제브라피시 유충에 대한 환경 오염물질의 신경행동 효과 연구

요약

이 논문에서는 제브라피쉬 유충 모델을 이용한 환경 오염물질의 신경행동 독성 평가를 위한 상세한 실험 프로토콜이 제시되며, 여기에는 노출 과정과 신경행동 지표에 대한 테스트가 포함된다.

초록

최근 몇 년 동안 점점 더 많은 환경 오염 물질이 특히 유기체의 초기 개발 단계에서 신경 독성이 입증되었습니다. 얼룩말유충은 환경 오염 물질의 신경 행동 연구를위한 탁월한 모델입니다. 여기서, 배아의 수집, 노출 과정, 신경행동지표, 시험과정 등을 포함하는 제브라피쉬 유충을 이용한 환경오염물질의 신경독성평가를 위한 상세한 실험 프로토콜이 제공되고, 데이터 분석을 제공합니다. 또한, 배양 환경, 노출 과정 및 실험 조건은 분석의 성공을 보장하기 위해 논의된다. 이 프로토콜은 정신 병증 약물의 개발, 환경 신경 독성 오염 물질에 대한 연구에 사용되었으며, 해당 연구를 수행하거나 기계론 적 연구에 도움이되도록 최적화 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 제브라피시 유충에 대한 신경 행동 효과를 연구하기 위한 명확한 작동 과정을 보여주며 다양한 신경 독성 물질 이나 오염 물질의 효과를 밝힐 수 있습니다.

서문

최근 몇 년 동안 점점 더 많은 환경 오염 물질이 신경 독성^1,2,3,4로입증되었습니다. 그러나, 환경 오염 물질에 노출 된 후 생체 내에서 신경 독성의 평가는 내분비 중단 또는 발달 독성만큼 쉽지 않다. 또한, 오염 물질에 대한 조기 노출, 특히 환경 관련 용량에서, 독성 연구에서 증가 관심을 끌고있다^5,6,7,8.

Zebrafish는 환경 오염 물질에 노출 된 후 초기 개발 중에 신경 독성 연구에 적합한 동물 모델로 설립되고 있습니다. 얼룩말물고기는 수정 후 다른 종보다 빠르게 발달하는 척추동물입니다. 유충은 융모의 영양소가 7일 동안 유지하기에 충분하기 때문에 먹이를 줄 필요가 없다(dpf)^9. 유충은 ~2 dpf에서 융모에서 나오고3-4 dpf^{14, 15,16, 17,18에서}시작하여 행동 계기^{10,11,12,13을} 사용하여 관찰, 추적, 정량화 및 분석할 수 있는 수영 및 선회등의 행동을 개발한다. 또한 동작 계측기에서도 높은 처리량 테스트를 실현할 수 있습니다. 따라서, 제브라피쉬 유충은 환경오염물질^19의신경행동연구에 뛰어난 모델이다. 여기서, 프로토콜은 빛 자극하에 제브라피시 유충에 대한 환경 오염 물질의 신경 행동 독성을 연구하기 위해 높은 처리량 모니터링을 사용하여 제공됩니다.

우리 실험실은 2,2',4,4'-테트라 브로 모디 페닐 에테르 (BDE-47)^20,21,6'-Hydroxy / 메톡시 -2,2', 4,4'-te의 신경 행동 독성을 연구했습니다. 트라브로모모디페닐 에테르(6-OH/MeO-BDE-47)^22,데카 브롬화 디페닐 에테르(BDE-209), 납, 및 상업적 염소처리된 파라핀(23)을 제시된 프로토콜을 사용한다. 많은 실험실은 또한 애벌레 또는 성인 물고기에 다른 오염 물질의 신경 행동 효과를 연구하기 위해 프로토콜을 사용^24,25,26,27. 이러한 신경행동 프로토콜은 비스페놀 A및 치환비스페놀 S에 저용량 노출이 배아^{제브라피시(27)에서}조기 시상하부 신경발생을 유도한다는 것을 보여주는 기계적 지원을 제공하는 데 사용되었다. 또한 일부 연구자들은 해당 연구를 수행하기 위해 프로토콜을 최적화했습니다. 최근 연구는 카제인 코팅 금 나노 입자 (βCas AuNPs)를 사용하여 쉽게, 높은 처리량 제브라피시 모델에서 아밀로이드 베타 (Aβ)의 독성을 제거했다. βCas AuNPs는 제브라피쉬 유충및 격리된 내측 Aβ42의 혈액-뇌 장벽을 가로질러 전이되는 전신 순환에서 βCas AuNPs가 행동^{병리학28에}의해 지지된 비특이적, 샤페론 유사 방식으로 독성을 유도하는 것으로 나타났다.

운동, 경로 각도 및 사회 활동은 제시된 프로토콜에서 오염물질에 노출된 후 제브라피시 유충의 신경 독성 효과를 연구하는 데 사용되는 세 가지 신경 행동 지표이다. 운동은 유충의 수영 거리에 의해 측정되고 오염 물질에 노출 된 후 손상 될 수 있습니다. 경로 각도 및 사회 활동은 뇌및 중추^{신경계(29)의}기능과 더 밀접하게 관련되어 있다. 경로 각도는 수영^{방향(30)을}기준으로 동물 운동 경로의 각도를 의미한다. ~-180°~+180°의 8개의 각도 클래스가 시스템에 설정되어 있습니다. 비교를 단순화하기 위해 최종 결과의 6 개 클래스는 일상적인 회전 (-10 ° ~ ~ 0 ° ~ + 10 °), 평균 회전 (-10 ° ~ ~ - 90 ° , + 90 ° ), 응답 회전 (-180 ° ~ ~ - 90 °, +90 ° ~ + 180 °)으로 정의됩니다^22. 두 물고기 사회 활동은 그룹 shoaling 행동의 기본; 여기서 유효한 두 애벌레 사이의 거리 (0.5 cm)는 사회적 접촉으로 정의됩니다.

여기에 제시된 프로토콜은 제브라피시 유충에 대한 신경 행동 효과를 연구하기 위한 명확한 과정을 보여주고 다양한 물질 또는 오염 물질의 신경 독성 효과를 밝히는 방법을 제공합니다. 이 프로토콜은 환경 오염 물질의 신경 독성을 연구하는 데 관심이있는 연구자에게 도움이 될 것입니다.

프로토콜

이 프로토콜은 동지대학교 동물윤리위원회의 승인을 받은 지침에 따른 것입니다.

1. 제브라피쉬 배아 수집

1. 노출 전날 밤에 건강한 성인 튜빙겐 제브라피시 2쌍을 산란상자에 넣고 성비를 1:1로 유지합니다.
2. 다음날 아침 일광 후 30-60 분 시스템에 다시 성인 물고기를 제거합니다.
3. 산란 상자에서 배아를 제거합니다.
4. 배아를 시스템 물로 헹구고 있습니다.
5. 충분한 시스템 물로 유리 페트리 접시 (직경 9cm)에 배아를 전송합니다.
6. 현미경의 밑에 태아를 관찰하고 나중에 노출을 위한 건강한 태아를 선택하십시오.
   참고 : 건강한 배아는 일반적으로 현미경 아래에서 밝은 황금색으로 투명합니다. 건강에 해로운 태아는 일반적으로 창백하고 현미경의 밑에 관찰된 것과 같이 함께 뭉쳐집니다.

2. 노출 전 준비

1. 제브라피쉬북^31의가이드라인에 따라 행크스의 용액을 준비한다.
   참고 : 행크스의 솔루션은 0.137 M NaCl, 5.4 mM KCl, 0.25 mM Na₂HPO_4,0.44 mM KH₂PO_4,1.3 mM CaCl_2,1.0 mM MgSO_4,및 4.2 mM NaHCO_3를포함합니다.
2. 멸균수를 사용하여 행크스용액을 10% 행크스용액으로 희석합니다.
3. 10% 행크스 솔루션의 999mL에 DMSO 1mL를 추가하여 0.1% DMSO를 포함한 10% 행크스 솔루션의 제어 솔루션을 만듭니다.
   참고: 다음 단계에서는 노출 솔루션의 예로 BDE-47을 사용합니다.
4. 100% DMSO의 1 mL에 깔끔한 BDE-47 5 mg을 용해하여 5 mg/mL의 표준 노출 솔루션을 만듭니다.
5. 5 mg/mL 용액을 1분 동안 소용돌이하여 DMSO에서 BDE-47을 완전히 용해시다.
6. 5 mg/mL 용액의 10 μL을 12 mL 갈색 유리 병에 옮김.
7. 멸균수를 최종 부피 10 mL에 추가하여 BDE-47 노출 용액 5 mg/L 및 DMSO 비율을 0.1%로 한 다음 1분 동안 소용돌이를 만듭니다.
8. 5 mg/L 용액의 10 μL 및 100 μL을 각각 2개의 100 mL 체적 플라스크로 옮김으로 옮김.
9. BDE-47 노광 용액의 최종 농도를 만들기 위해 0.1% DMSO(2.3단계에서 제조)를 포함한 10% 행크스 용액을 각각 5 μg/L 및 50 μg/L로 추가합니다.
10. 100 mL 갈색 유리 병에 솔루션을 전송하고 4 °C에 저장합니다.

3. 배아 노출

1. ~50개의 배아를 각각 3개의 유리 페트리 접시(직경 6 cm)로 옮기고 3-5시간 후 수정(hpf)한다.
2. 1 mL 파이펫 팁을 사용하여 배아 주위의 시스템 물을 얼룩지도록 하십시오.
3. 파이펫을 사용하여 컨트롤과 2개의 BDE-47 노출 솔루션(제어, 5 μg/L, 50 μg/L)을 각각 3개의 유리 페트리 접시에 옮니다.
4. 유리 페트리 접시를 하나씩 부드럽게 흔들어 배아가 접시 바닥에 흩어지도록 합니다.
5. 유리 페트리 접시를 28.5 °C 이하의 광 인큐베이터에 넣습니다.
6. 노출 솔루션의 절반을 24시간마다 5dpf까지 갱신합니다.
7. 1 dpf 및 2 dpf에 있는 모든 단의 죽은 태아를 확인하고 죽음 비율을 계산합니다.
8. 2 dpf 및 3 dpf에 모든 그룹의 배양 배아를 확인하고 해치가능성을 계산합니다.
9. 그들은 chorion에서 나온 후 매일 애벌레의 기형을 확인하고 모든 그룹의 기형 속도를 계산합니다.
   참고 : 기형 지표는 다른 요인 중 심낭 낭종, 척추 곡률, 꼬리 곡률, 다른 요인^32을포함한다.

4. 행동 시험 준비

1. 운동 및 경로 각도 시험을 위한 48개의 웰 마이크로플레이트와 5 dpf의 아침에 사회 활동 시험을 위한 3개의 6개의 웰 마이크로플레이트를 준비한다.
2. 48 개의 웰 마이크로 플레이트의 모든 웰에 800 μL의 노출 용액을 전달합니다.
   참고: 모든 그룹(예: 대조군, 5 μg/L 및 50 μg/L 그룹)에 16개의 웰을 사용합니다.
3. 1 mL 파이펫 팁을 사용하여 유리 페트리 접시에서 1 개의 유충으로 200 μL의 노출 용액을 48 개의 웰 마이크로 플레이트 중 하나의 우물로 옮김을 사용하십시오.
4. 6 웰 마이크로 플레이트의 모든 웰에 노출 용액 4 mL을 전송합니다.
   참고: 모든 그룹에 6개의 웰 마이크로플레이트 를 사용하십시오.
5. 1 mL 파이펫 팁을 사용하여 200 μL의 노출 용액을 2 개의 유충으로 6 개의 웰 마이크로 플레이트의 각 우물로 옮김을 옮김.
   참고: 모든 그룹에는 6개의 반복 그룹이 있습니다.
6. 시험실의 온도가 시험 전에 28°C 2시간인지 확인하십시오.
   참고: 행동 시험은 일반적으로 오후에 수행됩니다.

5. 행동 테스트

1. 운동 및 경로 각도 테스트
   1. 컴퓨터 책상에 있는 런처 아이콘을 클릭하여 프로그램을 시작하기 위해 고처리량 모니터링 인클로저를 제어하는 소프트웨어(재료 표참조)를 엽니다.
   2. "추적, 회전, 경로 각도" 모듈을선택하여 작동 인터페이스에 들어갑니다.
   3. 4.3단계에서 제조된 48개의 웰 마이크로플레이트를 기록 플랫폼으로 옮기고 커버를 아래로 당긴다.
   4. 소프트웨어에서"파일" " 생성프로토콜" 버튼을 차례로 클릭하여 새 프로토콜 생성을 시작합니다.
   5. 입력 "48"위치 수" 위치에"확인" 버튼을 클릭합니다.
   6. 소프트웨어에서 차례로 "매개 변수 " " "프로토콜 매개 변수" "시간" 버튼을클릭합니다. 실험 기간을 1시간 10분으로 설정하고 통합 기간을 60s^33으로설정합니다.
   7. 감지된 영역을 그립니다.
      1. 타원형 모양을 선택하고 왼쪽 상단의 첫 번째 원을 잘 그립니다.
      2. 원을 선택하고"복사" "오른쪽 상단 표시" " " " " " " " 버튼을 차례로선택하고복사 된 원을 오른쪽 상단으로 드래그합니다.
      3. 원을 선택하고"복사"하단 표시""" " " " " 버튼을 차례로선택하고마우스를 사용하여 복사 된 원을 오른쪽 하단으로 드래그합니다.
      4. 차례로"빌드" " " "지우기" 버튼을 클릭합니다.
         참고 : 시스템은 자동으로 플레이트의 다른 모든 우물을 그립니다. 새로 생성 된 지역은 실제 물고기와 우물의 측면에 반사 사이의 각 잘 맞습니다.
   8. "배율 그리기"버튼을 클릭하고 화면에 보정 선(대각선 경로 또는 마이크로플레이트 측면에 평행)을 그리고 길이를 입력하고"단위"를설정합니다. 그런 다음"그룹에 적용" 버튼을 클릭합니다.
   9. 소프트웨어에서 동물 색을"검은색"으로설정합니다.
   10. 동물의 검출을 허용하도록 검출 임계값을 16-18로 설정한다.
   11. 각각 0.5cm/s 및 2.5cm/s의 비활성/소형 및 소형/대형 속도를 입력합니다.
   12. 경로 각도 클래스를 설정합니다. 입력 "-90, -30, -10, 0, 10, 30 및 90" 경로 각도 클래스를 -180°-+180°에서 만듭니다.
   13. 조명 조건 설정
       1. "매개변수""" " " " "아래의 3 가지 트리거링 방법 중 하나를 사용하여" 향상된자극" 버튼을 차례로 클릭하여 조명 조건을 설정합니다.
       2. "가장자리"버튼을 선택한 다음 10분의 어두운 기간을 설정한 다음 10분 의 빛과 어두운 기간을 번갈아 가며 3주기로 설정합니다.
   14. 프로토콜을 저장하고 테스트 룸의 빛을 거절.
   15. 시스템의 애벌레를 10분 동안 적응시키고"실험" "실행" 버튼을 차례로 클릭한 다음 실험 파일이 저장된 폴더를 선택하고 결과 이름을 입력합니다.
   16. 테스트를 시작하려면 차례로"배경" " "시작"버튼을 클릭합니다.
   17. "실험" "" 중지"버튼을 차례로 클릭하여 테스트가 종료되면 실험을 중지합니다.
       참고: 시스템이 중지될 때 테스트된 데이터가 시스템에 표시됩니다. 이 데이터에는 3개의 속도 클래스에서 추적된 거리와 분마다 8개의 각도 클래스에서 경로 각도 번호가 포함됩니다. 제시된 실시예에서 운동 시험의 경우, 모든 광주기(10분)의 총 거리가 계산되고 대조군과 치료기 간의 차이를 비교한다.
   18. 다른 실험을 위해 48개의 웰 마이크로플레이트를 다시 광 인큐베이터로 옮김을 옮김을 옮김을 한다.
2. 사회 활동 테스트
   1. 컴퓨터 데스크의 런처 아이콘을 클릭하여 고처리량 모니터링 인클로저를 제어하는 소프트웨어를 열어 프로그램을 시작합니다.
   2. 운영 인터페이스를 입력하려면"사회적 상호 작용"모듈을 선택합니다.
   3. 준비된 6개의 웰 마이크로플레이트(대조군)를 4.4단계에서 기록 플랫폼으로 옮기고 커버를 아래로 당긴다.
   4. 소프트웨어에서"파일" " 생성프로토콜" 버튼을 차례로 클릭하여 새 프로토콜 생성을 시작합니다.
   5. 입력 "6" "위치 수" 위치에서 "확인" 버튼을 클릭합니다.
   6. 소프트웨어에서 차례로 "매개 변수 " " "프로토콜 매개 변수" "시간" 버튼을클릭합니다. 실험 기간을 1시간 10분으로 설정하고 통합 기간을 60초로 설정합니다.
   7. 감지된 영역을 그립니다.
      1. 타원형 모양을 선택하고 왼쪽 상단의 첫 번째 원을 잘 그립니다.
      2. 원을 선택하고"복사" "오른쪽 상단 표시" " " " " " " 버튼을 차례로선택하고복사 된 원을 오른쪽 상단으로 드래그합니다.
      3. 원을 선택하고"복사"하단 표시""" " " " " 버튼을 차례로선택하고마우스를 사용하여 복사 된 원을 오른쪽 하단으로 드래그합니다.
      4. 차례로"빌드" " " "지우기" 버튼을 클릭합니다.
         참고 : 새로 생성 된 영역은 잘 잘 실제 애벌레와 우물의 측면에 반사 사이에 각각 잘 맞아야합니다.
   8. "배율 그리기"버튼을 클릭하고 화면에서 보정 선을 그립니다(대각선 경로 또는 마이크로플레이트 측면에 평행), 길이를 입력하고"단위"를설정합니다. 그런 다음"그룹에 적용" 버튼을 클릭합니다.
   9. 동물의 검출을 허용하도록 검출 임계값을 16-18로 설정한다.
   10. 소프트웨어에서"검은 색 동물" 버튼을 클릭합니다.
   11. 소프트웨어에서"거리 임계값"버튼과 입력 "5"를 선택합니다.
   12. 조명 조건을 설정합니다.
       1. "매개변수""" " " " "아래의 3 가지 트리거링 방법 중 하나를 사용하여" 향상된자극" 버튼을 차례로 클릭하여 조명 조건을 설정합니다.
       2. "가장자리"버튼을 선택한 다음 10분의 어두운 기간을 설정한 다음 10분 의 빛과 어두운 기간을 번갈아 가며 3주기로 설정합니다.
   13. 프로토콜을 저장하고 방의 빛을 거절.
   14. 시스템의 애벌레를 10분 동안 적응시키고"실험" "실행" 버튼을 차례로 클릭한 다음 실험 파일이 저장된 폴더를 선택하고 결과 이름을 입력합니다.
   15. 테스트를 시작하려면 차례로"배경" " "시작"버튼을 클릭합니다.
   16. 테스트가 끝나면"실험" "" 중지" 버튼을 차례로 클릭하여 소프트웨어에서 실험을 중지합니다.
       참고: 시스템이 중지될 때 테스트된 데이터가 시스템에 표시됩니다.
   17. 6웰 마이크로플레이트(대조군)를 다른 실험을 위해 광 인큐베이터로 다시 옮니다.
   18. 6개의 웰 마이크로플레이트(5 μg/L 및 50 μg/L 그룹)를 차례로 기록 플랫폼으로 옮기고 서수별로 5.2.4에서 5.2.17까지의 단계를 반복합니다.

6. 데이터 분석

1. 운동 및 경로 각도 결과에서 스프레드시트 파일을 엽니다.
2. 세 개의 거리 열(inadist, smldist, lardist)을선택하고 추가합니다.
   참고 : inadist, smldist및 lardist의 데이터는 각각 다른 속도 클래스 (비활성 / 작은 / 큰)에서 시스템에 의해 기록 된 다른 거리를 의미합니다.
3. 매 10 분 빛 기간에 대한 모든 우물의 거리를 요약, 16 웰의 평균 거리를 계산하고, 빛 자극에서 세 그룹의 데이터를 비교합니다.
4. 10분마다 광주기마다 cl01에서 cl08까지의 모든 빛 지속 시간의 각도 수를 요약하고, 광 자극 하에 세 그룹의 데이터를 비교한다.
   참고: cl01에서 cl08까지의 기둥 데이터는 시스템에 의해 각각 다른 경로 각도로 기록된 다른 경로 각도 번호를 의미합니다.
5. 소셜 활동 결과에서 스프레드시트 파일을 엽니다.
6. 연속 및 contdur 열을 선택하고, 모든 10 분 빛 기간에 대한 사회적 시간과 모든 우물에 대한 기간을 요약합니다.
7. 모든 빛 지속 시간에 한 그룹의 평균 사회 시간과 기간을 계산하고 빛 자극에서 세 그룹의 데이터를 비교합니다.

결과

여기서, 우리는 빛 자극하에 제브라피쉬 유충을 사용하여 환경 오염 물질의 신경 행동 효과를 연구하기위한 프로토콜을 설명합니다. 운동, 경로 각도 및 사회 활동 테스트는 소개에 정의되어 있습니다. 운동 및 경로 각도 테스트에서 마이크로 플레이트의 설정과 소프트웨어의 이미지는 다음과 같습니다. 또한, 우리 자신의 연구 결과는 예로 제시된다. 2개의 연구 결과는 BD...

토론

이 작업은 제브라피시 유충을 사용하여 환경 오염 물질의 신경 독성을 평가하기 위한 상세한 실험 프로토콜을 제공합니다. Zebrafish는 노출 기간 동안 배아에서 유충으로 과정을 거치므로 배아와 유충을 잘 돌보는 것이 필수적입니다. 배아와 애벌레의 발달에 영향을 미치는 모든 것이 최종 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 여기서 배양 환경, 노출 과정 및 실험 조건은 전체 분석의 성공을 보장하기...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
48-well-microplate	Corning	3548	Embyros housing
6-well-microplate	Corning	3471	Embyros housing
BDE-47	AccuStandard	5436-43-1	Pollutant
DMSO	Sigma	67-68-5	Cosolvent
Microscope	Olympus	SZX 16	Observation instrument
Pipette	Eppendorf	3120000267	Transfer solution
Zebrabox	Viewpoint	ZebraBox	Behavior instrument
Zebrafish	Shanghai FishBio Co., Ltd.	Tubingen	Zebrafish supplier
ZebraLab	Viewpoint	ZebraLab	Behavior software