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Résumé

Ce protocole décrit un test non radioactif pour mesurer l’activité de kinase des kinases de polynucléotide (PNK) sur de petits substrats d’ADN et d’ARN.

Résumé

Les kinases polynucléotides (PNK) sont des enzymes qui catalysent la phosphorylation de l’extrémité hydroxyle de 5' de l’ADN et des oligonucléotides d’ARN. L’activité des PNK peut être quantifiée à l’aide d’approches directes ou indirectes. Présenté ici est une approche directe et in vitro pour mesurer l’activité PNK qui repose sur un substrat oligonucléotide fluorescent et l’électrophorèse gel polyacrylamide. Cette approche permet de résoudre les produits phosphorylés tout en évitant l’utilisation de substrats radioétiquetés. Le protocole détaille comment configurer la réaction de phosphorylation, préparer et exécuter de grands gels de polyacrylamide, et quantifier les produits de réaction. La partie la plus techniquement difficile de cet essai est de verser et d’exécuter les grands gels de polyacrylamide; ainsi, des détails importants pour surmonter les difficultés communes sont fournis. Ce protocole a été optimisé pour Grc3, un PNK qui s’assemble en un complexe obligatoire de traitement de l’ARN pré-ribosomal avec son partenaire de liaison, la nucléase Las1. Cependant, ce protocole peut être adapté pour mesurer l’activité d’autres enzymes PNK. En outre, ce test peut également être modifié pour déterminer les effets de différents composants de la réaction, tels que le triphosphate nucléoside, les ions métalliques et les oligonucléotides.

Introduction

Les kinases polynucléotides (PNK) jouent un rôle critique dans de nombreuses voies de traitement de l’ADN et de l’ARN, telles que la réparation de l’ADN et l’assemblage ribosome1,2,3,4,5. Ces enzymes fondamentales catalysent le transfert du monophosphate terminal (gamma) d’un triphosphate nucléoside (NTP, le plus souvent ATP) à l’extrémité hydroxyle de 5' d’un substrat nucléotide. L’un des PNK les plus bien caractérisés est le bactériophage T4 PNK, qui a une large spécificité de substrat et est fortement utilisé par les laboratoires de biologie moléculaire pour l’incorporation d’étiquettes d’isotopes radioactifs sur les 5 terminus d’un substrat d’ADN ou d’ARN6,7,8,9,10,11,12. Un autre exemple d’une enzyme PNK est CLP1, qui se trouve dans Eukarya, Eubactéries, et Archaea, et est impliqué dans plusieurs voies de traitement de l’ARN4,13,14,15.

Historiquement, la plupart des essais qui mesurent l’activité de la kinase polynucléotide dépendent de l’étiquetage des isotopes radioactifs et de l’autoradiographie subséquente5,16. Ces dernières années, un certain nombre d’essais supplémentaires ont été développés pour mesurer l’activité PNK, y compris les approches à molécule unique, électrophorèse micropuce, balises moléculaires, ainsi que colorimétrique et luminescence à base d’essais17,18,19,20,21,22. Bien que bon nombre de ces nouvelles approches offrent des limites de détection améliorées et évitent l’utilisation de la radioactivité, chacune présente des inconvénients, tels que le coût, la dépendance à l’égard de la résine immobilisée et des limitations dans le choix du substrat.

Grc3 est une kinase polynucléotide qui joue un rôle central dans le traitement de l’ARN pré-ribosomal2,3,23. Grc3 forme un complexe obligatoire avec l’endoribonuclease Las1, qui coupe l’Espaceur transcrit interne 2 (ITS2) de l’ARN pré-ribosomal3. Clivage de l’ITS2 par Las1 génère un produit abritant un hydroxyle de 5' qui est ensuite phosphorylé par la kinaseGrc3 3. Pour étudier la spécificité du nucléotide et du substrat de Grc3, un test peu coûteux qui a permis l’essai de différents substrats oligonucléotides a été nécessaire. Par conséquent, un test de phosphorylation PNK utilisant des substrats fluorescents étiquetés a été développé. Cet essai a été utilisé avec succès pour déterminer que Grc3 peut utiliser n’importe quel NTP pour l’activité de transfert de phosphoryl, mais favorise ATP24. Ce protocole adapte l’essai original pour mesurer l’activité PNK de Grc3 sur un omiétisme d’ARN de son substrat d’ARN pré-ribosomal (SC-ITS2, tableau 1). Un aspect difficile de cette approche basée sur la fluorescence est la dépendance sur les grands gels de polyacrylamide pour résoudre efficacement les substrats phosphorylés et non phosphorylés. Le protocole fournit des détails spécifiques sur la façon de verser ces grands gels et d’éviter les pièges communs lors de ce faire.

Travailler avec l’ARN nécessite un soin particulier parce qu’il est fortement sensible à la dégradation. Il existe des mesures préventives simples que l’on peut prendre pour limiter la contamination par la ribonucléase. Un poste de travail d’ARN séparé qui peut être facilement traité avec un agent nettoyant contenant des inhibiteurs de RNase est souvent utile. Il est nécessaire de porter toujours des gants lors de la manipulation d’échantillons et de l’utilisation de consommables certifiés sans RNase. Comme l’eau est une autre source commune de contamination, il est préférable d’utiliser de l’eau fraîchement purifiée et de stériliser toutes les solutions à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.

Protocole

1. Préparation

  1. Préparer la mémoire tampon et les réactifs.
    1. Faire 1x Tampon de réaction en combinant 20 μL de 1 M Tris (pH = 8,0), 40 μL de chlorure de sodium de 5 M, 2,5 μL de chlorure de magnésium de 2 M, 100 μL de 50 % (v/v) de glycérol et 1 mL d’eau sans RNase.
    2. Faire du colorant de chargement d’urée en combinant 4,8 g d’urée, 200 μL de 1 M Tris (pH = 8,0), 20 μL de 0,5 M EDTA (pH = 8,0), 0,5 mL de 1% (w/v) bleu bromophénol, et rNase-free eau pour atteindre un volume total de 10 mL.
    3. Faire 10x tampon TBE en combinant 108 g de base Tris, 55 g d’acide borique, 40 mL de 0,5 M EDTA (pH = 8,0), et rNase-free eau pour atteindre un volume total de 1 L.
    4. Faire 10% (w/v) le persulfate d’ammonium (APS). Pesez 0,5 g d’APS et ajoutez 3 mL d’eau sans RNase pour dissoudre le solide. Ajouter de l’eau sans RNase pour atteindre un volume total de 5 mL. Envelopper le tube dans du papier d’aluminium et stocker la solution à 4 °C.
      REMARQUE : L’APS dissous se désintègre au fil du temps. Remplacez le stock APS de 10 % toutes les 2 semaines.
  2. Obtenir l’enzyme de kinase de polynucléotide.
    1. Acquérir l’enzyme PNK2 pure Las1-Grc3 stockée dans le tampon de réaction (voir étape 1.1.1) dans une concentration de stock de 20 μM. La mémoire tampon de stockage varie en fonction du PNK spécifique.
  3. Préparer le substrat acide nucléique.
    REMARQUE : Ce protocole surveille la phosphorylation 5'-phosphorylation d’un substrat d’ARN 27 nt qui abrite le site de traitement de Las1-Grc3 (site C2) contenu dans le Saccharomyces cerevisiae pré-ribosomal intercrit spacer 2 (SC-ITS2; voir tableau 1)2,25,26.
    1. Synthétiser chimiquement un substrat oligonucléotide d’ARN contenant une extrémité de 5'-hydroxyle avec une étiquette 3'-fluorescente. Le fluorophore sera utilisé pour la visualisation de l’ARN. Assurez-vous que le fluorophore est positionné sur l’extrémité de l’ARN qui n’est pas ciblée pour la phosphorylation. Comme alternative aux sources commerciales, l’étiquetage fluorescent interne et terminal des substrats d’ARN peut être effectué à l’interne à l’aide de protocoles rentables27.
    2. Retirez l’excès de fluorophore de la réaction d’étiquetage de l’ARN par HPLC-purification28.
    3. Resuspendez l’ARN lyophilisé à l’aide d’eau sans RNase à 500 nM.
    4. Conserver les aiquots d’ARN à -80 °C pour un stockage à long terme ou à -20 °C pour le stockage à court terme.
  4. Préparer la série de concentration ATP.
    1. Faire un stock de travail de 20 mM d’ATP à l’aide de reaction buffer (voir étape 1.1.1). Utilisez ce stock de travail pour générer quatre dilutions en série allant de 20 mM à 0,02 mM.
    2. Pour faire la première dilution de la série de concentration, mélanger 1 μL du stock de travail ATP de 20 mM avec 9 μL de tampon de réaction. Il en résultera une dilution 10 fois de l’ATP avec une concentration finale de 2 mM.
    3. Utilisez le stock ATP de 2 mM généré à l’étape 1.4.2 pour faire la prochaine dilution dans la série de concentration. Mélanger 1 μL du stock ATP de 2 mM avec 9 μL de tampon de réaction. Cela fera une nouvelle concentration de stock ATP de 0,2 mM.
    4. Continuer à diluer 1 μL du stock ATP précédent avec 9 μL de tampon de réaction pour faire le stock ATP suivant dans la série de concentration.

2. Réaction in vitro de kinase d’ARN

REMARQUE : Ce test peut être utilisé pour mesurer plusieurs variables telles que le temps, les niveaux de nucléotides ou la concentration enzymatique. Le but de cette expérience est d’évaluer la quantité d’ARN phosphorylé en présence de constantes las1-Grc3 complexe et différents niveaux d’ATP.

  1. Pour chaque réaction de kinase arn-enzyme, combiner 1 μL de substrat d’ARN de 500 nM, 8,3 μL de 130 nM Las1-Grc3 et 0,2 μL de 5 mM EDTA.
    REMARQUE : Si vous effectuez plusieurs réactions, préparez un stock principal du mélange ARN-enzyme et aliquot 9,5 μL de ce mélange principal à chaque tube de réaction.
  2. Commencez l’essai.
    1. Réglez le bloc thermique à 37 °C.
    2. À intervalles de 10 s, mélanger 0,5 μL d’un sous-stock ATP de la série de concentration ATP préparé à l’étape 1.4 avec un mélange ARN-enzyme et placer la réaction dans le bloc thermique de 37 °C.
      REMARQUE : Ajoutez 0,5 μL de tampon de réaction au lieu de l’ATP à un mélange ARN-enzyme pour un contrôle négatif PNK. Utilisez également un autre contrôle nécessaire (c.-à-d. substrat d’ARN en l’absence d’enzyme PNK).
    3. Incuber les réactions pendant 60 min à 37 °C.
      REMARQUE : L’ARN fluorescent est sensible à la lumière; par conséquent, couvrir les réactions avec du papier d’aluminium.
    4. En utilisant le même ordre qu’à l’étape 2.2.2, étancher chaque réaction toutes les 10 s en piquant la réaction avec 10 μL de colorant de chargement d’urée (voir l’étape 1.1.2).
      REMARQUE : En plus de 4 M d’urée, la protéinase K peut être ajoutée à cette étape pour dégrader l’enzyme. Suivez les instructions fournies par le fournisseur pour déterminer le montant requis et les conditions de réaction.
    5. Utilisez immédiatement les réactions d’ARN kinase in vitro éteintes pour l’analyse en aval (voir la section 3) ou stockez-la à -20 °C à analyser ultérieurement.

3. Électrophorèse de gel

  1. Préparer une solution de gel d’urée à 15 % d’acrylamide/8 M.
    ATTENTION : L’acrylamide doit être manipulé avec soin, parce qu’il s’agit d’une neurotoxine. Portez toujours des gants, un manteau de laboratoire et des lunettes lorsque vous le manipulez.
    1. Dans un bécher en verre de 150 mL, combiner 22,5 mL de solution prémélangée 40% d’acrylamide/bis-acrylamide 29:1, 6 mL de 10x TBE (voir étape 1.1.3), 28,8 g d’urée, et l’eau sans RNase à un volume total de 59 mL. Remuer délicatement la solution.
      REMARQUE : Selon la longueur du substrat d’ARN, la modification du pourcentage de polyacrylamide peut améliorer la résolution entre l’ARN non phosphorylé et l’ARN phosphorylé.
    2. Pour dissoudre l’urée, chauffer la solution au micro-ondes pendant 20 s, remuer le liquide et remettre immédiatement la solution au micro-ondes pendant 20 s. Remuer doucement la solution jusqu’à ce que l’urée se dissout complètement.
    3. Refroidissez lentement la solution en plaçant le bécher en verre dans un bain d’eau peu profond contenant de l’eau froide. Assurez-vous que le niveau d’eau froide entourant le bécher de verre est au-dessus du niveau de la solution à l’intérieur du bécher de verre. Cela favorisera un transfert de chaleur efficace. Attends 5 min.
      REMARQUE : Ne continuez pas avec ce protocole si le bécher en verre se sent chaud; l’eau doit être inférieure à 25 °C. S’il se sent encore chaud après 5 min, puis remplacer l’eau dans le bain d’eau avec de l’eau froide fraîche et attendre encore 5 min.
    4. Filtrer et dégazer la solution à l’aide d’une unité de filtration jetable de 0,22 μm pour éliminer les particules et les bulles d’air microscopiques.
  2. Verser le gel de dénaturation.
    1. Utilisez du savon et de l’eau chaude pour nettoyer une plaque de verre courte et longue conçue pour les gels de dimensions globales de 31,0 cm x 38,5 cm. Vaporiser chaque plaque de verre avec 95% d’éthanol et essuyer le verre pour enlever toute humidité.
      REMARQUE : L’une des deux plaques peut être siliconisée pour éviter les dommages au gel lors de la séparation du sandwich en plaque de verre. Cependant, cette étape n’est pas nécessaire car ce protocole est conçu pour visualiser l’ARN sans séparer les plaques de verre.
    2. Placez la longue plaque de verre horizontalement sur le dessus d’une boîte de sorte qu’elle est élevée hors du banc.
      ATTENTION: L’acrylamide est toxique, donc la station de coulée de gel doit être recouverte de papier de banc qui peut absorber tout liquide déversé et être immédiatement placé dans un sac à déchets une fois la procédure terminée.
    3. Placez un espaceur propre de 0,4 mm le long des longs bords de la longue plaque de verre.
    4. Posez la plaque de verre courte au-dessus de la longue plaque et assurez-vous que les bords de la plaque courte, de la plaque longue et des espaceurs sont alignés. Pincez chaque côté à l’aide de trois pinces métalliques espacées uniformément.
    5. Ajouter 24 μL de TEMED à la solution d’urée de 15 % d’acrylamide/8 M préparée à l’étape 3.1 et mélanger la solution.
    6. Ajouter 600 μL de 10 % (w/v) APS (voir étape 1.1.4) à la solution à l’étape 3.2.5 et mélanger délicatement la solution.
    7. Verser immédiatement la solution entre les plaques de verre.
      REMARQUE : Pour éviter les bulles, appuyez sur le verre lorsque la solution est versée.
    8. Ajouter délicatement un peigne propre de 0,4 mm et 32 puits au dessus du sandwich à la plaque de verre.
    9. Laisser un minimum de 30 min pour que l’acrylamide se polymérise.
  3. Exécutez le gel de dénaturation.
    1. Réglez le bloc thermique à 75 °C.
    2. Retirez les pinces métalliques qui tiennent le sandwich à la plaque de verre ensemble et lavez et séchez soigneusement le sandwich à la plaque de verre.
    3. Placez le sandwich en plaque de verre dans l’appareil de gel avec la plaque courte orientée vers l’intérieur.
    4. Préparez un tampon de fonctionnement TBE de 0,5 x en combinant 100 mL de TBE 10x avec 1,9 L d’eau sans RNase. Ajouter 600 mL du tampon en cours d’exécution aux chambres supérieures et inférieures de l’appareil de gel.
    5. Retirez délicatement le peigne et rincez soigneusement les puits à l’aide d’une seringue.
      REMARQUE : Cette étape est essentielle pour enlever l’urée des puits.
    6. Pré-exécuter le gel pendant 30 min à 50 W. La tension est d’environ 2000 V.
      ATTENTION : Cet appareil de gel fonctionne à une puissance élevée et les utilisateurs doivent faire preuve de précaution.
    7. Rincer soigneusement les puits à l’aide d’une seringue.
      REMARQUE : Cette étape est essentielle pour même le chargement de l’échantillon dans les puits.
    8. Pulse tourner les réactions éteintes de l’étape 2.2.5. Incuber ensuite les tubes à 75 °C pendant 3 min. Répétez le spin d’impulsion.
    9. Chargez immédiatement 10 μL d’échantillon par puits et faites couler le gel pendant 3 h à 50 W.
      REMARQUE : L’ARN fluorescent est sensible à la lumière; par conséquent, couvrir l’appareil de gel avec du papier d’aluminium.
  4. Image du gel de dénaturation.
    1. Éteignez l’alimentation et égouttez la chambre supérieure de l’appareil de gel.
    2. Laver et sécher le côté extérieur du sandwich en verre à l’aide de savon et d’eau. Couvrir le sandwich en verre avec du papier d’aluminium tout en transportant le gel.
    3. Montez le sandwich de plaque de verre sur la scène d’un scanner laser capable de détection quantitative et sensible de fluorescence.
      REMARQUE : Ce gel est extrêmement fin pour une résolution maximale. Pour cette raison, ce protocole est conçu pour éviter les difficultés d’enlever le gel du sandwich plaque de verre en visualisant directement l’ARN fluorescent à travers les plaques de verre. L’utilisation de plaques de verre à faible fluorescence disponibles dans le commerce augmentera le signal capté en améliorant le rapport signal/bruit.
    4. Définissez les longueurs d’onde d’excitation et d’émission du scanner laser pour le fluorophore souhaité.
      REMARQUE : Les longueurs d’onde optimales d’excitation et d’émission peuvent différer pour des fluorophores spécifiques. Pour le fluorophore FAM, les longueurs d’onde d’excitation et d’émission sont respectivement de 495 nm et 535 nm.
    5. Définissez la zone à visualiser sur le stade du scanner laser et imagez le gel selon les instructions du fabricant (Figure 1).

4. Analyse d’image et quantification du signal

  1. Chargez l’image de gel numérique acquise à l’étape 3.4.5 dans un logiciel de procesing d’image(voir tableau des matériaux ).
  2. À l’aide du bouton gauche de la souris, cliquez et faites glisser un rectangle pour définir une zone de modèle pour marquer les limites de l’image de gel numérique qui sera utilisée pour quantifier chaque bande d’ARN. La bande d’ARN vue dans le mélange de réaction réglé en l’absence d’enzyme PNK est habituellement une bonne bande pour générer ce modèle.
    REMARQUE : Pour éviter les biais causés par le signal de fond, il est essentiel que la zone entourant chaque bande d’ARN mesurée soit identique. Pour cette raison, il est préférable d’utiliser la même zone de modèle pour délimiter chaque bande d’ARN.
  3. Ouvrez le Gestionnaire de retour sur investissement sous «Outils» et marquez la position de la zone de modèle en cliquant sur «Ajouter».
    REMARQUE : Les programmes Quantitation peuvent également dessiner des cases en suivant automatiquement le manuel d’utilisation du logiciel.
  4. À l’aide du bouton gauche de la souris, cliquez et faites glisser la zone de modèle vers la bande d’ARN suivante et répétez l’étape 4.3. Continuez ce processus jusqu’à ce que la position de toutes les bandes d’ARN non phosphorylé et phosphorylé dans chaque réaction aient été marquées.
  5. Mesurez la densité intégrée dans chaque case en cliquant sur «Mesure» dans le gestionnaire de retour sur investissement.
  6. Pour calculer la quantité relative d’ARN phosphorylé dans une réaction, divisez la densité intégrée de la bande d’ARN phosphorylé par la somme des densités intégrées des bandes d’ARN non phosphorylées et phosphorylées de la même réaction. Cette approche peut également être appliquée pour calculer la quantité relative d’ARN non phosphorylé.
  7. Pour visualiser l’accumulation du produit d’ARN phosphorylé et l’épuisement correspondant du substrat d’ARN non phosphorylé dans la série de concentration ATP, tracer la quantité relative d’ARN calculée à l’étape 4.6 par rapport à la concentration d’ATP.

Résultats

Un gel de dénaturage représentatif réussi d’une titration de l’ATP avec une quantité fixe de complexe Las1-Grc3 est indiqué à la figure 1. L’addition de l’enzyme a eu comme conséquence le clivage d’ARN las1-médié du substrat d’ARN de SC-ITS2, menant à un fragment défini d’ARN (ARN de C2 de 5-OH). Lors de l’ajout de l’ATP, le fragment d’ARN C2 a été phosphorylé par Grc3 PNK (ARN C2 5-P). Dans les gels de dénaturés, l’ARN p...

Discussion

Décrit est un test pour mesurer l’activité de kinase de Grc3 PNK sur les substrats nucléotides fluorescents. Ce protocole peut être appliqué pour caractériser d’autres enzymes PNK en adaptant le tampon de réaction et le substrat oligonucléotide. Par exemple, le protocole nécessite une trace d’EDTA. L’ajout d’EDTA est bénéfique pour deux raisons : premièrement, cette approche favorise le Grc3 lié au magnésium en empêchant l’enzyme de se lier à des quantités infimes de métaux contaminants dans...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à révéler.

Remerciements

Nous remercions le Dr Andrew Sikkema et Andrea Kaminski pour leur lecture critique de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par le National Institute of Health Intramural Research Program des États-Unis; US National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS; ZIA ES103247 à R.E.S) et les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC; 146626 à M.C.P).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
0.4 mm 34-well combBioRad1653848
0.4 mm spacerBioRad1653812
0.5 M EDTA ph 8.0KD MedicalRGF-3130
1M Magnesium ChlorideKD MedicalCAC-5290
1M Tris pH 8.0KD MedicalRGF-3360
40% Acrylamide/Bis Solution 29:1BioRad1610146
5M Sodium ChlorideKD MedicalRGF-3720
ammonium persulfate (APS)BioRad161-0700
ATPSigmaA2383-1G
boric acidSigmaB0394
bromophenol blue sodium saltSigmaB5525-5G
Glass PlatesThomas Scientific1188K51
Hoefer SQ3 SequencerHoeferN/A
Image J SoftwareN/AN/Ahttps://imagej.nih.gov/ij/
Labeled RNA oligonucleotidesIDTCustom Order
Pharmacia EPS 3500 Power SupplyPharmaciaN/A
Steriflip 0. 22 um FilterMillipore5FCP00525
TEMEDBioRad161-0800
tris baseSigmaTRIS-RO
Typhoon FLA 9500 gel imagerGE HealthcareN/A
Ultra Pure DEPC WaterInvitrogen750023
Ultra Pure GlycerolInvitrogen19E1056865
ureaFisher ChemicalU15-500

Références

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