Установка для изучения истории жизни. (A) Уникально помечены 2 унции прозрачных пластиковых стаканчиков. (B) Одна личинка секвестрирована в каждой чашке. (C) Все личинки индивидуально отслеживаются через все этапы развития от новорожденного до взрослой бабочки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 1: Количество зарегистрированных пар в копуле на основе температуры (КК) в пределах проходной, экранированной летной клетки, размещенной в парнике, контролируемом температурой. Температура была зафиксирована в течение первых 2 минут успешного парного события (n No 411). Полученные данные были использованы для уточнения контролируемых экологических условий, с тем чтобы максимизировать успех спаривания и, в конечном счете, общую производительность распространения в неволе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Среднее время разработки (количество дней) каждого незрелого этапа жизни. (A) Бары показывают среднее значение каждой группы, а бары ошибок представляют верхние и нижние стандартные значения отклонения для каждой группы. (B) Темно-синие полосы представляют женщин, а светло-голубые представляют мужчин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Головные капсулы, собранные из отдельных #25 с использованием протокола истории жизни. Головные капсулы были сфотографированы Джонатаном Бремером с помощью системы автомонтажа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Этап жизни	Средняя длина тела (мм)	Ошибка Std (длина)	Среднее время разработки (нум. дней)	Ошибка Std ( dev. время)
Инстар I	1.69478261 (n'23)	0.02152643	2.90625 (n-32)	0.08229783
Инстар II	2.77248958 (n'32)	0.04302826	3.375 (n'32)	0.16649857
Инстар III	5.45751042 (n'32)	0.12120829	3,5 (n-32)	0.20080483
Инстар IV	10.2369688 (n'32)	0.23653991	3.875 (n'32)	0.18917265
Инстар V	8.7625 (n'2)	2.6125	1.5 (n'2)	0.5
Инстар VI	10.2666667 (n'1)	Na	3 (n'1)	Na
Пре-куфа	11.0858333 (n'24)	0.23948251	2.9375 (n'32)	0.21504641
Куколки	9.0316129 (n'31)	0.12106792	11.6578947 (n'38)	0.3272288

Таблица 1: Средняя продолжительность и время развития каждого этапа жизни. Стандартная ошибка включена для каждой переменной и размер выборки в скобках.

Этап жизни	Средняя длина аккорда крыла (мм)	Std. Ошибка
Взрослых	12.63895 (n-38)	0.1365516
Женский	12.960 (n-13)	0.1465588
Мужской	12.472 (n'25)	0.1863205

Таблица 2: Средняя длина крыла крыла для взрослых бабочек. Включает средства для женщин, мужчин и всех взрослых (оба пола вместе взятые).

LM Модель 1	Std. Ошибка оценки	t значение	р-значение
Перехватить	1.9179	3.128	0.0046 **
Avg. длина второй instar	0.6822	-1.11	0.278
Avg. длина третьего instar	0.2928	0.476	0.6381
Avg. длина четвертого instar	0.1373	-0.57	0.5739
Avg. длина кукаты	0.246	3.957	0.0005 ***
р Злт; 0,001; . з.л.; 0,01; - стр. 0,05.

Таблица 3: Таблица коэффициентов для линейной модели регрессии (LM Model 1) для оценки взаимосвязи между средней продолжительностью каждого этапа жизни (n sgt; 30 включена в анализ) и длиной аккордов для взрослых. Зависимая переменная: длина аккорда взрослого крыла (мм).

Коэффициенты	Std. Ошибка оценки	t значение	Pr (зтто;
Перехватить	1.7091	3.031	0.0053 **
Avg. длина кукаты	0.1878	4.414	0.0002 ***

Таблица 4: Шаговая регрессия (Stepwise 1). Зависимая переменная: длина аккорда взрослого крыла (мм).

LM Модель 2	Std. Ошибка оценки	t значение	р-значение
Перехватить	1.1888	12.643	4.21e-12
Num. дней первого instar	0.3486	0.937	0.3583
Нум. дней второй instar	0.2603	-0.686	0.4993
Num. дней третий instar	0.2281	1.028	0.3141
Нум. дней четвертый instar	0.2048	2.378	0.0257 *
Num. дней до куска	0.222	1.133	0.2686
Num. дней кукаты	0.2495	0.616	0.5435
Всего нум. дней	0.1913	-1.454	0.1589
р Злт; 0,001; . з.л.; 0,01; - стр. 0,05.

Таблица 5: Таблица коэффициентов для модели линейной регрессии (LM Model 2) для оценки взаимосвязи между временем разработки и длиной аккордов для взрослых. Зависимая переменная: длина аккорда взрослого крыла (мм).

Коэффициенты	Std. Ошибка оценки	t значение	р-значение
Перехватить	0.89304	16.314	7.86e-16
Нум. дней второй instar	0.17974	-1.809	0,0811
Нум. дней четвертый instar	0.16917	2.075	0.0473 *
Всего нум. дней	0.04184	-1.787	0,0848
р Злт; 0,001; . з.л.; 0,01; - стр. 0,05; - стр. 0;1; 0,1

Таблица 6: Шаговая регрессия (Stepwise 2) для времени разработки. Зависимая переменная: длина аккорда взрослого крыла (мм).

Обсуждение

Здесь мы иллюстрируем эффективность этого проверенного ex situ сохранения размножения протокола для массового производства бабочек из группы риска, и как она может быть адаптирована для научных исследований, чтобы помочь решить ключевые поведенческие, истории жизни, или экологических пробелов данных. Более глубокое понимание среднего общего времени разработки (яйцо для взрослых), средняя продолжительность в каждом этапе жизни, и оптимальная температура для спаривания, например, были использованы, чтобы помочь уточнить протокол и повысить общий успех программы. Подавляющее большинство существующих протоколов подробно только методы организма husbandry и не обсуждать сбор данных, научные исследования, или использование таких результатов, чтобы помочь информировать и потенциально адаптировать ex situ методы.

Этот протокол требует ежедневного животноводства организма. Здоровье и продуктивность организма максимизируются за счет чистых условий воспитания, избытка переполненности организма и наличия высококачественного личиночного растительного материала хозяина. По большей части, мы используем одноразовые материалы для выращивания и контейнеры (например, бумажные и пластиковые стаканчики), и, как правило, заменить их регулярно, часто ежедневно, и никогда не повторно использовать материал. Это является экономически эффективным и сводит к минимуму потребность в более трудоемкой санитарии материалов. Обычно используемые инструменты, однако, такие как энтомологические щипцы, акварельные щетки краски, и небольшие всплывающие клетки полета, а также все поднимая поверхности, такие как столешницы и лабораторные скамейки вершины регулярно дезинфицируются с помощью 5% отбеливатель решение. Точный график санитарии в высокой степени зависит от частоты использования, фенологии организма и других переменных, и должен быть адаптирован к конкретным потребностям каждой программы ex situ. Кроме того, мы считаем, что белая мясная бумага полезна для покрытия всех поверхностей выращивания. Он обеспечивает недорогой, легко развертываемый чистый субстрат, а белый цвет фона облегчает наблюдение любых бродячих организмов. Для ежедневного животноводства, все лабораторные сотрудники должны всегда носить одноразовые перчатки лабораторный экзамен, чтобы свести к минимуму загрязнение и защитить персонал от любого потенциального раздражения кожи в результате обработки растений или организма. Это особенно важно, если какой-либо лабораторный персонал домашних животных, которые требуют актуальных лечения блох. Даже небольшое количество остатков активных ингредиентов может быть опасным для скота в неволе.

Кроме того, следует позаботиться о том, чтобы свести к минимуму переполненность организма. Переполненность личинок может быстро привести к снижению здоровья организма и даже каннибализму в некоторых таксонах, особенно lycaenidae. Регулярно елекающие личинки для уменьшения числа в емкости для выращивания и/или даже изоляции отдельных личинок, как описано в истории жизни, может потребоваться. Идеальные номера на контейнер могут значительно варьироваться в зависимости от конкретного таксона и различных ограничений программы ex situ, таких как доступный бюджет, лабораторные помещения и общее число персонала по производству персонала. Мы также рекомендуем оставить достаточное пространство между чашками личинки жилья, чтобы свести к минимуму потенциал перемещения организма между контейнерами. Наконец, для больших популяций в неволе настоятельно рекомендуется разделить запасы между одним или несколько лабораторными помещениями. Эта стратегия защиты может помочь свести к минимуму катастрофические потери всего населения из-за болезней или других непредвиденных последствий.

Larval принимающей завод качества и доступности дисков животноводства и сильно влияет как личинки развития и общее состояние здоровья населения. Тем не менее, лишь немногие опубликованные доклады или исследования подчеркивают это требование за кулисами или обсуждают лучшие практики питомника. Успешное планирование программы ex situ должно учитывать достаточное количество растений, производство и техническое обслуживание. Поскольку многие личинки также требуют или предпочитают определенные части растений (например, терминал нового роста, цветочные почки и соцветия, фрукты и т.д.), эффективная постановка для обеспечения надлежащей фенологии растений не требуется.

Дополнительные соображения включают надлежащее демографическое и генетическое управление и минимизацию любых потенциальных негативных последствий неволи. Мы рекомендуем разработать план генетического менеджмента. Это может включать в себя стратегии, предусматривающие регулярное включение внасывая новый генетический материал, максимальное разнообразие и предотвращение тесного инбридинга, периодические оценки ключевых переменных пригодности организма и мониторинг генетики на определенном уровне, с тем чтобы можно было проводить сравнение с сохранившимися популяциями и проверять здоровье в неволе. Периодическое сравнение характеристик лиц, нанесшие в плен, с отдельными лицами из числа основателей также оправдано^34,35.

Эти протоколы представляют собой проверенные передовые практики. Они должны быть полезны для различных исследователей и практиков сохранения, которые могут непосредственно применять или адаптировать наши методы к их собственным исследованиям и ex situ на риск бабочки или насекомых сохранения и восстановления программ. Конкретные изложенные неволе развода протокол, вероятно, наиболее применимы к программам, ориентированным на другие Lycaenidae, связанные таксон, или меньшего размера таксон. Тем не менее, многие компоненты, такие как те, которые связаны с обеспечением успешного ухаживания и совокупления, обслуживание взрослых с искусственным нектаром, максимизация овиспозиции, и общий уход за личинками, возможно, может быть более широко применяется или адаптированы к более широкому спектру таксонов. Как упоминалось ранее, хотя следует подчеркнуть гибкость протокола, доступ к другим установленным методологиям может помочь обеспечить ценную информацию и стать жизнеспособной отправной точкой для адаптации и инноваций. Методы, представленные для оценки различных характеристик истории жизни, таких как время разработки личинок и количество личинок стадионов, возможно, имеет широкую применимость к другим программам сохранения разведения и на риск такса. Мы призываем других, чтобы помочь решить ключевые экологические пробелы данных, когда это возможно, и публиковать проверенные протоколы и результаты программы.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 oz plain white paper cups (Karat)	Lollicup	C-KC16
15-Amp 2-Outlet Mechanical Residential Plug-in Countdown Lighting Timer	Lowes	UTTNI2423
1ml sub-Q syringes (0.45 mm x 16 mm)	Fisher Scientific	14-829-10F
2 oz clear plastic portion cup lids	Party City	#791091
2 oz Clear Plastic Portion Cups	Party City	#791088
34.29 cm x 34.29 cm x 60.96 cm collapsible mesh popup rearing cage	Bioquip	1466BV
8.5" 1-Watt Incandescent Clamped Work Light	Lowes	PTC301L
Adoric Electronic Digital Caliper	Amazon.com	B07QX2SK2F
Big Kid's Choice Arts & Crafts Brush Set-12/Pkg, assorted sizes	Walmart	#10965135
Clear Plastic Cup Tray	Frontier Scientific Services	AG_9040
Fisher Scientific traceable memory monitoring thermometer	Fisher Scientific	15-077-8D
Forceps, Straight Points, Swiss Style #4, Stainless	BioQuip	4531
Humco Glycerin 6 oz	Walmart	#303951037966
Luminous Paint Kit, Blue, Red, Yellow, 4 Dram	Bioquip	1166A
Melon flavored Gatorade Fierce Thirst Quencher or fruit punch flavored Gatorade Thirst Quencher sports drink	Walmart	#568456137
Neoteck Digital 2 in 1 Hygrometer-Thermometer	Amazon.com	NTK026
Olympus 0.6 ml Microtubes, Clear, Polypropylene, Nonsterile	Amazon.com	24-272C
Plastic Tank Sprayer	Lowes	#5318
Q-tips Cotton swabs	Walmart	#551398298
Rectangular plastic tupperware container with lid (Rubbermaid)	Walmart	#554320171
Showgard 903 Stamp Tongs, 4 5/8 inch Spade Tip	Amazon.com	#787793151378
Single face corrugated paper roll	Amazon.com	BXSF12
Snap blade utility knife	OLFA	#5023
Solo 9 oz plastic cups	Solo	SQ950
Thorton Plastics 50 dram clear plastic snap cap vial (6.25 oz.)	Thorton Plastics	#50
Tulle Spool 9 inch x 150 feet - Black	Jo Ann Fabrics	#16029696
Zep 32 oz Plastic Spray Bottle	Lowes	HDPRO36