Induction de lésion diffuse du cerveau axonal chez les rats basés sur l’accélération rotationnelle

Résumé

Ce protocole valide un modèle de rongeur fiable, facile à exécuter et reproductible de lésions axonales diffuses cérébrales (DAI) qui induit des dommages à la matière blanche généralisée sans fractures du crâne ou contusions.

Résumé

Les lésions cérébrales traumatiques (TBI) sont une cause majeure de décès et d’invalidité. Les dommages axonaux diffus (DAI) sont le mécanisme prédominant de blessure dans un grand pourcentage de patients TBI nécessitant une hospitalisation. DAI implique des dommages axonaux répandus de secousses, de rotation ou de dommages de souffle, menant à des dommages rapides d’étirement axonal et aux changements axonaux secondaires qui sont associés à un impact durable sur la récupération fonctionnelle. Historiquement, les modèles expérimentaux de DAI sans blessure focale ont été difficiles à concevoir. Ici, nous validons un modèle de rongeur simple, reproductible et fiable de DAI qui cause des dommages répandus de matière blanche sans ruptures de crâne ou contusions.

Introduction

Les lésions cérébrales traumatiques (TBI) sont une cause majeure de décès et d’invalidité aux États-Unis. Les TBI contribuent à environ 30 % de tous les décès liés aux blessures^1,2. Les principales causes de l’IDT diffèrent d’un groupe d’âge à l’autre et comprennent les chutes, les collisions à grande vitesse pendant les sports, l’automutilation intentionnelle, les accidents de la route et les agressions^1,2,3.

Brain diffuse axonal injury (DAI) is a specific type of TBI induced by rotational acceleration, shaking or blast injury of the brain resulting from unrestricted head movement in the instant after injury^4,5,6,7,8. DAI implique des dommages axonaux répandus menant à une déficience neurologique de longue durée qui est associée à de mauvais résultats, les coûts de soins de santé lourds, et un taux de mortalité de 33-64%^{1,2,4,5,9,10,11}. Malgré des recherches récentes importantes sur la pathogénie de DAI, il n’y a pas eu de consensus sur les meilleures options de traitement^11,12,13,14.

Au cours des dernières décennies, de nombreux modèles expérimentaux ont tenté de reproduire avec précision différents aspects de DAI^11,12,15,16. Cependant, ces modèles ont des limites étant donné la présentation unique de DAI par rapport à d’autres blessures focales. Ces modèles antérieurs causent non seulement des dommages axonaux dans les régions de matière blanche mais entraînent également des lésions cérébrales focales. Cliniquement, DAI est accompagnée de micro-hémorragies, qui peuvent constituer une cause majeure de dommages à la matière blanche.

Il est démontré que seulement deux modèles animaux reproduisent les principales caractéristiques cliniques de l’IDD. Gennarelli et ses collègues ont produit le premier dispositif latéral de rotation de la tête en 1982, en utilisant l’accélération rotationnelle de la tête non-modifiée pour induire le coma avec DAI dans un modèle de primate non humain¹⁵. Ce modèle de primate a employé la rotation simple commandée pour l’accélération et la décélération pour déplacer la tête par 60 'dans 10-20 ms. Cette technique a été capable d’imiter la conscience altérée et les dommages axonaux répandus qui ressemblaient aux effets du TBI grave observé dans les cerveaux humains. Cependant, les modèles de primates sont très chers^4,11,16. Basé en partie sur le modèle précédent, un modèle porcin de l’accélération par rotation des lésions cérébrales a été conçu en 1994 (Ross et al.) avec des résultats similaires¹⁴.

Ces deux modèles animaux, bien qu’ils aient produit différentes présentations de pathologie typique, ont ajouté considérablement aux concepts de pathogénie DAI. La rotation rapide de la tête est généralement acceptée comme la meilleure méthode pour induire DAI, et les rongeurs fournissent un modèle moins coûteux pour les études rapides de rotation de la tête^11,16. Ici, nous validons un modèle simple, reproductible et fiable de rongeur de DAI qui cause des dommages répandus de matière blanche sans ruptures de crâne ou contusions. Ce modèle actuel permettra une meilleure compréhension de la pathophysiologie de dAI et le développement de traitements plus efficaces.

Protocole

Les expériences ont été réalisées à la suite des recommandations des Déclarations d’Helsinki et de Tokyo et des Lignes directrices pour l’utilisation des animaux expérimentaux de la Communauté européenne. Les expériences ont été approuvées par le Comité de soins aux animaux de l’Université Ben-Gourion du Néguev.

1. Préparation des rats à la procédure expérimentale

REMARQUE : Sélectionnez des rats Sprague-Dawley mâles adultes pesant 300-350 g.

1. Obtenir l’approbation pour l’exécution de ces expériences auprès du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux.
2. Maintenir les rats à une température ambiante de 22 à 1 oC, avec 12 heures de lumière et 12 heures de cycles sombres. Fournir du chow de rat et de l’eau ad libitum.
3. Effectuer toutes les expériences entre 6 h et 12 h.
4. Utilisez un système continu d’administration d’isoflurane pour induire l’anesthésie. Assurez-vous que le système de vaporisateur est rempli d’isoflurane.
   1. Anesthésiez les rats avec 2% d’isoflurane.
   2. Confirmez que le rat est entièrement anesthésié en observant un manque de mouvement ou de réflexe de pédale en réponse à un stimulus externe.

2. Induction de lésions axonales diffuses

REMARQUE : L’appareil se compose des composants suivants : 1) cylindre en plastique transparent, 2) poids de fer (1308 g), 3) mécanisme de rotation composé d’un tube cylindrique, de deux roulements sur lesquels l’axe tourne et d’une fixation de tête (pour les épingles d’oreille); 4) plate-forme horizontale sur laquelle sont fixés deux roulements.

1. Placez l’appareil sur une table de laboratoire lourde et stable.
2. Attachez le poids à une ficelle élevée à une hauteur de 120 cm.
3. Laissez le poids qui tombe librement frapper le boulon, en activant le mécanisme de rotation. À l’aide du dispositif de rotation latérale de la tête, la tête du rongeur est rapidement retournée de 0 à 90 degrés.
4. Après l’induction des lésions cérébrales axonales diffuses, transférez le rat dans une salle de réveil.

3. Mesure des paramètres rotatifs Kinematics/Biomécanical.

1. Mesurer la cinématique rotationnelle/paramètres biomécaniques comme suit :
   
   
   
   où F_o - force appliquée à la tête animale (kg); M - moment de force; K - énergie cinétique; m - masse de la chute du poids; g - accélération gravitationnelle; h - hauteur (cm); D - distance entre les broches d’oreille (cm).
   REMARQUE: Pour calculer la force appliquée sur la tête de l’animal (F_o), il est nécessaire de connaître la masse de la chute du poids, la hauteur à laquelle le poids tombe, et la distance entre les broches d’oreille. Les autres paramètres restent inchangés.

4. Évaluation du score de gravité neurologique après 48 heures

REMARQUE : Les déficits neurologiques ont été évalués et classés à l’aide d’un score de gravité neurologique, tel que décrit précédemment^17,18,19. Les modifications de la fonction et du comportement du moteur sont évaluées par un système de points de sorte qu’un score maximum de 24 représente un dysfonctionnement neurologique grave. Un score de 0 indique l’état neurologique intact. Les fonctions comportementales suivantes sont évaluées.

1. Évaluer l’incapacité du rat à sortir d’un cercle (50 cm de diamètre) lorsqu’il est laissé en son centre. Effectuez ceci pendant trois sessions individuelles d’une durée de 30 min, 60 min, et plus de 60 min.
2. Testez le rat pour une perte de réflexe de redressement en trois séances d’une durée de 20 min, 40 min et plus de 60 min.
3. Effectuez le test d’hémiplégie, l’incapacité du rat à résister aux changements forcés de position.
4. Levez le rat par sa queue pour tester la flexion de l’arrière-pays.
5. Placez le rat sur le sol pour tester sa capacité à marcher tout droit.
6. Testez trois réflexes distincts : le réflexe pinna, le réflexe cornéen et le réflexe de sursaut.
7. Évaluez le rat avec une note clinique basée sur la perte de la recherche de comportement et de prostration.
8. Testez les réflexes des membres pour le placement. Effectuez le test sur les membres antérieurs gauche et droit, puis les arrières gauche et droit.
9. Effectuez un test fonctionnel via la tâche d’équilibrage du faisceau. Le faisceau doit mesurer 1,5 cm de large. Exécutez le test pour des sessions de 20 s, 40 s, et plus de 60 s.
10. Effectuez l’essai de marche de faisceau sur le rat avec des faisceaux de trois largeurs différentes : 8.5 cm de large, 5 cm de large, et 2.5 cm de large.

5. Collecte de cerveau pour l’examen histologique après 48 heures

1. À 48 heures après une blessure, euthanasiez les rats en remplaçant leur mélange de gaz inspiré par 20% O₂/80% DE CO₂. Veiller à ce que le CO₂ soit livré à un taux prédéterminé conformément aux lignes directrices du Comité de soins et d’utilisation des animaux institutionnels.
   1. Assurer la confirmation du décès conformément aux lignes directrices du Comité de soins et d’utilisation des animaux institutionnels.
2. Transcardiacally perfuser le rat avec 0,9% saline héparinisée à la température 4 oC, suivie de 500 mL de paraformaldéhyde de 0,1 M en tampon de phosphate (pH 7,4).
3. Après la perfusion, effectuer la décapitation avec une guillotine.
4. Effectuez la collecte du cerveau en enlevant les calvarias avec des forceps de coupe osseuse pour éviter d’endommager le tissu cérébral.
5. Retirer immédiatement le cerveau et fixer dans une solution de formaldéhyde tampon de 4 % pour 48 h à 4 oC.
6. Bloquer les cerveaux en sections coronales de 5 mm du visage olfactif de l’ampoule au cortex visuel et aux cervelets et aux tiges cérébrales de deux fois.
7. Après l’embâmage par la paraffine, couper les sections coronales et sagittales (5 m) du thalamus par sectionnement microtome.

6. Coloration et examen immunochimiques

1. Placer délicatement les tranches sur des toboggans en verre avec une brosse molle, 1 tranche par lame.
2. Produire la coloration immunochimique de l’APP.
   1. Déparaffiniser les tranches de xylène (3 fois pour 5 min chacune) et réhydrailler avec des concentrations graduellement réduites d’éthanol à température ambiante : 3 min en 100% d’éthanol deux fois, 3 min en 95% d’éthanol deux fois, 3 min dans 90% d’éthanol, 3 min dans 70% d’éthanol et 3 min en DDW.
   2. Traiter les sections cérébrales déparaffinisées et réhydratées avec 3 % H₂O₂ pendant 15 min à température ambiante pour bloquer l’activité endogène de peroxidase.
   3. Sections incubés avec 0,01 M de citrate de sodium (pH 6,0) à 98 oC pendant 5 minutes pour la récupération d’antigène.
   4. Garder les lames dans le tampon pendant 20 minutes à température ambiante pour refroidir.
   5. Laver les sections avec la solution saline tamponnée par le phosphate (PBS) deux fois pendant 5 min.
   6. Bloquez les sections avec un sérum normal de cheval de 2,5 % pendant 1 h à température ambiante et incuber toute la nuit à 4 oC dans l’anti-APP primaire de lapin (1:4000) dilué dans le sérum bloquant.
   7. Après l’incubation dans l’anticorps primaire, laver les sections dans PBS à température ambiante.
   8. Incuber les sections dans un anticorps secondaire biotinylé dilué de façon appropriée pendant 15 min et laver avec PBS pendant 3 minutes deux fois à température ambiante.
   9. Incuber en streptavidine-peroxidase pendant 15 min et laver à nouveau dans PBS pendant 3 minutes deux fois à température ambiante.
   10. Sections incubées avec solution de substrat tampon (pH 7.5) contenant du peroxyde d’hydrogène et 3,3-diaminobenzidine chromogen solution et protéger de la lumière jusqu’à ce que la couleur est développée.
   11. Incuber les diapositives avec DDW à température ambiante pendant 5 minutes afin d’arrêter la réaction.
   12. Sections de contre-vente avec hématoxyline pendant 3 min à température ambiante et laver pendant 5 min avec l’eau du robinet qui coule.
   13. Déshydrater les diapositives avec des concentrations d’éthanol progressivement croissantes à température ambiante : 2 min en DDW, 2 min en 70 % d’éthanol, 2 min en 90 % d’éthanol, 2 min en éthanol 95 %, 2 min en 100 % d’éthanol et 3 min en xylène trois fois.
   14. Sécher et monter avec le milieu de montage.
3. Examinez les tranches sous le grossissement de microscope de 200x avec une lentille objective de 20 mm à l’aide d’un microscope.

Résultats

Le tableau 1 illustre le calendrier du protocole. Le taux de mortalité dans ce modèle de DAI était de 0%. Un test Mann-Whitney a indiqué que le déficit neurologique était significativement plus grand pour les 15 rats DAI par rapport aux 15 rats simulés à 48 heures après l’intervention (Mdn - 1 vs 0), U - 22,5, p 'lt; 0.001, r - 0.78 (voir tableau 2). Les données sont mesurées en nombres et sont présentées comme médianes et 25 à 75 percentiles.

Discussion

Ce protocole décrit un modèle de rongeur de DAI. Dans DAI, l’accélération rotationnelle sur le cerveau provoque un effet de cisaillement qui déclenche des changements axonaux et biochimiques qui conduisent à la perte de la fonction axonale dans un processus progressif. Les changements axonaux secondaires sont produits par une blessure rapide d’étirement axonal et sont variables dans leur étendue et la sévérité^4,5,10

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.01 M sodium citrate	SIGMA - ALDRICH
2.5% normal horse serum	SIGMA - ALDRICH	H0146	Liquid
4 % buffered formaldehyde solution
Anti-Amyloid Precursor Protein, C - terminal antibodyproduced in rabbit	SIGMA - ALDRICH	Lot 056M4867V
biotinylated secondary antibody	Vector	BA-1000-1.5	10 mM sodium phosphate, pH 7.8, 0.15 M NaCl, 0.08% sodium azide, 3 mg/ml bovine serum albumin
bone-cutting forceps
DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit (with Nickel), 3,3’-diaminobenzidine	vector laboratory
embedding cassettes
ethanol 99.9 %	ROMICAL		Flammable Liquid
guillotine
Hematoxylin	SIGMA - ALDRICH	H3136-25G
Hydrogen peroxide solution	Millipore	88597-100ML-F
Isofluran, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc
Olympus BX 40 microscope	Olympus
paraffine	paraplast plus leica biosystem		Tissue embedding medium
phosphate-buffered saline (PBS)	SIGMA - ALDRICH	P5368-10PAK	Contents of one pouch, when dissolved in one liter of distilled or deionized water, will yield 0.01 M phosphate buffered saline (NaCl 0.138 M; KCl - 0.0027 M); pH 7.4, at 25 °C.
Streptavidin HRP	ABCAM	ab64269	Streptavidin-HRP for use with biotinylated secondary antibodies during IHC / immunohistochemistry.
xylene