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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
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  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Un protocole expérimental détaillé est présenté dans cet article pour l'évaluation de la toxicité neurocomportementale des polluants environnementaux à l'aide d'un modèle de larves de poissons zèbres, y compris le processus d'exposition et les tests pour les indicateurs neurocomportementaux.

Résumé

Ces dernières années, de plus en plus de polluants environnementaux se sont révélés neurotoxiques, en particulier aux premiers stades de développement des organismes. Les larves de poisson zèbre sont un modèle prééminent pour l'étude neurocomportementale des polluants environnementaux. Ici, un protocole expérimental détaillé est fourni pour l'évaluation de la neurotoxicité des polluants environnementaux à l'aide de larves de poissons zèbres, y compris la collecte des embryons, le processus d'exposition, les indicateurs neurocomportementaux, le processus d'essai, et l'analyse des données. En outre, l'environnement culturel, le processus d'exposition, et les conditions expérimentales sont discutés pour assurer le succès de l'analyse. Le protocole a été utilisé dans le développement de médicaments psychopathes, la recherche sur les polluants neurotoxiques environnementaux, et peut être optimisé pour faire des études correspondantes ou être utile pour les études mécanistes. Le protocole démontre un processus d'opération clair pour l'étude des effets neurocomportementaux sur les larves de poissons zèbres et peut révéler les effets de diverses substances neurotoxiques ou polluants.

Introduction

Ces dernières années, de plus en plus de polluants environnementaux se sont avérés neurotoxiques1,2,3,4. Cependant, l'évaluation de la neurotoxicité in vivo après l'exposition aux polluants environnementaux n'est pas aussi facile que celle de la perturbation endocrinienne ou de la toxicité du développement. En outre, l'exposition précoce aux polluants, en particulier à des doses respectueuses de l'environnement, a attiré l'attention croissante dans les études de toxicité5,6,7,8.

Le poisson zèbre est établi comme un modèle animal adapté aux études de neurotoxicité au cours du développement précoce après l'exposition aux polluants environnementaux. Les poissons zèbres sont des vertébrés qui se développent plus rapidement que les autres espèces après la fécondation. Les larves n'ont pas besoin d'être nourries parce que les nutriments dans le chorion sont suffisants pour les soutenir pendant 7 jours postfertilisation (dpf)9. Les larves sortent du chorion à 2 dpf et développent des comportements tels que la natation et le virage qui peuvent être observés, suivis, quantifiés et analysés automatiquement à l'aide d'instruments de comportement10,11,12,13 à partir de 3-4 dpf14,15,16,17,18. En outre, des tests à haut débit peuvent également être réalisés par des instruments de comportement. Ainsi, les larves de poissons zèbres sont un modèle exceptionnel pour l'étude neurocomportementale des polluants environnementaux19. Ici, un protocole est offert en utilisant la surveillance à haut débit pour étudier la toxicité neurocomportementale des polluants environnementaux sur les larves de poissons zèbres sous des stimuli légers.

Notre laboratoire a étudié la toxicité neurocomportementale de 2,2',4,4'-tetrabromodiphenyl ether (BDE-47)20,21, 6'-Hydroxy/Methoxy-2',4,4'-tetra Éther de diphenyl debromodiphenyl (6-OH/MeO-BDE-47)22,éther de diphenyl deca-brominated (BDE-209), plomb, et paraffines chlorées commerciales23 utilisant le protocole présenté. De nombreux laboratoires utilisent également le protocole pour étudier les effets neurocomportementaux d'autres polluants sur les larves ou les poissons adultes24,25,26,27. Ce protocole neurobehavioral a été employé pour aider à fournir le soutien mécaniste montrant que l'exposition à faible dose au bisphénol A et au bisphénol s de remplacement ont induit la neurogenèse hypothalamique prématurée dans le poisson zèbre embryonnaire27. En outre, certains chercheurs ont optimisé le protocole pour effectuer des études correspondantes. Une étude récente a éliminé la toxicité de la bêta amyloïde (A) dans un modèle facile et à haut débit de poisson zèbre utilisant des nanoparticules d'or enduites de caséine (Cas AuNPs). Il a montré que les AUNPs de Cas dans la circulation systémique se sont translocalisés à travers la barrière hémato-encéphalique des larves de poisson-zèbre et ont séquestré l'A-42 intracérébral, suscitant la toxicité d'une manière non spécifique, de forme de chaperon, qui a été soutenue par la pathologie comportementale28.

La locomotion, l'angle de chemin et l'activité sociale sont trois indicateurs neurocomportementaux utilisés pour étudier les effets de neurotoxicité des larves de poissons zèbres après l'exposition aux polluants dans le protocole présenté. La locomotion est mesurée par la distance de nage des larves et peut être endommagée après l'exposition aux polluants. L'angle de chemin et l'activité sociale sont plus étroitement liés à la fonction du cerveau et du système nerveux central29. L'angle de chemin se réfère à l'angle du chemin de mouvement des animaux par rapport à la direction de natation30. Huit classes d'angle à partir de 180 euros et 180 degrés sont installées dans le système. Pour simplifier la comparaison, six classes dans le résultat final sont définies comme des virages de routine (-10 '0 ', 0 '10 '), les virages moyens (-10 '-90 ', '10 '90 '), et les virages réactifs (-180 '-90 ', '90 '' '180 ') selon nos études précédentes21,22. L'activité sociale à deux poissons est fondamentale du comportement de haut-fond de groupe ; ici, une distance de lt; 0,5 cm entre deux larves valides est définie comme un contact social.

Le protocole présenté ici démontre un processus clair pour étudier les effets neurocomportementaux sur les larves de poissons zèbres et fournit un moyen de révéler les effets de neurotoxicité de diverses substances ou polluants. Le protocole profitera aux chercheurs intéressés à étudier la neurotoxicité des polluants environnementaux.

Protocole

Le protocole est conforme aux lignes directrices approuvées par le Comité d'éthique animale de l'Université Dengji.

1. Collection d'embryons de poissons-zèbres

  1. Mettez deux paires de poissons zèbres Tubingen adultes en bonne santé dans la boîte de frai la nuit avant l'exposition, en maintenant le rapport de sexe à 1:1.
  2. Retirez le poisson adulte au système 30-60 min après la lumière du jour le lendemain matin.
  3. Retirer les embryons de la boîte de frai.
  4. Rincer les embryons avec de l'eau du système.
  5. Transférer les embryons dans un plat Petri en verre (9 cm de diamètre) avec suffisamment d'eau du système.
  6. Observez les embryons au microscope et sélectionnez des embryons sains pour une exposition ultérieure.
    REMARQUE : Les embryons sains sont généralement transparents avec une couleur dorée légère sous le microscope. Les embryons malsains sont généralement pâles et regroupés comme on l'observe au microscope.

2. Préparation avant exposition

  1. Préparer la solution Hanks selon les lignes directrices du livre de poisson zèbre31.
    REMARQUE: La solution Hanks comprend 0,137 M NaCl, 5,4 mM KCl, 0,25 mM Na2HPO4, 0,44 mKH KH2PO4, 1,3 mM CaCl2, 1,0 mM MgSO4, et 4,2 mM NaHCO3.
  2. Diluer la solution des Hanks à la solution de 10% Hanks en utilisant de l'eau stérile.
  3. Ajoutez 1 mL de DMSO dans 999 mL de la solution de 10% Hanks pour faire une solution de contrôle de 10% de la solution Hanks comprenant 0,1% de DMSO.
    REMARQUE : Les étapes suivantes utilisent BDE-47 comme exemple de solution d'exposition.
  4. Dissoudre 5 mg de la BDE-47 soignée dans 1 ml de 100% DMSO pour faire une solution d'exposition standard de 5 mg/ml.
  5. Vortex la solution de 5 mg/ml pendant 1 min pour dissoudre complètement le BDE-47 dans le DMSO.
  6. Transférer 10 l de la solution de 5 mg/ml dans une bouteille en verre brun de 12 ml.
  7. Ajouter de l'eau stérilisée à un volume final de 10 ml pour faire la concentration de la solution d'exposition BDE-47 5 mg/L et dMSO ratio à 0,1%, puis vortex pendant 1 min.
  8. Transférer respectivement 10 l et 100 oL de la solution de 5 mg/L dans deux flacons volumétriques de 100 ml.
  9. Ajoutez 10 % de la solution Hanks, y compris 0,1 % de DMSO (préparé à l'étape 2,3) à 100 ml pour effectuer les concentrations finales des solutions d'exposition BDE-47 de 5 g/L et 50 g/L, respectivement.
  10. Transférer les solutions dans des bouteilles en verre brun de 100 ml et les conserver à 4 oC.

3. Exposition d'embryons

  1. Transférer 50 embryons dans chacun des trois plats Petri en verre (6 cm de diamètre) 3-5 heures après la fécondation (hpf).
  2. Utilisez une pointe de pipette de 1 ml pour effacer l'eau du système autour des embryons.
  3. Utilisez une pipette pour transférer le contrôle et deux solutions d'exposition BDE-47 (contrôle, 5 g/L, 50 g/L) dans les trois plats Petri en verre, respectivement.
  4. Secouez doucement les boîtes de verre Petri une par une pour que les embryons se dispersent au fond de l'assiette.
  5. Mettre les plats En verre Petri dans l'incubateur de lumière sous 28.5 'C.
  6. Renouveler la moitié des solutions d'exposition tous les 24 h jusqu'à 5 dpf.
  7. Vérifiez les embryons morts de chaque groupe sur 1 dpf et 2 dpf et calculez le taux de mortalité.
  8. Vérifiez les embryons incubés de chaque groupe sur 2 dpf et 3 dpf et calculez l'écoutille.
  9. Vérifiez la déformation des larves tous les jours après leur sortie du chorion et calculez le taux de déformation de chaque groupe.
    REMARQUE : Les indicateurs de déformation incluent le kyste péricardique, la courbure spinale, la courbure de queue, entre autres facteurs32.

4. Préparation pour le test de comportement

  1. Préparer une microplaque de 48 puits pour le test de locomotion et d'angle de chemin et trois microplaques de 6 puits pour le test d'activité sociale le matin de 5 dpf.
  2. Transférer 800 l de solution d'exposition dans chaque puits de la microplaque de 48 puits.
    REMARQUE : Utilisez 16 puits pour chaque groupe (c.-à-d. la solution de contrôle, 5 g/L et 50 g/L).
  3. Utilisez une pointe de pipette de 1 ml pour transférer 200 l de solution d'exposition avec une larve du plat Petri en verre dans un puits de la microplaque de puits 48.
  4. Transférer 4 ml de solution d'exposition dans chaque puits de la microplaque de 6 puits.
    REMARQUE: Utilisez un microplaque de 6 puits pour chaque groupe.
  5. Utilisez une pointe de pipette de 1 ml pour transférer 200 l de solution d'exposition avec deux larves dans chaque puits de la microplaque de 6 puits.
    REMARQUE : Chaque groupe a six groupes répétitifs.
  6. Assurez-vous que la température de la salle d'essai est de 28 oC 2 h avant le test.
    REMARQUE : Les tests comportementaux sont habituellement effectués dans l'après-midi.

5. Test comportemental

  1. Test de locomotion et d'angle de chemin
    1. Cliquez sur l'icône du lanceur sur le bureau de l'ordinateur pour ouvrir le logiciel (voir Tableau des matériaux) qui contrôle l'enceinte de surveillance à haut débit pour démarrer le programme.
    2. Choisissez le module "Tracking, Rotations, Path Angles" pour entrer dans l'interface de fonctionnement.
    3. Transférer la microplaque de 48 puits préparée à l'étape 4.3 sur la plate-forme d'enregistrement et tirer vers le bas la couverture.
    4. Cliquez sur le bouton "File" "Generate Protocol" à son tour dans le logiciel pour commencer à générer un nouveau protocole.
    5. Entrée "48" dans la position "Location count" et cliquez sur le bouton "OK".
    6. Cliquez sur le bouton "Paramètres" "Protocol Parameters" "Time" à son tour dans le logiciel. Définir la durée de l'expérience pendant 1 h et 10 min et définir la période d'intégration à 60 s33.
    7. Dessinez les zones détectées.
      1. Sélectionnez la forme elliptique et dessinez le premier cercle autour du premier haut à gauche bien.
      2. Sélectionnez le cercle, cliquez sur le "Copy" "Top-Right Mark" "Paste" "Select" bouton à son tour, et utilisez la souris pour faire glisser le cercle copié vers le haut à droite bien.
      3. Sélectionnez le cercle, cliquez sur le "Copy" "Bottom Mark" "Paste" "Select" button à son tour, et utilisez la souris pour faire glisser le cercle copié vers le bas à droite.
      4. Cliquez sur le bouton "Build" "Clear marks" à son tour.
        REMARQUE : Le système tirera automatiquement tous les autres puits de la plaque. Les zones nouvellement créées doivent parfaitement s'adapter à chaque puits entre le poisson réel et sa réflexion sur le côté du puits.
    8. Cliquez sur le bouton "Draw Scale", tracez une ligne d'étalonnage à l'écran (un chemin diagonal ou parallèle au côté de la microplaque), entrez dans sa longueur et fixez l'"Unité". Ensuite, cliquez sur le bouton "Appliquer au groupe".
    9. Définir la couleur animale à "Noir" dans le logiciel.
    10. Fixer le seuil de détection à 16-18 pour permettre la détection des animaux.
    11. Entrée inactive/petite et petite/grande vitesse à 0,5 cm/s et 2,5 cm/s respectivement.
    12. Définir les classes d'angle de chemin. Entrée "-90, -30, -10, 0, 10, 30 et 90" pour faire des classes d'angle de chemin à partir de -180 '-180 '.
    13. Définir les conditions de lumière
      1. Cliquez sur le bouton "Paramètres" "Light driving" "Utilise l'une des 3 méthodes de déclenchement ci-dessous"Enhanced stimulus" bouton à son tour pour définir les conditions de lumière.
      2. Choisissez le bouton «Edge», puis fixez une période sombre de 10 min, suivie de trois cycles de périodes de lumière et d'obscurité alternées de 10 minutes.
    14. Enregistrer le protocole et baisser la lumière de la salle d'essai.
    15. Acclimater les larves dans le système pendant 10 min et cliquez sur le bouton "Expérience"Exécuter" à son tour, puis choisissez le dossier où les fichiers d'expérience sont enregistrés et entrez le nom du résultat.
    16. Cliquez sur le bouton "Contexte" "Démarrer" à son tour pour commencer le test.
    17. Cliquez sur le bouton "Expérience" "Stop" à son tour pour arrêter l'expérience à la fin du test.
      REMARQUE : Le système affiche les données testées lorsque le système s'arrête. Les données comprennent la distance suivie à trois classes de vitesse et les numéros d'angle de chemin à huit classes d'angle de chaque minute. Pour le test de locomotion dans l'exemple présenté, la distance totale dans chaque période de lumière (10 min) est calculée et la différence entre le groupe témoin et les groupes de traitement est comparée.
    18. Transférer la microplaque de puits 48 à l'incubateur de lumière pour d'autres expériences.
  2. Test d'activité sociale
    1. Cliquez sur l'icône du lanceur sur le bureau de l'ordinateur pour ouvrir le logiciel qui contrôle l'enceinte de surveillance à haut débit pour démarrer le programme.
    2. Choisissez le module «Interactions sociales» pour entrer dans l'interface d'exploitation.
    3. Transférer les 6 microplaques de puits préparées (groupe témoin) à l'étape 4.4 sur la plate-forme d'enregistrement et abattre la couverture.
    4. Cliquez sur le bouton "File" "Generate Protocol" à son tour dans le logiciel pour commencer à générer un nouveau protocole.
    5. Entrée "6" dans la position "Location count" et cliquez sur le bouton "OK".
    6. Cliquez sur le bouton "Paramètres" "Protocol Parameters" "Time" à son tour dans le logiciel. Définir la durée de l'expérience pendant 1 h et 10 min et définir la période d'intégration à 60 s.
    7. Dessinez les zones détectées.
      1. Sélectionnez la forme elliptique et dessinez le premier cercle autour du premier haut à gauche bien.
      2. Sélectionnez le cercle, cliquez sur le "Copy" "Top-Right Mark" "Paste" "Select" bouton à son tour, et utilisez la souris pour faire glisser le cercle copié vers le haut à droite bien.
      3. Sélectionnez le cercle, cliquez sur le "Copy" "Bottom Mark" "Paste" "Select" button à son tour, et utilisez la souris pour faire glisser le cercle copié vers le bas à droite.
      4. Cliquez sur le bouton "Build" "Clear marks" à son tour.
        REMARQUE : Les zones nouvellement créées doivent s'adapter parfaitement à chaque puits et entre les larves réelles et sa réflexion sur le côté du puits.
    8. Cliquez sur le bouton "Draw Scale", tracez une ligne d'étalonnage à l'écran (un chemin diagonal ou parallèle au côté de la microplaque), entrez dans sa longueur et fixez l'"Unité". Ensuite, cliquez sur le bouton "Appliquer au groupe".
    9. Fixer le seuil de détection à 16-18 pour permettre la détection des animaux.
    10. Cliquez sur le bouton "Animal noir" dans le logiciel.
    11. Choisissez le bouton "Distance Threshold" et entrez "5" dans le logiciel.
    12. Définir les conditions de lumière.
      1. Cliquez sur le bouton "Paramètres" "Light driving" "Utilise l'une des 3 méthodes de déclenchement ci-dessous"Enhanced stimulus" bouton à son tour pour définir les conditions de lumière.
      2. Choisissez le bouton «Edge», puis fixez une période sombre de 10 min, suivie de trois cycles de périodes de lumière et d'obscurité alternées de 10 minutes.
    13. Enregistrer le protocole et baisser la lumière de la pièce.
    14. Acclimater les larves dans le système pendant 10 min et cliquez sur le bouton "Expérience"Exécuter" à son tour, puis choisissez le dossier où les fichiers d'expérience sont enregistrés et entrez le nom du résultat.
    15. Cliquez sur le bouton "Contexte" "Démarrer" à son tour pour commencer le test.
    16. Cliquez sur le bouton "Expérience" "Stop" à son tour pour arrêter l'expérience dans le logiciel à la fin du test.
      REMARQUE : Le système affiche les données testées lorsque le système s'arrête.
    17. Transférer la microplaque de 6 puits (groupe témoin) à l'incubateur de lumière pour d'autres expériences.
    18. Transférer les 6 microplaques de puits (5 groupes g/L et 50 g/L) à tour de rôle sur la plate-forme d'enregistrement et répéter les étapes de 5,2,4 à 5,2,17 par ordinal.

6. Analyse des données

  1. Ouvrez le fichier de feuille de calcul dans les résultats de la locomotion et de l'angle de chemin.
  2. Sélectionnez les trois colonnes de distance(inadiste, smldiste, lardist) et additionnez-les.
    REMARQUE: Les données de l'inadiste, smldist, et lardist signifient différentes distances enregistrées par le système dans différentes classes de vitesse (inactif / petit / grand), respectivement.
  3. Pour chaque période de lumière de 10 minutes, résumez la distance de chaque puits, calculez la distance moyenne de 16 puits et comparez les données des trois groupes sous des stimuli lumineux.
  4. Pour chaque période de lumière de 10 minutes, résumez le nombre d'angle de chaque puits dans chaque durée de lumière, du cl01 au cl08 à son tour, et comparez les données des trois groupes sous des stimuli légers.
    REMARQUE : Les données des colonnes de cl01 à cl08 signifient des nombres d'angle de chemin différents enregistrés par le système dans différents angles de chemin, respectivement.
  5. Ouvrez le fichier de feuille de calcul dans les résultats d'activité sociale.
  6. Sélectionnez les colonnes contct et contdur, et pour chaque période de 10 minutes de lumière résument les temps sociaux et leur durée pour chaque puits.
  7. Calculez les temps sociaux moyens et la durée d'un groupe dans chaque durée de lumière et comparez les données des trois groupes sous des stimuli légers.

Résultats

Ici, nous décrivons un protocole pour étudier les effets neurocomportementaux des polluants environnementaux utilisant des larves de poissons zèbres sous des stimuli légers. Les tests de locomotion, d'angle de chemin et d'activité sociale sont définis dans l'introduction. La configuration des microplaques dans les tests de locomotion et d'angle de chemin et les images du logiciel sont montrées ci-dessous. De plus, nos propres résultats de recherche sont présentés comme des exemp...

Discussion

Ces travaux fournissent un protocole expérimental détaillé pour évaluer la neurotoxicité des polluants environnementaux à l'aide de larves de poissons zèbres. Le poisson zèbre passe par le processus des embryons aux larves pendant la période d'exposition, ce qui signifie qu'un bon soin des embryons et des larves est essentiel. Tout ce qui affecte le développement des embryons et des larves peut influencer le résultat final. Ici, l'environnement culturel, le processus d'exposition et les conditions expérimenta...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Les auteurs sont reconnaissants pour le soutien financier de la National Natural Science Foundation of China (21876135 et 21876136), du National Major Science and Technology Project of China (2017ZX07502003-03, 2018ZX07701001-22), la Fondation de MOE-Shanghai Le Laboratoire clé de la santé environnementale des enfants (CEH201807-5) et le Conseil suédois de la recherche (no 639-2013-6913).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
48-well-microplateCorning3548Embyros housing
6-well-microplateCorning3471Embyros housing
BDE-47AccuStandard5436-43-1Pollutant
DMSOSigma67-68-5Cosolvent
MicroscopeOlympusSZX 16Observation instrument
PipetteEppendorf3120000267Transfer solution
ZebraboxViewpointZebraBoxBehavior instrument
ZebrafishShanghai FishBio Co., Ltd.TubingenZebrafish supplier
ZebraLabViewpointZebraLabBehavior software

Références

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