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Neste Artigo

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Resumo

Um protocolo experimental detalhado é apresentado neste artigo para avaliação da toxicidade neurocomportamental de poluentes ambientais utilizando um modelo de larvas de zebrafish, incluindo o processo de exposição e testes para indicadores neurocomportamentais.

Resumo

Nos últimos anos, mais e mais poluentes ambientais têm se mostrado neurotóxicos, especialmente nos estágios iniciais de desenvolvimento dos organismos. Larvas de zebrafish são um modelo preeminente para o estudo neurocomportamental de poluentes ambientais. Aqui, prevê-se um protocolo experimental detalhado para a avaliação da neurotoxicidade dos poluentes ambientais utilizando larvas de zebrafish, incluindo a coleta dos embriões, o processo de exposição, indicadores neurocomportamentais, o processo de teste e análise de dados. Além disso, o ambiente cultural, o processo de exposição e as condições experimentais são discutidos para garantir o sucesso do ensaio. O protocolo tem sido usado no desenvolvimento de drogas psicopáticas, pesquisas sobre poluentes neurotóxicos ambientais, e pode ser otimizado para fazer estudos correspondentes ou ser útil para estudos mecanicistas. O protocolo demonstra um processo de operação claro para estudar efeitos neurocomportamentais em larvas de zebrafish e pode revelar os efeitos de várias substâncias neurotóxicas ou poluentes.

Introdução

Nos últimos anos, mais e mais poluentes ambientais têm sido comprovados neurotóxicos1,2,3,4. No entanto, a avaliação da neurotoxicidade in vivo após a exposição a poluentes ambientais não é tão fácil quanto a da perturbação endócrina ou toxicidade do desenvolvimento. Além disso, a exposição precoce a poluentes, especialmente em doses ambientalmente relevantes, tem atraído cada vez mais atenção nos estudos de toxicidade5,6,7,8.

O zebrafish está sendo estabelecido como um modelo animal adequado para estudos de neurotoxicidade durante o desenvolvimento precoce após a exposição a poluentes ambientais. Zebrafish são vertebrados que se desenvolvem mais rápido do que outras espécies após a fertilização. As larvas não precisam ser alimentadas porque os nutrientes na corção são suficientes para sustentá-las por 7 dias após a fertilização (dpf)9. Larvas saem da corção de ~2 dpf e desenvolvem comportamentos como natação e giro que podem ser observados, rastreados, quantificados e analisados automaticamente utilizando instrumentos de comportamento10,11,12,13 a partir de 3-4 dpf14,15,16,17,18. Além disso, testes de alto nível também podem ser realizados por instrumentos de comportamento. Assim, as larvas de zebrafish são um modelo notável para o estudo neurocomportamental de poluentes ambientais19. Aqui, um protocolo é oferecido usando monitoramento de alta base para estudar a toxicidade neurocomportamental de poluentes ambientais em larvas de zebrafish estímulos leves.

Nosso laboratório estudou a toxicidade neurocomportamental de 2,2',4,4'-tetrabromodifenídel eter (BDE-47)20,21, 6'-Hydroxy/Methoxy-2,2',4'-tetra Eter diphenyl deca(BDE-209), chumbo e paraffins clorados comerciais23 usando o protocolo apresentado. Muitos laboratórios também usam o protocolo para estudar os efeitos neurocomportamentais de outros poluentes em larvas ou peixes adultos24,25,26,27. Este protocolo neurocomportamental foi usado para ajudar a fornecer suporte mecanicista mostrando que a exposição de baixa dose ao bisfenol A e a substituição do bisfenol S induziu neurogênese hipotámica prematura em zebrafish embrionário27. Além disso, alguns pesquisadores otimizaram o protocolo para realizar estudos correspondentes. Um estudo recente eliminou a toxicidade do beta amiloide (Aβ) em um modelo de zebrafish fácil e de alto nível usando nanopartículas de ouro revestidas de casein (βCas AuNPs). Mostrou que βCas AuNPs em circulação sistêmica translocou através da barreira hematoencefálica de larvas de zebrafish e seqüendo a β42 intracerebral, provocando toxicidade de uma maneira inespecífica, semelhante a acompanhante, que foi apoiada pela patologia comportamental28.

Locomoção, ângulo de caminho e atividade social são três indicadores neurocomportamentais utilizados para estudar os efeitos da neurotoxicidade das larvas de zebrafish após a exposição a poluentes no protocolo apresentado. A locomoção é medida pela distância de natação das larvas e pode ser danificada após a exposição a poluentes. O ângulo do caminho e a atividade social estão mais intimamente relacionados com a função do cérebro e do sistema nervoso central29. O ângulo do caminho refere-se ao ângulo do caminho do movimento animal em relação à direção de natação30. Oito classes angulares de ~-180°-~+180° estão definidas no sistema. Para simplificar a comparação, seis classes no resultado final são definidas como curvas de rotina (-10° ~0°, 0° ~+10°), curvas médias (-10° ~-90°, +10° ~+90°), e curvas responsivas (-180° ~-90°, +90° ~+180°) de acordo com nossos estudos anteriores21,22. A atividade social de dois peixes é fundamental para o comportamento de esnomas em grupo; aqui uma distância de < 0,5 cm entre duas larvas válidas é definida como contato social.

O protocolo aqui apresentado demonstra um processo claro para estudar efeitos neurocomportamentais nas larvas de zebrafish e fornece uma maneira de revelar os efeitos da neurotoxicidade de várias substâncias ou poluentes. O protocolo beneficiará pesquisadores interessados em estudar a neurotoxicidade dos poluentes ambientais.

Protocolo

O protocolo está de acordo com as diretrizes aprovadas pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Tongji.

1. Coleção de embriões de zebrafish

  1. Coloque dois pares de zebrafish Tubingen adulto saudável na caixa de desova na noite anterior à exposição, mantendo a relação sexual em 1:1.
  2. Remova o peixe adulto de volta ao sistema 30-60 min após o amanhecer na manhã seguinte.
  3. Remova os embriões para fora da caixa de desova.
  4. Enxágüe os embriões com água do sistema.
  5. Transfira os embriões para uma placa de petri de vidro (9 cm de diâmetro) com água suficiente do sistema.
  6. Observe os embriões o microscópio e selecione embriões saudáveis para exposição posterior.
    NOTA: Embriões saudáveis geralmente são transparentes com cor dourada clara o microscópio. Os embriões insalubres são geralmente pálidos e agrupados como observado o microscópio.

2. Preparação antes da exposição

  1. Prepare a solução dos Hanks de acordo com as diretrizes do livro zebrafish31.
    NOTA: A solução do Hanks inclui 0,137 M NaCl, 5,4 mM KCl, 0,25 mM Na2HPO4, 0,44 mM KH2PO4, 1,3 mM CaCl2, 1,0 mM MgSO4, e 4,2 mM NaHCO3.
  2. Diluir a solução do Hanks para 10% da solução de Hanks usando água estéril.
  3. Adicione 1 mL de DMSO em 999 mL de 10% de solução de Hanks para fazer uma solução de controle de 10% da solução de Hanks, incluindo 0,1% dmSO.
    NOTA: Os próximos passos usam o BDE-47 como exemplo de uma solução de exposição.
  4. Dissolva 5 mg do BDE-47 puro em 1 mL de 100% DMSO para fazer uma solução de exposição padrão de 5 mg/mL.
  5. Vórtice a solução de 5 mg/mL por 1 min para dissolver completamente o BDE-47 no DMSO.
  6. Transfira 10 μL da solução de 5 mg/mL para uma garrafa de vidro marrom de 12 mL.
  7. Adicione água esterilizada a um volume final de 10 mL para fazer a concentração da solução de exposição BDE-47 5 mg/L e dmSO em 0,1%, depois vórtice por 1 min.
  8. Transfira 10 μL e 100 μL da solução de 5 mg/L em dois frascos volumétricas de 100 mL, respectivamente.
  9. Adicione 10% da solução de Hanks, incluindo 0,1% dmSO (preparado na etapa 2.3) a 100 mL para fazer as concentrações finais das soluções de exposição BDE-47 5 μg/L e 50 μg/L, respectivamente.
  10. Transfira as soluções para garrafas de vidro marrom de 100 mL e guarde-as a 4 °C.

3. Exposição de embriões

  1. Transfira ~50 embriões para cada uma das três placas de petri de vidro (6 cm de diâmetro) 3-5 horas após a fertilização (hpf).
  2. Use uma ponta de tubulata de 1 mL para manchar a água do sistema ao redor dos embriões.
  3. Use uma pipeta para transferir o controle e duas soluções de exposição BDE-47 (controle, 5 μg/L, 50 μg/L) para os três pratos de Petri de vidro, respectivamente.
  4. Agite os pratos de petri de vidro suavemente um a um para fazer os embriões se dispersarem no fundo da placa.
  5. Coloque as placas de petri de vidro na incubadora de luz abaixo de 28,5 °C.
  6. Renovar metade das soluções de exposição a cada 24 h até 5 dpf.
  7. Verifique os embriões mortos de cada grupo em 1 dpf e 2 dpf e calcule a taxa de mortalidade.
  8. Verifique os embriões incubados de cada grupo em 2 dpf e 3 dpf e calcule a eclosão.
  9. Verifique a deformidade das larvas todos os dias depois que elas saem da corção e calculem a taxa de deformidade de cada grupo.
    NOTA: Os indicadores de deformidade incluem cisto pericárdico, curvatura espinhal, curvatura da cauda, entre outros fatores32.

4. Preparação para o teste de comportamento

  1. Prepare uma microplaca de 48 poços para o teste de locomoção e ângulo de caminho e três 6 microplacas de poço para o teste de atividade social na manhã de 5 dpf.
  2. Transfira 800 μL de solução de exposição para todos os poços da microplaca de poços 48.
    NOTA: Use 16 poços para cada grupo (ou seja, a solução de controle, 5 μg/L e 50 μg/L grupo).
  3. Use uma ponta de pipette de 1 mL para transferir 200 μL de solução de exposição com uma larva da placa de petri de vidro em um poço da microplaca de 48 poços.
  4. Transfira 4 mL de solução de exposição para cada poço da microplaca de 6 poços.
    NOTA: Use uma microplaca 6 poço para cada grupo.
  5. Use uma ponta de pipette de 1 mL para transferir 200 μL de solução de exposição com duas larvas em cada poço da microplaca de 6 poços.
    NOTA: Cada grupo tem seis grupos repetitivos.
  6. Certifique-se de que a temperatura da sala de testes é de 28 °C 2 h antes do teste.
    NOTA: Os testes comportamentais geralmente são realizados à tarde.

5. Teste comportamental

  1. Teste de locomoção e ângulo de caminho
    1. Clique no ícone do launcher na mesa do computador para abrir o software (ver Tabela de Materiais)que controla o gabinete de monitoramento de alto nível para iniciar o programa.
    2. Escolha o módulo "Rastreamento, Rotações, Ângulos de Caminho" para inserir a interface operacional.
    3. Transfira a microplaca 48 bem preparada na etapa 4.3 para a plataforma de gravação e puxe a tampa.
    4. Clique no botão "File"" Gerar Protocolo" por sua vez no software para começar a gerar um novo protocolo.
    5. Entrada "48" na posição "Contagem de Localização" e clique no botão "OK".
    6. Clique no botão "Parâmetros"" Parâmetros de Protocolo" "Tempo" por sua vez no software. Definir a duração do experimento por 1h e 10 min e definir o período de integração para 60 s33.
    7. Desenhe as áreas detectadas.
      1. Selecione a forma elíptica e desenhe o primeiro círculo ao redor do primeiro topo esquerdo bem.
      2. Selecione o círculo, clique no botão "Copy"Top-Right Mark"Paste"Select" por sua vez, e use o mouse para arrastar o círculo copiado para a parte superior direito bem.
      3. Selecione o círculo, clique no botão " Copiar "BottomMark "Paste"Select" por sua vez, e use o mouse para arrastar o círculo copiado para a parte inferior bem.
      4. Clique no botão "Build"" Clear marks" por sua vez.
        NOTA: O sistema desenhará automaticamente todos os outros poços da placa. As áreas recém-criadas devem perfeitamente caber-se em cada poço entre os peixes reais e sua reflexão sobre o lado do poço.
    8. Clique no botão "Escala de Saque", desenhe uma linha de calibração na tela (um caminho diagonal ou paralelo ao lado da microplaca), digite seu comprimento e defina a "Unidade". Em seguida, clique no botão"Aplicar em grupo".
    9. Coloque a cor animal em "Preto" no software.
    10. Defina o limiar de detecção em 16-18 para permitir a detecção dos animais.
    11. Entrada inativa/pequena e pequena/grande velocidade a 0,5 cm/s e 2,5 cm/s, respectivamente.
    12. Defina as classes de ângulo de caminho. Entrada "-90, -30, -10, 0, 10, 30 e 90" para fazer classes de ângulo de caminho de -180°-+180°.
    13. Definir as condições de luz
      1. Clique no botão "Parâmetros"" Condução leve" " Usa um dos 3 métodos deacionamento abaixo"Estímulos aprimorados" por sua vez para definir as condições de luz.
      2. Escolha o botão "Edge", em seguida, definir um período escuro de 10 min, seguido por três ciclos de 10 min de luz alternada e períodos escuros.
    14. Salve o protocolo e abaixe a luz da sala de testes.
    15. Acclimate as larvas no sistema por 10 min e clique no botão "Experiment" "Execute" por sua vez, escolha a pasta onde os arquivos do experimento são salvos e digite o nome do resultado.
    16. Clique no botão "Background"Start" por sua vez para iniciar o teste.
    17. Clique no botão "Experiment"Stop" por sua vez para parar o experimento quando o teste terminar.
      NOTA: O sistema mostra os dados testados quando o sistema pára. Os dados incluem a distância rastreada em três classes de velocidade e números de ângulo de caminho em oito classes angulares de cada minuto. Para o teste de locomoção no exemplo apresentado, a distância total em cada período de luz (10 min) é calculada e a diferença entre o grupo controle e os grupos de tratamento comparados.
    18. Transfira a microplaca 48 de volta para a incubadora de luz para outros experimentos.
  2. Teste de atividade social
    1. Clique no ícone do launcher na mesa do computador para abrir o software que controla o gabinete de monitoramento de alto nível para iniciar o programa.
    2. Escolha o módulo "Interações Sociais" para inserir a interface operacional.
    3. Transfira a microplaca preparada 6 poços (grupo controle) na etapa 4.4 para a plataforma de gravação e puxe a tampa.
    4. Clique no botão "File"" Gerar Protocolo" por sua vez no software para começar a gerar um novo protocolo.
    5. Entrada "6" na posição "Contagem de Localização" e clique no botão "OK".
    6. Clique no botão "Parâmetros"" Parâmetros de Protocolo" "Tempo" por sua vez no software. Definir a duração do experimento por 1h e 10 min e definir o período de integração para 60 s.
    7. Desenhe as áreas detectadas.
      1. Selecione a forma elíptica e desenhe o primeiro círculo ao redor do primeiro topo esquerdo bem.
      2. Selecione o círculo, clique no botão "Copy"Top-Right Mark"Paste"Select" por sua vez, e use o mouse para arrastar o círculo copiado para o topo-direito bem.
      3. Selecione o círculo, clique no botão " Copiar "BottomMark "Paste"Select" por sua vez, e use o mouse para arrastar o círculo copiado para a parte inferior bem.
      4. Clique no botão "Build"" Clear marks" por sua vez.
        NOTA: As áreas recém-criadas devem se encaixar perfeitamente e entre as larvas reais e sua reflexão na lateral do poço.
    8. Clique no botão "Escala de Saque", desenhe uma linha de calibração na tela (um caminho diagonal ou paralelo ao lado da microplaca), digite seu comprimento e defina a "Unidade". Em seguida, clique no botão"Aplicar em grupo".
    9. Defina o limiar de detecção em 16-18 para permitir a detecção dos animais.
    10. Clique no botão "Animal Negro" no software.
    11. Escolha o botão "Limiar de Distância" e entrada "5" no software.
    12. Afina as condições de luz.
      1. Clique no botão "Parâmetros"" Condução leve" " Usa um dos 3 métodos deacionamento abaixo"Estímulos aprimorados" por sua vez para definir as condições de luz.
      2. Escolha o botão "Edge", em seguida, definir um período escuro de 10 min, seguido por três ciclos de 10 min de luz alternada e períodos escuros.
    13. Salve o protocolo e abaixe a luz da sala.
    14. Acclimate as larvas no sistema por 10 min e clique no botão "Experiment" "Execute" por sua vez, escolha a pasta onde os arquivos do experimento são salvos e digite o nome do resultado.
    15. Clique no botão "Background"Start" por sua vez para iniciar o teste.
    16. Clique no botão "Experiment"Stop" por sua vez para parar o experimento no software quando o teste terminar.
      NOTA: O sistema mostra os dados testados quando o sistema pára.
    17. Transfira a microplaca 6 poço (grupo controle) de volta para a incubadora de luz para outros experimentos.
    18. Transfira as 6 microplacas de poço (5 μg/L e 50 μg/L) por sua vez para a plataforma de gravação e repita os passos de 5.2.4 para 5,2,17 por ordinal.

6. Análise de dados

  1. Abra o arquivo de planilha nos resultados da locomoção e ângulo de caminho.
  2. Selecione as três colunas de distância (inadist, smldist, bandista) e adicione-as.
    NOTA: Os dados de inadist, smldiste banha significam diferentes distâncias registradas pelo sistema em diferentes classes de velocidade (inativa/pequena/grande), respectivamente.
  3. Para cada período de luz de 10 minutos soma a distância de cada poço, calcule a distância média de 16 poços e compare os dados dos três grupos estímulos leves.
  4. Para cada período de luz de 10 minutos soma o número de ângulo de cada poço em cada duração leve de cl01 a cl08 por sua vez, e compare os dados dos três grupos estímulos leves.
    NOTA: Os dados das colunas do CL01 ao CL08 significam diferentes números de ângulo de caminho registrados pelo sistema em diferentes ângulos de caminho, respectivamente.
  5. Abra o arquivo de planilha nos resultados da atividade social.
  6. Selecione as colunas contct e contdur, e para cada período de luz de 10 min soma os tempos sociais e sua duração para cada poço.
  7. Calcule os tempos sociais médios e a duração de um grupo em cada duração leve e compare os dados dos três grupos estímulos leves.

Resultados

Aqui, descrevemos um protocolo para estudar os efeitos neurocomportamentais de poluentes ambientais usando larvas de zebrafish estímulos leves. A locomoção, o ângulo de caminho e os testes de atividade social são definidos na introdução. A configuração das microplacas nos testes de locomoção e ângulo de caminho e as imagens do software são mostradas abaixo. Além disso, nossos próprios resultados de pesquisa são apresentados como exemplos. Dois estudos apresentam os efeitos...

Discussão

Este trabalho fornece um protocolo experimental detalhado para avaliar a neurotoxicidade dos poluentes ambientais usando larvas de zebrafish. Os zebrafish passam pelo processo de embriões a larvas durante o período de exposição, o que significa que o bom cuidado dos embriões e larvas é essencial. Qualquer coisa que afete o desenvolvimento dos embriões e larvas pode influenciar o resultado final. Aqui, o ambiente cultural, o processo de exposição e as condições experimentais são discutidos para garantir o suce...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores são gratos pelo apoio financeiro da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (21876135 e 21876136), pelo Projeto Nacional de Ciência e Tecnologia da China (2017ZX07502003-03, 2018ZX07701001-22), fundação do MOE-Xangai Laboratório-Chave de Saúde Ambiental da Criança (CEH201807-5) e Conselho sueco de Pesquisa (nº 639-2013-6913).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
48-well-microplateCorning3548Embyros housing
6-well-microplateCorning3471Embyros housing
BDE-47AccuStandard5436-43-1Pollutant
DMSOSigma67-68-5Cosolvent
MicroscopeOlympusSZX 16Observation instrument
PipetteEppendorf3120000267Transfer solution
ZebraboxViewpointZebraBoxBehavior instrument
ZebrafishShanghai FishBio Co., Ltd.TubingenZebrafish supplier
ZebraLabViewpointZebraLabBehavior software

Referências

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